エレクトロポレーションおよび化学試薬の治療のための鶏胚からの全網膜の外植片

この手順の全体的な目的は、ニワトリ胚からの網膜インプラント全体を実験的に解剖し、操作および培養することです。まず、ニワトリ胚から両眼を採取し、ペトリ皿に配置することでこれを達成します。次のステップでは、微細ピンセットを用いて強膜および色素上皮を除去します。

次に、網膜外植片全体に対し、平板円形電極を用いてプラスミドDNAのエレクトロポレーションを行います。最後に、24ウェルプレートに入れ、インキュベーター内で培養液を用いて網膜外植片をインキュベートします。

最終的に、網膜インプラント全体を固定し、凍結切片を作成し、免疫蛍光顕微鏡法で解析して網膜ニューロンを可視化します。in OVO電気手術などの既存の手法に対する本手法の主な利点は、迅速かつ容易に実施でき、再現性のある結果が得られることです。この手法は、培養後の酵素阻害剤や細胞周期を標的とする遺伝子産物などの特定の化学試薬によって神経発生がどのように影響を受けるかといった、中枢神経系発達分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。

目的の胚齢の卵をラミナーフローフード内に置き、胚の汚染を防ぐために卵殻を70% ethanolで拭きます。卵の側面を硬い表面に強く叩きつけて殻を割り、中身を100 millimeterのペトリ皿に移します。組織の乾燥を防ぐため、小さなスプーンを使用して胚を37 degrees Celsiusに予熱したPBSを含む35 millimeterのペトリ皿に転移させます。

次に、胚を脱頭し、胚組織が入った35 mmのペトリ皿を、層流クリーンベンチ内の実体顕微鏡に置きます。微細ピンセットを用いて、眼の下側にある口から切開します。切開部位から、眼全体を囲む組織を切り開きます。

次に、視神経を摘み切り、眼球を眼窩から取り出します。同一の胚から左眼と右眼の両方を回収し、それぞれをコントロール群または処置群として使用します。微細鑷子（ピンセット）を用い、小さなスプーンで眼球を、あらかじめ温めておいたPBSを入れた新しい35 millimeterのペトリ皿に移します。

強膜上の組織を含む、眼の周囲の組織をすべて除去します。次に、神経網膜を損傷しないように注意しながら、眼の背側にある色素上皮に小さな切開を入れます。その後、切開部位から色素上皮をゆっくりと裂いて開きます。

水晶体と網膜全体を硝子体に付着させたままにします。色素上皮を取り除きますが、眼の前方領域にある瞳孔周囲の毛様体および脈絡膜裂に沿った部分は除去が困難であるため、注意して作業してください。電極のスイッチを入れ、ハンバーガーおよびHamiltonステージの電圧を、ステージ20〜25の網膜の場合は15 Vに、ステージ26〜27の網膜の場合は20 Vに設定します。

次に、パルス繰り返し回数を50ミリ秒のパルス5回に設定し、パルス間隔を1秒にします。両手で電極を固定する必要があるため、床置きのフットペダルで操作可能なパルスジェネレーターを使用してください。特製のパドル型白金電極2本を、パルスジェネレーターの出力ソケットに接続します。

ここに示した電極は、0.1 mmの白金板で製作し、0.8 mmの接続線は絶縁処理を施した。プラスチックチューブを用いて、先端を切断したポリエチレン製パストゥールピペットで、網膜剥離組織全体を慎重に容器へ移す。網膜はプラスチックに付着して裂けやすいため、ピペットチップの使用は避けること。

次に、100 µL ピペットを使用して、網膜外植片の周囲にある PBS を慎重にすべて取り除きます。網膜を破裂させないよう、網膜に触れないように注意してください。希釈したプラスミド溶液を 100 µL 加え、網膜外植片全体が溶液で覆われていることを確認します。

網膜剥離片が浮き上がった場合は、ピンセットでそっと押し下げてください。ピンセット電極を用いて、レンズがveteのいずれかの側を向くように配置し、視神経をveteの底方向に向けてください。次に、組織に触れないように、陽極をレンズの前に、陰極を網膜の後ろに配置します。

フットペダルを押し込んで電流を流し、電極に気泡が発生していることを確認して、正常に放電されたかを確認します。100 µL ピペットを使用して、網膜を傷つけないように注意しながら、qve からプラスミドミックスをすべて取り除きます。プラスミドを除去した後、プラスミドミックスは3回から5回まで再利用可能です。

あらかじめ温めておいたPBSをveteに満たします。ピンセットを用いて、retinal explanをveteの壁面から慎重に剥離させます。次に、ポリエチレン製パステットピペットを使用して、retinal explan全体を、1 mLの温めた培地が入った24ウェルプレートに移します。

1ウェルにつき、網膜外植片を1つだけ培地でインキュベートします。網ymethyl外植片を、50 RPMの一定速度で回転させるロータリーシェーカーを用い、37 °C、5% CO2の条件下でインキュベートします。回転させることで、培地への曝露を最大限にし、網膜が24ウェルプレートの底面に付着するのを防ぎます。

24時間の培養後、エレクトロポレーションによって広範な網膜領域がプラスミドを取り込みレポーター遺伝子を発現したため、無傷の網膜の大部分にGFP陽性細胞が確認されました。切片作成後、網膜のACO基底部軸に沿って単一のGFP陽性細胞が容易に検出されました。網膜組織片全体を、さらに約24時間長く培養することが可能です。

培養時間は、発生の遅延、形態的な奇形、アポトーシス、そして最終的には網膜の崩壊を招く可能性があります。24時間培養した全網膜外植えの切片をリン酸化ヒストンH3で免疫染色したものがここに示されており、赤色チャンネルで表示されています。リン酸化ヒストンH3は、G2/M期の後半にある細胞を標識します。pH3陽性細胞は網膜の頂端側に認められ、これは正常な網膜の発達と一致しています。

ここで示されているように、この発達はCDK1/2阻害剤の添加によって遮断することが可能です。イメージングの4時間前に阻害剤でインキュベートしたところ、発達後の網膜におけるpH3陽性細胞数が大幅に減少しました。この手法は、新規DNAプラスミドからの報告された遺伝子発現の調査や、DNA損傷経路および細胞周期の調節因子を含む化学試薬による網膜外植片の処理に有効に活用されてきました。本手順の後、結果をさらに確認するために、in ovo 電電操作などの他の手法を実施することができます。