Name: FRETフローサイトメトリーでProteopathic播種活動の高感度検出 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 31 s
Description: 学ぶFRETフローサイトメトリーによるプロテオパシー播種活性の高感度検出法。神経変性疾患におけるタウ凝集体の定量的評価と治療介入効果の解析に応用可能です。

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このアッセイはヤンセン・ファーマシューティカルズにライセンス供与されています。

FRETは、ここで説明するフローサイトメトリーシステムを迅速かつ定量的にタウ播種活性を評価するための強力なツールです。これは、中程度の細胞培養の経験とFRETの実用的な知識を必要とし、フローサイトメトリー。このようチオフラビンTのような他の播種アッセイ、 - βシート構造に結合したときに増強された蛍光を示す - 面倒であり、純粋な、組換えタンパク質基質を必要とします。さらに、タウのためのin vitroアッセイは、播種のみ半定量的およびシード材料23,24のナノモル以下のレベルに一般的に鈍感です。フローサイトメトリーFRETしかし、組換えまたは生物学的サンプルのいずれかから播種活性の定量と絶妙に敏感な尺度を提供します。また、プロシージャの適応は、タンパク質凝集疾患の様々な検討することが有用なものにすることができます。 本明細書に記載されたプロトコルは、タウの播種に焦点を当てているが、単純な修正が必要とされるトンO proteopathic種子の別のタイプから播種アクティビティを監視することを可能に。ホームズとファーマンらが...

細胞内のタウアミロイドの蓄積がアルツハイマー病などのタウオパチーを定義します。疾患の早期段階で、病理学は、一般的に脳の別々の領域に局在しているが、疾患の進行と、病理学は、常に明確なニューラルネットワーク1-5に沿って広がります。証拠の蓄積は毒性タンパク質凝集体の細胞間伝播が（6-10のレビュー）この病理学の根底を示唆しています。このモデルでは、proteopathic種子（ 例えば 、タウ）は、テンプレートコンホメーション変化を経て11月15日ミスフォールド形式にネイティブタウタンパク質を変換する、ドナー細胞から放出され、隣接するセルを入力されています。ここに記載のアッセイは敏感にそのようなシーディング活性を検出するために開発されました。これは、組換えタンパク質および生物学的サンプルと互換性があり、proteopathic播種アクティビティ16の微小レベルの定量を可能にします。 安定タウ繰り返しdを表現するHEK 293T細胞CFPまたはYFPのいずれかに融合された疾患関連P301Sの突然変異を含むomain（RD）は、播種活性の安定したバイオセンサーとして機能する（以下、タウ-RD-CFP / YFP細胞と呼ばれます）。 proteopathic種子の非存在下では、細胞は、可溶性単量体としてタウを維持し、感知できるバックグラウンドFRETがありません。細胞への自発的な取り込みまたはタウ種のリポソーム媒介形質導入、しかし、フローサイトメトリーを介して、単一の細胞内で測定されるFRETシグナルを生成RD-CFPとRD-YFPの集約、で結果。 このアッセイの多数の構成要素は、感度を高め、ばらつきを低減するように設計されました。 1を有するモノクローナル細胞株：それは最適な信号を提供するよう1 RD-CFP / YFP発現率は、選択された：ノイズを。感度を高めるために、リン脂質は、直接細胞内に種子を導入するために使用された（取り込みの生物学的機構を研究するが、これを省略することができます）。最後に、フローサイトメトリーモニタは集団レベル、単一細胞にFRET<html>レベル、他のタンパク質凝集アッセイとは異なり。最終アウトカム指標、統合されたFRET密度は、高度に定量的であり、両方の集合を有する細胞の数、及び凝集は、各セル内で発生した程度を占めます。これらの最適化されたパラメータのすべては、感度を向上させ、再現性を確保します。 このシステムは、最近、他の一般的に使用されるタウ病理学的マーカー （例えば、MC1、AT8、PG5、およびチオフラビンS）にタウ播種活動の相対的な時間的な発症と進行を評価するトランスジェニックマウスP301Sタウオパチー17に包括的な研究で用いました。シーディング活性は、少なくとも6週間の組織学的検出の前に、これまでで評価しタウ病理の初期の、最も堅牢なマーカーです。種まき活動が発症および/ ​​または神経変性16の進行におけるproteopathic種子の因果的役割を示唆し、年齢とともに徐々に1.5ヶ月と増加に表示されます。 e_content &quot;&gt;生物学的サンプルからのシード材料の微細なレベルの正確な定量化は、初期の疾患の進行をモニターする研究を容易にすることができる試験の期間を短縮し、より若い動物の使用を可能にすることで、これは前臨床動物試験の効率及び精度を高めることができる。例えば、でP301Sマウス先に述べた、鉛化合物は、初期の4〜6週間ほどお届けすることができ、2〜4週間後に有効性について監視。アッセイが正確に播種内の任意の削減を定量化する必要があります（または播種活動の開始時の直前に）アクティビティ。フローサイトメトリーFRETは、同様にインビトロスクリーニングの用途を有する。例えば、抗タウ試薬（ 例えば、抗体 、小分子など ）、組換えタウを使用して、培養物中に直接播種誘導をブロックする能力について迅速に試験することができますシード源（ 図5）。このセットアップでは、シード材料を準備したら、元のような凝集体または脳由来の溶解物perimentは、データ分析など、完了するまでにわずか3日かかります。 proteopathic播種活動の急速な定量化は、このように神経変性の多くの研究を容易にすることができます。

<table><tbody><tr><td>TBS</td><td>Sigma</td><td>T5912</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete Protease Inhibitors (EDTA-free)</td><td>Roche</td><td>4693159001</td><td></td></tr><tr><td>Cryo-vials</td><td>Sarstedt</td><td>72.694.006</td><td></td></tr><tr><td>Analytical Balance</td><td>Mettler Toledo</td><td>XSE 105DU</td><td></td></tr><tr><td>Weighing</td><td>Boats Fisher Scientific</td><td>13-735-743</td><td></td></tr><tr><td>15 ml コニカルチューブ</td><td>USAサイエンティフィック</td><td>1475-0501</td><td></td></tr><tr><td>オムニソニックラプター 超音波ホモジナイザー</td><td>オムニインターナショナル</td><td>18-000-115</td><td></td></tr><tr><td>超音波ホモジナイザー用マイクロチップ</td><td>オムニインターナショナル</td><td>OR-T-156</td><td></td></tr><tr><td>2-プロパノール</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>A451</td><td></td></tr><tr><td>ノイズキャンセリングイヤーマフ</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>19-145-412</td><td></td></tr><tr><td>キワイプ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>S47299</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mlチューブUSA</td><td>Scientific</td><td><a href="http://www.usascientific.com/Seal-Rite-1.5-ml-tube-sterile.aspx">1615-5510</a></td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge&nbsp;</td><td>エッペンドルフ</td><td>5424 000.215</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-136</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11965-084</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>HyClone</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン-</td><td>EDTAの生命技術</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>50のml円錐管フェ</td><td>ニックスの研究</td><td>SS-PH15</td><td></td></tr><tr><td>25のmlの試薬resevoirs</td><td>VWR</td><td>41428-954</td><td></td></tr><tr><td>多チャンネルのピペット</td><td>フィッシャー科学</td><td>TI13-690-049</td><td></td></tr><tr><td>96の井戸の平底版</td><td>コーニング</td><td>3603</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>の生命技術</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>リポフェクタミン 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>96 ウェル丸底板</td><td>コーニング</td><td>3788</td><td></td></tr><tr><td>16% パラホルムアルデヒド</td><td>電子顕微鏡 科学</td><td>RT 15710</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>P5493</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>ED2SS</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Life Technologies</td><td>14185-052</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall ST 40 遠心分離機</td><td>Thermo Scientific</td><td>75004509</td><td></td></tr><tr><td>BIOLiner スイングバケットローター</td><td>Thermo Scientific</td><td>75003796</td><td></td></tr><tr><td>血球計算計</td><td>VWR</td><td>15170-172</td><td></td></tr><tr><td>MACSQuant VYB Flow Cytomter</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-116</td><td></td></tr><tr><td>Chill 96 Rack</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-459</td><td></td></tr><tr><td>Flow Jo 解析ソフト</td><td>Flow Jo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>20 &mu;l ピペットチップ</td><td>レイニン</td><td>GPS-L10</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu;l ピペットチップ</td><td>レイニン</td><td>GPS-250</td><td></td></tr><tr><td>1 ml ピペットチップ</td><td>レイニン</td><td>GPS-1000</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu;lピペットチップ</td><td>USAサイエンティフィック</td><td>1111-1800</td><td></td></tr><tr><td>5 ml血清ピペット</td>フェ<td>ニックス研究</td><td>SPG-606180</td><td></td></tr><tr><td>10 ml血清ピペット</td>フェ<td>ニックス研究</td><td>SPG-607180</td><td></td></tr><tr><td>25 ml血清ピペット</td><td>フェニックス研究</td><td>SPG-760180</td><td></td></tr></tbody></table>

fretフローサイトメトリーでproteopathic播種活動の高感度検出

Sensitive Detection of Proteopathic Seeding Activity with FRET Flow Cytometry

アルツハイマー病や関連するタウオパチーを含むいくつかの神経変性疾患における病理の開始と進行のメカニズムとして、有毒なタンパク質凝集体、またはプロテオパシー種子の細胞内増殖を支持する証拠が増えています。疾患の進行におけるタウシードの潜在的に重要な役割は、生物学的サンプル中の播種活性を容易に検出する高感度アッセイの必要性を強く支持しています。 
蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)の特異性、フローサイトメトリーの感度、モノクローナル細胞株の安定性を組み合わせることにより、超高感度の播種アッセイが考案され、ヒトやマウスの脳ホモジネートを含む組換えまたは生物学的サンプルからのシード検出に適合します。このアッセイでは、疾患に関連するP301S変異がCFPまたはYFPに融合したタウの凝集しやすいリピートドメイン(RD)を安定して発現するモノクローナルHEK 293T細胞を使用し、タンパク質の凝集時にFRETシグナルを産生します。プロテオパシータウシード(他のタンパク質ではない)のバイオセンサー細胞への取り込みは、RD-CFPおよびRD-YFPの凝集を刺激し、フローサイトメトリーはこの凝集誘導FRETを高感度かつ定量的にモニターします。このアッセイは、組換えタウシードのフェムトモル濃度(モノマー相当)を検出し、3桁のダイナミックレンジを持ち、タウオパチートランスジェニックマウスおよびヒトタウオパチー被験者の脳ホモジネートに適合します。わずかな変更を加えるだけで、このアッセイは、α-シヌクレインなどの他のプロテオパシー種子の播種活性も検出でき、初代ニューロン培養物とも適合します。FRETフローサイトメトリーの容易さ、感度、および幅広い適用性により、幅広いタンパク質凝集障害の研究に役立ちます。

FRETフローサイトメトリー敏感、定量、および組換えまたは生物学的サンプルからの播種活動の迅速な検出を可能にします。アッセイセットアップが容易である：タウ- RD-CFP / YFPを発現しているモノクローナル由来の安定な細胞株は、24〜48時間インキュベートし、シード材料を用いて形質導入し、分析（ 図1A）、フローサイトメトリーに供しています。種子の不在下では、バイオセンサセルは、可溶性、モノマー形態（ 図1B）でタウを維持します。シードの存在下で、しかしながら、バイオセンサ細胞はフローサイトメトリーを用いてセル単位で検出されたFRET応答を生成し、凝集状態（ 図1C）にτを変えます。定量的評価は、バイオセンサセルは、シード材料のフェムトモル濃度に応答し、そのシード活動が効果的に3桁の大きさ（ 図1D）にわたって測定することができることを示しています。 ゲーティングパラメータは、TRの検出を確実にするために確立されましたUEは、低シード濃度で、...

タンパク質凝集体の細胞間移動、またはプロテオパシーシードは、神経変性疾患の病理進行の根底にある可能性があります。ここでは、組換えサンプルまたは生物学的サンプルからの播種活性を特異的かつ高感度に検出することを可能にする新しいFRETフローサイトメトリーアッセイについて説明します。

FRETフローサイトメトリーでProteopathic播種活動の高感度検出

Increasing evidence supports transcellular propagation of toxic protein aggregates, or proteopathic seeds, as a mechanism for the initiation and ...

本手順の全体的な目的は、組換えまたは生物学的ソースからのプロチオパシック・シーディング活性を検出することであり、これにより、サンプル中のタンパク質および凝集体の高感度な検出が可能になります。この手法は、神経変性疾患の分野における重要な疑問への回答に寄与します。例えば、疾患動物モデルにおいて、治療的介入後のシーディング活性の変化をどのように定量的に評価できるか、といった点に役立ちます。この手法の利点には、低濃度のタンパク質凝集物に対する高い特異性が含まれます。また、極めて高い特異性、操作の簡便さ、およびハイスループットであることも特徴です。本日は、私と共著者のBrandon Holmesがこの手順について実演します。生物学的シード材料を調製するために、まず凍結した脳組織を使い捨てのウェイボートで計量します。次に、組織をコニカルチューブに移し、最終溶液が10% w/vになるように氷冷したホモジナイズ緩衝液を加え、サンプルを氷上に載せて低温室に移動させます。次に、プローブのインジケーターを適切な設定に調整し、プローブの側面と底面をすすぎます。指示に従い、インジケーターチップを3回洗浄し、各溶液の間でプローブを拭き取ります。プローブの準備が整ったら、チップを1つのサンプルのホモジナイズバッファーに浸し、合計25回のパルスを照射してソニケーションを開始します。組織が完全に懸濁したら、ホモジネートを遠心分離し、上清を新しいチューブに移します。口蓋を傷つけないように注意します。他の多くの均質化技術が利用可能ですが、プロベーションは生物学的標本から少量のプロティオパシック種子を単離するのに適しています。機械的な解離により、組織の一定かつ効率的な分解と、その後の種子の抽出が可能になります。次に、上清を分注し、ライセートを-80°Cで保存します。バイオセンサー細胞を無菌条件下で回収するため、各細胞株を温めたPBSで洗浄し、続いてtrypsin EDTAで3分間インキュベートします。細胞が剥離したら、温めた培地を加えて反応を停止させ、直ちに細胞をコニカルチューブに移します。細胞懸濁液を遠心分離し、ペレットを新鮮な培地で再懸濁します。次に、細胞数をカウントし、培地13 mLあたり3,500,000個の細胞となるようにマスターミックスの細胞希釈液を作成します。マルチチャンネルピペットを使用して、細胞懸濁液130 µLを、組織培養処理済みフラットボトム96ウェルプレートの各ウェルに、ピペットチップがプレートの底に触れないよう注意しながら、ウェルの中央にゆっくりと分注します。細胞を播種した後、室温で10分間静置して細胞を落ち着かせ、その後、37 °C、5% 二酸化炭素、相対湿度 80% 以上の条件下でプレートを一晩インキュベートします。翌日、バイオセンサー細胞が60～65% コンフルエン

sensitive-detection-proteopathic-seeding-activity-with-fret-flow

Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

IP - FCM法は、遺伝子工学や大規模なサンプルサイズを必要とせず、天然のタンパク質 -...

IP - FCM：フローサイトメトリーにより検出免疫沈降

このビデオは、in vivoアジュバント誘導性細胞傷害性Tリンパ球またはCTL産生をモニターする免疫学的方法を示しています。マウスに、遺伝子操作された増殖性色素染色ドナーCD8+ Tリンパ球を事前に注射します。オボアルブミンにアジュバントを皮下注射すると、細胞傷害性CD8+...

アジュバント媒介性細胞傷害性Tリンパ球の生成をモニターする免疫学的手法

このビデオは、生物学的サンプルから単離されたタンパク質凝集体の播種活性を検出するための蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)フローサイトメトリーアッセイを示しています。タウレポータータンパク質を発現する哺乳類細胞を、タウシードを含むリポソーム形質導入複合体とインキュベートします。これらのシードはレポータータンパク質の凝集を媒介し、フローサイトメーターでFRET陽性シグナルを生成します。...

タウシード誘導レポータータンパク質凝集を検出するためのFRETフローサイトメトリー技術

ここで説明するフローサイトメトリーによりげっ歯類組織分析から単離されたミトコンドリアの免疫標識によってミトコンドリア外膜タンパク質を検出および定量するための方法である。この方法は、ミトコンドリア亜​​集団の機能的側面を評価するために拡張することができる。...

単離されたミトコンドリアのフローサイトメトリーによる外膜タンパク質の免疫検出

多くの異なる方法は、フローサイトメトリー（FCM）を使用して、細胞外小胞（電気自動車）の測定のために存在する。使用する最も適切な方法を決定する際にいくつかの側面を考慮すべきである。電気自動車を測定するための2つのプロトコルは、個々の検出またはビーズベースのアプローチのいずれかを使用して、提示されている。...

フローサイトメトリーを用いて細胞外小胞の分析のための技術

浸潤しているマクロファージは、循環前駆細胞から成体組織に継続的に動員されるが、常在マクロファージは発達中に組織を播種し、前駆細胞からのさらなる入力なしに維持される。常在マクロファージの前駆細胞は最近同定された。ここでは、常在性マクロファージ前駆細胞の遺伝子運命マッピングのための方法を提示する。...

フローサイトメトリーによるマウス胚における赤血球系前駆細胞およびその子孫の同定

本稿では、S.セレビシエ細胞とHEK293T細胞の両方でタンパク質自己集合を定量するFRETベースのフローサイトメトリープロトコルについて説明する。...

フローサイトメトリーによる生体内におけるタンパク質自己集合体の検出と特性特性

抗がんアプタマー開発に必要なステップは、標的への結合をテストすることです。この結合を研究するためのフローサイトメトリーベースのアッセイを実証し、ネガティブコントロールのアプタマーとその特定のタンパク質に対して陽性または陰性の癌細胞を含めることの重要性を強調しています。...

抗がんアプタマーの選択性と特異性を評価するためのフローサイトメトリーベースの細胞表面タンパク質結合アッセイ

このプロトコルは人間の好中球のβ2インテグリンの活発化を禁じる低分子薬剤を識別するために流れのcytometryベースの、ハイスループットのスクリーニング方法を記述する。...

インテグリン阻害薬スクリーニングのためのフローサイトメトリーベースのハイスループット技術

ここでは、マウスに異種移植され、骨髄穿刺から得られた急性ヒト骨髄性白血病細胞におけるmTORC1、JAK/STAT5、およびMAPK経路の下流のシグナル伝達を分析するためのリン酸化流サイトメトリーベースの方法について説明します。p-STAT5、p-4EBP1、p-RPS6、p-ERK1/2の各レベルを、高感度の次世代スペクトルフローサイトメーターを用いて同時に測定します。...

急性骨髄性白血病患者由来異種移植の細胞内リン酸化流サイトメトリー

学ぶFRETフローサイトメトリーによるプロテオパシー播種活性の高感度検出法。神経変性疾患におけるタウ凝集体の定量的評価と治療介入効果の解析に応用可能です。

FRETフローサイトメトリーでProteopathic播種活動の高感度検出

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