Name: FRETフローサイトメトリーでProteopathic播種活動の高感度検出 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 31 s
Description: 学ぶFRETフローサイトメトリーによるプロテオパシー播種活性の高感度検出法。神経変性疾患におけるタウ凝集体の定量的評価と治療介入効果の解析に応用可能です。

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この作業はTau Consortium (M.I.D)の支援を受けました。National Institutes of Health Grant 1R01NS071835 (M.I.D.)、国防総省の助成金 PT110816 (M.I.D.へ)、1F32NS087805 (J.L.F.へ)、1F31NS079039 (B.B.H. へ)。

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</ol>

このアッセイはヤンセン・ファーマシューティカルズにライセンス供与されています。

FRETは、ここで説明するフローサイトメトリーシステムを迅速かつ定量的にタウ播種活性を評価するための強力なツールです。これは、中程度の細胞培養の経験とFRETの実用的な知識を必要とし、フローサイトメトリー。このようチオフラビンTのような他の播種アッセイ、 - βシート構造に結合したときに増強された蛍光を示す - 面倒であり、純粋な、組換えタンパク質基質を必要とします。さらに、タウのためのin vitroアッセイは、播種のみ半定量的およびシード材料23,24のナノモル以下のレベルに一般的に鈍感です。フローサイトメトリーFRETしかし、組換えまたは生物学的サンプルのいずれかから播種活性の定量と絶妙に敏感な尺度を提供します。また、プロシージャの適応は、タンパク質凝集疾患の様々な検討することが有用なものにすることができます。 本明細書に記載されたプロトコルは、タウの播種に焦点を当てているが、単純な修正が必要とされるトンO proteopathic種子の別のタイプから播種アクティビティを監視することを可能に。ホームズとファーマンらが...

細胞内のタウアミロイドの蓄積がアルツハイマー病などのタウオパチーを定義します。疾患の早期段階で、病理学は、一般的に脳の別々の領域に局在しているが、疾患の進行と、病理学は、常に明確なニューラルネットワーク1-5に沿って広がります。証拠の蓄積は毒性タンパク質凝集体の細胞間伝播が（6-10のレビュー）この病理学の根底を示唆しています。このモデルでは、proteopathic種子（ 例えば 、タウ）は、テンプレートコンホメーション変化を経て11月15日ミスフォールド形式にネイティブタウタンパク質を変換する、ドナー細胞から放出され、隣接するセルを入力されています。ここに記載のアッセイは敏感にそのようなシーディング活性を検出するために開発されました。これは、組換えタンパク質および生物学的サンプルと互換性があり、proteopathic播種アクティビティ16の微小レベルの定量を可能にします。 安定タウ繰り返しdを表現するHEK 293T細胞CFPまたはYFPのいずれかに融合された疾患関連P301Sの突然変異を含むomain（RD）は、播種活性の安定したバイオセンサーとして機能する（以下、タウ-RD-CFP / YFP細胞と呼ばれます）。 proteopathic種子の非存在下では、細胞は、可溶性単量体としてタウを維持し、感知できるバックグラウンドFRETがありません。細胞への自発的な取り込みまたはタウ種のリポソーム媒介形質導入、しかし、フローサイトメトリーを介して、単一の細胞内で測定されるFRETシグナルを生成RD-CFPとRD-YFPの集約、で結果。 このアッセイの多数の構成要素は、感度を高め、ばらつきを低減するように設計されました。 1を有するモノクローナル細胞株：それは最適な信号を提供するよう1 RD-CFP / YFP発現率は、選択された：ノイズを。感度を高めるために、リン脂質は、直接細胞内に種子を導入するために使用された（取り込みの生物学的機構を研究するが、これを省略することができます）。最後に、フローサイトメトリーモニタは集団レベル、単一細胞にFRET<html>レベル、他のタンパク質凝集アッセイとは異なり。最終アウトカム指標、統合されたFRET密度は、高度に定量的であり、両方の集合を有する細胞の数、及び凝集は、各セル内で発生した程度を占めます。これらの最適化されたパラメータのすべては、感度を向上させ、再現性を確保します。 このシステムは、最近、他の一般的に使用されるタウ病理学的マーカー （例えば、MC1、AT8、PG5、およびチオフラビンS）にタウ播種活動の相対的な時間的な発症と進行を評価するトランスジェニックマウスP301Sタウオパチー17に包括的な研究で用いました。シーディング活性は、少なくとも6週間の組織学的検出の前に、これまでで評価しタウ病理の初期の、最も堅牢なマーカーです。種まき活動が発症および/ ​​または神経変性16の進行におけるproteopathic種子の因果的役割を示唆し、年齢とともに徐々に1.5ヶ月と増加に表示されます。 e_content &quot;&gt;生物学的サンプルからのシード材料の微細なレベルの正確な定量化は、初期の疾患の進行をモニターする研究を容易にすることができる試験の期間を短縮し、より若い動物の使用を可能にすることで、これは前臨床動物試験の効率及び精度を高めることができる。例えば、でP301Sマウス先に述べた、鉛化合物は、初期の4〜6週間ほどお届けすることができ、2〜4週間後に有効性について監視。アッセイが正確に播種内の任意の削減を定量化する必要があります（または播種活動の開始時の直前に）アクティビティ。フローサイトメトリーFRETは、同様にインビトロスクリーニングの用途を有する。例えば、抗タウ試薬（ 例えば、抗体 、小分子など ）、組換えタウを使用して、培養物中に直接播種誘導をブロックする能力について迅速に試験することができますシード源（ 図5）。このセットアップでは、シード材料を準備したら、元のような凝集体または脳由来の溶解物perimentは、データ分析など、完了するまでにわずか3日かかります。 proteopathic播種活動の急速な定量化は、このように神経変性の多くの研究を容易にすることができます。

<table><tbody><tr><td>TBS</td><td>Sigma</td><td>T5912</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete Protease Inhibitors (EDTA-free)</td><td>Roche</td><td>4693159001</td><td></td></tr><tr><td>Cryo-vials</td><td>Sarstedt</td><td>72.694.006</td><td></td></tr><tr><td>Analytical Balance</td><td>Mettler Toledo</td><td>XSE 105DU</td><td></td></tr><tr><td>Weighing</td><td>Boats Fisher Scientific</td><td>13-735-743</td><td></td></tr><tr><td>15 ml コニカルチューブ</td><td>USAサイエンティフィック</td><td>1475-0501</td><td></td></tr><tr><td>オムニソニックラプター 超音波ホモジナイザー</td><td>オムニインターナショナル</td><td>18-000-115</td><td></td></tr><tr><td>超音波ホモジナイザー用マイクロチップ</td><td>オムニインターナショナル</td><td>OR-T-156</td><td></td></tr><tr><td>2-プロパノール</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>A451</td><td></td></tr><tr><td>ノイズキャンセリングイヤーマフ</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>19-145-412</td><td></td></tr><tr><td>キワイプ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>S47299</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mlチューブUSA</td><td>Scientific</td><td><a href="http://www.usascientific.com/Seal-Rite-1.5-ml-tube-sterile.aspx">1615-5510</a></td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge&nbsp;</td><td>エッペンドルフ</td><td>5424 000.215</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-136</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11965-084</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>HyClone</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン-</td><td>EDTAの生命技術</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>50のml円錐管フェ</td><td>ニックスの研究</td><td>SS-PH15</td><td></td></tr><tr><td>25のmlの試薬resevoirs</td><td>VWR</td><td>41428-954</td><td></td></tr><tr><td>多チャンネルのピペット</td><td>フィッシャー科学</td><td>TI13-690-049</td><td></td></tr><tr><td>96の井戸の平底版</td><td>コーニング</td><td>3603</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>の生命技術</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>リポフェクタミン 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>96 ウェル丸底板</td><td>コーニング</td><td>3788</td><td></td></tr><tr><td>16% パラホルムアルデヒド</td><td>電子顕微鏡 科学</td><td>RT 15710</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>P5493</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>ED2SS</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Life Technologies</td><td>14185-052</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall ST 40 遠心分離機</td><td>Thermo Scientific</td><td>75004509</td><td></td></tr><tr><td>BIOLiner スイングバケットローター</td><td>Thermo Scientific</td><td>75003796</td><td></td></tr><tr><td>血球計算計</td><td>VWR</td><td>15170-172</td><td></td></tr><tr><td>MACSQuant VYB Flow Cytomter</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-116</td><td></td></tr><tr><td>Chill 96 Rack</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-459</td><td></td></tr><tr><td>Flow Jo 解析ソフト</td><td>Flow Jo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>20 &mu;l ピペットチップ</td><td>レイニン</td><td>GPS-L10</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu;l ピペットチップ</td><td>レイニン</td><td>GPS-250</td><td></td></tr><tr><td>1 ml ピペットチップ</td><td>レイニン</td><td>GPS-1000</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu;lピペットチップ</td><td>USAサイエンティフィック</td><td>1111-1800</td><td></td></tr><tr><td>5 ml血清ピペット</td>フェ<td>ニックス研究</td><td>SPG-606180</td><td></td></tr><tr><td>10 ml血清ピペット</td>フェ<td>ニックス研究</td><td>SPG-607180</td><td></td></tr><tr><td>25 ml血清ピペット</td><td>フェニックス研究</td><td>SPG-760180</td><td></td></tr></tbody></table>

fretフローサイトメトリーでproteopathic播種活動の高感度検出

Sensitive Detection of Proteopathic Seeding Activity with FRET Flow Cytometry

アルツハイマー病や関連するタウオパチーを含むいくつかの神経変性疾患における病理の開始と進行のメカニズムとして、有毒なタンパク質凝集体、またはプロテオパシー種子の細胞内増殖を支持する証拠が増えています。疾患の進行におけるタウシードの潜在的に重要な役割は、生物学的サンプル中の播種活性を容易に検出する高感度アッセイの必要性を強く支持しています。 
蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)の特異性、フローサイトメトリーの感度、モノクローナル細胞株の安定性を組み合わせることにより、超高感度の播種アッセイが考案され、ヒトやマウスの脳ホモジネートを含む組換えまたは生物学的サンプルからのシード検出に適合します。このアッセイでは、疾患に関連するP301S変異がCFPまたはYFPに融合したタウの凝集しやすいリピートドメイン(RD)を安定して発現するモノクローナルHEK 293T細胞を使用し、タンパク質の凝集時にFRETシグナルを産生します。プロテオパシータウシード(他のタンパク質ではない)のバイオセンサー細胞への取り込みは、RD-CFPおよびRD-YFPの凝集を刺激し、フローサイトメトリーはこの凝集誘導FRETを高感度かつ定量的にモニターします。このアッセイは、組換えタウシードのフェムトモル濃度(モノマー相当)を検出し、3桁のダイナミックレンジを持ち、タウオパチートランスジェニックマウスおよびヒトタウオパチー被験者の脳ホモジネートに適合します。わずかな変更を加えるだけで、このアッセイは、α-シヌクレインなどの他のプロテオパシー種子の播種活性も検出でき、初代ニューロン培養物とも適合します。FRETフローサイトメトリーの容易さ、感度、および幅広い適用性により、幅広いタンパク質凝集障害の研究に役立ちます。

FRETフローサイトメトリー敏感、定量、および組換えまたは生物学的サンプルからの播種活動の迅速な検出を可能にします。アッセイセットアップが容易である：タウ- RD-CFP / YFPを発現しているモノクローナル由来の安定な細胞株は、24〜48時間インキュベートし、シード材料を用いて形質導入し、分析（ 図1A）、フローサイトメトリーに供しています。種子の不在下では、バイオセンサセルは、可溶性、モノマー形態（ 図1B）でタウを維持します。シードの存在下で、しかしながら、バイオセンサ細胞はフローサイトメトリーを用いてセル単位で検出されたFRET応答を生成し、凝集状態（ 図1C）にτを変えます。定量的評価は、バイオセンサセルは、シード材料のフェムトモル濃度に応答し、そのシード活動が効果的に3桁の大きさ（ 図1D）にわたって測定することができることを示しています。 ゲーティングパラメータは、TRの検出を確実にするために確立されましたUEは、低シード濃度で、...

タンパク質凝集体の細胞間移動、またはプロテオパシーシードは、神経変性疾患の病理進行の根底にある可能性があります。ここでは、組換えサンプルまたは生物学的サンプルからの播種活性を特異的かつ高感度に検出することを可能にする新しいFRETフローサイトメトリーアッセイについて説明します。

FRETフローサイトメトリーでProteopathic播種活動の高感度検出

Increasing evidence supports transcellular propagation of toxic protein aggregates, or proteopathic seeds, as a mechanism for the initiation and ...

本手順の全体的な目的は、組換えまたは生物学的ソースからのプロチオパシック・シーディング活性を検出することであり、これにより、サンプル中のタンパク質および凝集体の高感度な検出が可能になります。この手法は、神経変性疾患の分野における重要な疑問への回答に寄与します。例えば、疾患動物モデルにおいて、治療的介入後のシーディング活性の変化をどのように定量的に評価できるか、といった点に役立ちます。この手法の利点には、低濃度のタンパク質凝集物に対する高い特異性が含まれます。また、極めて高い特異性、操作の簡便さ、およびハイスループットであることも特徴です。本日は、私と共著者のBrandon Holmesがこの手順について実演します。生物学的シード材料を調製するために、まず凍結した脳組織を使い捨てのウェイボートで計量します。次に、組織をコニカルチューブに移し、最終溶液が10% w/vになるように氷冷したホモジナイズ緩衝液を加え、サンプルを氷上に載せて低温室に移動させます。次に、プローブのインジケーターを適切な設定に調整し、プローブの側面と底面をすすぎます。指示に従い、インジケーターチップを3回洗浄し、各溶液の間でプローブを拭き取ります。プローブの準備が整ったら、チップを1つのサンプルのホモジナイズバッファーに浸し、合計25回のパルスを照射してソニケーションを開始します。組織が完全に懸濁したら、ホモジネートを遠心分離し、上清を新しいチューブに移します。口蓋を傷つけないように注意します。他の多くの均質化技術が利用可能ですが、プロベーションは生物学的標本から少量のプロティオパシック種子を単離するのに適しています。機械的な解離により、組織の一定かつ効率的な分解と、その後の種子の抽出が可能になります。次に、上清を分注し、ライセートを-80°Cで保存します。バイオセンサー細胞を無菌条件下で回収するため、各細胞株を温めたPBSで洗浄し、続いてtrypsin EDTAで3分間インキュベートします。細胞が剥離したら、温めた培地を加えて反応を停止させ、直ちに細胞をコニカルチューブに移します。細胞懸濁液を遠心分離し、ペレットを新鮮な培地で再懸濁します。次に、細胞数をカウントし、培地13 mLあたり3,500,000個の細胞となるようにマスターミックスの細胞希釈液を作成します。マルチチャンネルピペットを使用して、細胞懸濁液130 µLを、組織培養処理済みフラットボトム96ウェルプレートの各ウェルに、ピペットチップがプレートの底に触れないよう注意しながら、ウェルの中央にゆっくりと分注します。細胞を播種した後、室温で10分間静置して細胞を落ち着かせ、その後、37 °C、5% 二酸化炭素、相対湿度 80% 以上の条件下でプレートを一晩インキュベートします。翌日、バイオセンサー細胞が60～65% コンフルエントになったら、低血清培地、リポソーム試薬、および生物学的シードソースを混合して導入複合体を作製します。次に、導入複合体を20 µLずつ、各バイオセンサーウェルの壁面に沿って緩やかにピペッティングし、処理した細胞をさらに24～48時間インキュベーターに戻してから回収します。未処理の細胞では、拡散した蛍光のみが観察されます。一方、tauシード物質で処理した細胞では、明るい凝集塊が観察されます。1〜2日後、細胞を回収するために、細胞培養液を50 µLのtrypsin EDTAに置き換え、反応を停止させます。冷やした培養液150 µLを加えて5分間置いた後、直ちに細胞を96ウェル丸底プレートに移して細胞をペレット化し、ペレットを乱さないように上清を吸引除去します。その後、細胞を50 µLの2%パラアルデヒドに緩やかに、かつ十分に再懸濁し、10分間静置します。その後、細胞を再び遠心分離し、速やかに200 µLの冷却したフローサイトメトリーバッファーでペレットを再懸濁します。固定後、プレートをfret対応のフローサイトメーターにセットし、バリアントプロットを用いてサイドスキャッター面積（SSC-A）対フォワードスキャッター面積（FSC-A）を表示させます。次に、細胞ライン1を流しながら、細胞集団が左下のクアドラントに収まるまでサイドスキャッターおよびフォワードスキャッターの電圧を調整します。次にポリゴンツールを使用して、細胞集団をゲート P1 として定義します。次に、前方散乱光（FSC）の高さ（height）対面積（area）のバイバリアントプロットを作成し、P1 ゲートを適用します。続いて、シングルセルをゲート P2 として定義し、それぞれ1つのヒストグラムを生成します。C-F-P-Y-F-Pおよびfretフィルターについて、補正を行うために、C-F-P-Y-F-P用とfret用それぞれ1つずつ、計2〜3つの異なるヒストグラムにゲートPを適用します。細胞株1懸濁液30 µLを細胞株2懸濁液200 µLに添加します。次に、インストゥルメント設定アイコンをクリックし、続いて補正タブを選択して、「matrix」にチェックを入れて補正テーブルを開きます。FRET領域対CFP領域の変量プロットを生成し、ゲートP2を適用します。次に、細胞株1と細胞株2を実行した状態で、クアドラントアイコンをクリックし、蛍光陰性集団と陽性集団が下の2つのクアドラントで分かれるようにクアドラントを描画します。ここで、LL3およびLR3ゲートのFRETの平均蛍光強度（MFI）を表示する統計テーブルを作成し、LL3とLR3の間でFRET信号のMFIがほぼ等しくなるまで、コンペンセーションマトリックスでFRETパラメータを調整します。次に、四分位プロットを用いて、YFP面積対CFP面積の散布図を作成します。各四分位間でのYFP信号のMFIがほぼ等しくなるまで、補正マトリックスのYFPパラメータを調整してください。これは、前述のFRETフローサイトメトリーで示した手順と同様です。主要な蛍光スピルオーバーは、CFPがFRET検出チャンネルに放出されることで発生しますが、これは単色ポジティブコントロール細胞を用いた蛍光補正によって修正可能です。すべてのゲートを設定し、CFP信号の補正が完了したら、目的のウェルを選択し、プレートの残りの部分を実行してデータを解析します。まず、フロー解析のセットアップ時に設定したパラメータを用いて、細胞およびシングルセルの定義を行います。次に、セルライン3を用いて、YFP単陽性細胞をFRET対YFPのバリアントプロットにプロットします。FRET陽性細胞集団の傾斜に沿って、かつそこから離れるように多角形ゲートを描き、YFPのFRETフィルターへのスピルオーバーを除外するための偽FRETゲートを定義します。すべてのサンプルに偽FRETゲートを適用した後、空リポソーム処理したCFP-YFP細胞をFRET対CFPのバリアントプロットにプロットし、集団の傾斜に沿って上方向および左方向へ集団から離れるように多角形ゲートを導入します。このゲートに移行したすべてのイベントはFRET陽性と見なされ、その細胞の割合は処理に使用したシードタイターと相関します。最後に、FRET陽性率およびFRET陽性細胞の平均蛍光強度（MFI）を含む、関心のある解析パラメータを記録します。その後、陽性率とMFIの積を算出し、統合FRET密度を手動で計算します。tau凝集塊やシードが存在しない場合、tauは溶解性のモノマー状態で維持され、それは一貫した拡散性のFRET陰性蛍光シグナルとして表されます。バイオセンサー細胞にtauシードを導入すると、内因性tauは凝集状態へと変換され、FRET定量においてFRET陽性となります。フローサイトメトリー解析の結果、フェムトモル濃度の組換えtauで検出に十分であることが確認されました。異なる月齢で屠殺したタウオパチーマウスの脳幹組織は、1.5ヶ月という早期から個体間で一貫したシーディング活性が検出される代表的な脳領域として機能します。本実験において、アルツハイマー病患者の脳ホモジネートは強力なシーディング活性を示しましたが、年齢を一致させたコントロールおよびハンチントン病患者では認められず、本アッセイがタウ凝集塊に対して特異的であることが示されました。tau-CFPおよびtau-YFPレンチウイルス構築物を導入した未処理の一次神経細胞培養にリコンビナントタウシードを添加したところ、拡散した蛍光シグナルが認められました。しかしながら、内因性tauは、リポソームを介した導入がない場合でも、FRETフローサイトメトリーで検出可能な大きな凝集体を形成します。ヘパリンなどのtau取り込みを阻害する薬剤と共にシード源を事前インキュベートし、リポソームを用いずに処理すると、組換えFISおよびtau病マウス脳サンプルの両方に含まれるシード活性を阻害することができます。習得した後は。この手法は3日間で完了でき、各日の実作業時間は1〜2時間のみです。この手順を実施する際は、特定のステップにおいて施設内での最適化が必要になることに留意してください。例えば、さまざまな生物学的ソースからのプロトパシックシード（病原性種子）の有効タイターを決定する場合などが挙げられます。このビデオを視聴することで、組換えおよび生物学的な由来のプロトパシック・シーディング活性を検出するためのFRETフローサイトメトリー実験のセットアップ、実施、および解析方法について十分に理解できるはずです。

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Bioengineering

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