FRETフローサイトメトリーでProteopathic播種活動の高感度検出

本手順の全体的な目的は、組換えまたは生物学的ソースからのプロチオパシック・シーディング活性を検出することであり、これにより、サンプル中のタンパク質および凝集体の高感度な検出が可能になります。この手法は、神経変性疾患の分野における重要な疑問への回答に寄与します。例えば、疾患動物モデルにおいて、治療的介入後のシーディング活性の変化をどのように定量的に評価できるか、といった点に役立ちます。

この手法の利点には、低濃度のタンパク質凝集物に対する高い特異性が含まれます。また、極めて高い特異性、操作の簡便さ、およびハイスループットであることも特徴です。本日は、私と共著者のBrandon Holmesがこの手順について実演します。

生物学的シード材料を調製するために、まず凍結した脳組織を使い捨てのウェイボートで計量します。次に、組織をコニカルチューブに移し、最終溶液が10% w/vになるように氷冷したホモジナイズ緩衝液を加え、サンプルを氷上に載せて低温室に移動させます。次に、プローブのインジケーターを適切な設定に調整し、プローブの側面と底面をすすぎます。

指示に従い、インジケーターチップを3回洗浄し、各溶液の間でプローブを拭き取ります。プローブの準備が整ったら、チップを1つのサンプルのホモジナイズバッファーに浸し、合計25回のパルスを照射してソニケーションを開始します。組織が完全に懸濁したら、ホモジネートを遠心分離し、上清を新しいチューブに移します。

口蓋を傷つけないように注意します。他の多くの均質化技術が利用可能ですが、プロベーションは生物学的標本から少量のプロティオパシック種子を単離するのに適しています。機械的な解離により、組織の一定かつ効率的な分解と、その後の種子の抽出が可能になります。

次に、上清を分注し、ライセートを-80°Cで保存します。バイオセンサー細胞を無菌条件下で回収するため、各細胞株を温めたPBSで洗浄し、続いてtrypsin EDTAで3分間インキュベートします。細胞が剥離したら、温めた培地を加えて反応を停止させ、直ちに細胞をコニカルチューブに移します。

細胞懸濁液を遠心分離し、ペレットを新鮮な培地で再懸濁します。次に、細胞数をカウントし、培地13 mLあたり3,500,000個の細胞となるようにマスターミックスの細胞希釈液を作成します。マルチチャンネルピペットを使用して、細胞懸濁液130 µLを、組織培養処理済みフラットボトム96ウェルプレートの各ウェルに、ピペットチップがプレートの底に触れないよう注意しながら、ウェルの中央にゆっくりと分注します。

細胞を播種した後、室温で10分間静置して細胞を落ち着かせ、その後、37 °C、5% 二酸化炭素、相対湿度 80% 以上の条件下でプレートを一晩インキュベートします。翌日、バイオセンサー細胞が60～65% コンフルエントになったら、低血清培地、リポソーム試薬、および生物学的シードソースを混合して導入複合体を作製します。次に、導入複合体を20 µLずつ、各バイオセンサーウェルの壁面に沿って緩やかにピペッティングし、処理した細胞をさらに24～48時間インキュベーターに戻してから回収します。

未処理の細胞では、拡散した蛍光のみが観察されます。一方、tauシード物質で処理した細胞では、明るい凝集塊が観察されます。1〜2日後、細胞を回収するために、細胞培養液を50 µLのtrypsin EDTAに置き換え、反応を停止させます。冷やした培養液150 µLを加えて5分間置いた後、直ちに細胞を96ウェル丸底プレートに移して細胞をペレット化し、ペレットを乱さないように上清を吸引除去します。その後、細胞を50 µLの2%パラアルデヒドに緩やかに、かつ十分に再懸濁し、10分間静置します。

その後、細胞を再び遠心分離し、速やかに200 µLの冷却したフローサイトメトリーバッファーでペレットを再懸濁します。固定後、プレートをfret対応のフローサイトメーターにセットし、バリアントプロットを用いてサイドスキャッター面積（SSC-A）対フォワードスキャッター面積（FSC-A）を表示させます。次に、細胞ライン1を流しながら、細胞集団が左下のクアドラントに収まるまでサイドスキャッターおよびフォワードスキャッターの電圧を調整します。

次にポリゴンツールを使用して、細胞集団をゲート P1 として定義します。次に、前方散乱光（FSC）の高さ（height）対面積（area）のバイバリアントプロットを作成し、P1 ゲートを適用します。続いて、シングルセルをゲート P2 として定義し、それぞれ1つのヒストグラムを生成します。

C-F-P-Y-F-Pおよびfretフィルターについて、補正を行うために、C-F-P-Y-F-P用とfret用それぞれ1つずつ、計2〜3つの異なるヒストグラムにゲートPを適用します。細胞株1懸濁液30 µLを細胞株2懸濁液200 µLに添加します。次に、インストゥルメント設定アイコンをクリックし、続いて補正タブを選択して、「matrix」にチェックを入れて補正テーブルを開きます。

FRET領域対CFP領域の変量プロットを生成し、ゲートP2を適用します。次に、細胞株1と細胞株2を実行した状態で、クアドラントアイコンをクリックし、蛍光陰性集団と陽性集団が下の2つのクアドラントで分かれるようにクアドラントを描画します。ここで、LL3およびLR3ゲートのFRETの平均蛍光強度（MFI）を表示する統計テーブルを作成し、LL3とLR3の間でFRET信号のMFIがほぼ等しくなるまで、コンペンセーションマトリックスでFRETパラメータを調整します。

次に、四分位プロットを用いて、YFP面積対CFP面積の散布図を作成します。各四分位間でのYFP信号のMFIがほぼ等しくなるまで、補正マトリックスのYFPパラメータを調整してください。これは、前述のFRETフローサイトメトリーで示した手順と同様です。

主要な蛍光スピルオーバーは、CFPがFRET検出チャンネルに放出されることで発生しますが、これは単色ポジティブコントロール細胞を用いた蛍光補正によって修正可能です。すべてのゲートを設定し、CFP信号の補正が完了したら、目的のウェルを選択し、プレートの残りの部分を実行してデータを解析します。まず、フロー解析のセットアップ時に設定したパラメータを用いて、細胞およびシングルセルの定義を行います。

次に、セルライン3を用いて、YFP単陽性細胞をFRET対YFPのバリアントプロットにプロットします。FRET陽性細胞集団の傾斜に沿って、かつそこから離れるように多角形ゲートを描き、YFPのFRETフィルターへのスピルオーバーを除外するための偽FRETゲートを定義します。すべてのサンプルに偽FRETゲートを適用した後、空リポソーム処理したCFP-YFP細胞をFRET対CFPのバリアントプロットにプロットし、集団の傾斜に沿って上方向および左方向へ集団から離れるように多角形ゲートを導入します。

このゲートに移行したすべてのイベントはFRET陽性と見なされ、その細胞の割合は処理に使用したシードタイターと相関します。最後に、FRET陽性率およびFRET陽性細胞の平均蛍光強度（MFI）を含む、関心のある解析パラメータを記録します。その後、陽性率とMFIの積を算出し、統合FRET密度を手動で計算します。

tau凝集塊やシードが存在しない場合、tauは溶解性のモノマー状態で維持され、それは一貫した拡散性のFRET陰性蛍光シグナルとして表されます。バイオセンサー細胞にtauシードを導入すると、内因性tauは凝集状態へと変換され、FRET定量においてFRET陽性となります。フローサイトメトリー解析の結果、フェムトモル濃度の組換えtauで検出に十分であることが確認されました。

異なる月齢で屠殺したタウオパチーマウスの脳幹組織は、1.5ヶ月という早期から個体間で一貫したシーディング活性が検出される代表的な脳領域として機能します。本実験において、アルツハイマー病患者の脳ホモジネートは強力なシーディング活性を示しましたが、年齢を一致させたコントロールおよびハンチントン病患者では認められず、本アッセイがタウ凝集塊に対して特異的であることが示されました。tau-CFPおよびtau-YFPレンチウイルス構築物を導入した未処理の一次神経細胞培養にリコンビナントタウシードを添加したところ、拡散した蛍光シグナルが認められました。

しかしながら、内因性tauは、リポソームを介した導入がない場合でも、FRETフローサイトメトリーで検出可能な大きな凝集体を形成します。ヘパリンなどのtau取り込みを阻害する薬剤と共にシード源を事前インキュベートし、リポソームを用いずに処理すると、組換えFISおよびtau病マウス脳サンプルの両方に含まれるシード活性を阻害することができます。習得した後は。

この手法は3日間で完了でき、各日の実作業時間は1〜2時間のみです。この手順を実施する際は、特定のステップにおいて施設内での最適化が必要になることに留意してください。例えば、さまざまな生物学的ソースからのプロトパシックシード（病原性種子）の有効タイターを決定する場合などが挙げられます。

このビデオを視聴することで、組換えおよび生物学的な由来のプロトパシック・シーディング活性を検出するためのFRETフローサイトメトリー実験のセットアップ、実施、および解析方法について十分に理解できるはずです。