FRETフローサイトメトリーでProteopathic播種活動の高感度検出

この手順の全体的な目標は、組換えまたは生物学的源からのプロチオパシーディング活性を検出し、タンパク質、凝集体、およびサンプルの高感度な検出を可能にすることです。この方法は、神経変性の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。例えば、疾患モデル動物における治療介入後の播種活性の変化を定量的に評価するにはどうすればよいか。

この技術の利点は、低レベルのタンパク質凝集体に対する高い特異性です。その絶妙な特異性、使いやすさ、そして高いスループット。今日、この手順をデモンストレーションするのは、私自身と共著者のブランドン・ホームズです。

生物学的種子材料を調製するには、使い捨てのホエイボートで凍結した脳組織の重量を量ることから始めます。次に、組織を円錐形のチューブに移し、最終溶液が10%になるように氷冷均質化緩衝液を加え、サンプルを氷上の冷蔵室に移すのを待ちます。次に、プローブを調整してインジケーターを適切な設定に戻し、プローブの脇と底をすすぎます。

したがって、インジケーターは示されているように3回傾き、各溶液の間のプローブを拭き取ります。プローブの準備ができたら、チップを1つのサンプルの均質化バッファーに浸し、合計25パルスを送達する超音波処理を開始します。組織が完全に懸濁状態になったら、ホモジネートをスピンダウンし、すくみ酸をきれいなチューブに移します。

口蓋の邪魔にならないように注意してください。他にも多くの均質化技術が利用可能ですが、生体試料から少量のプロチオ病性種子を単離するには、保護観察が優れています。機械的解離により、組織の一貫した効率的な分解とその後の種子抽出が可能になります。

次に、仰臥位を分注し、溶解物を摂氏マイナス80度で保存します。バイオセンサー細胞を無菌条件下で再生するには、各細胞株を温かいPBSですすぎ、続いてトリプシンEDTAで3分間インキュベートします。細胞が分離したら、温かい培地で反応を止め、すぐに細胞を円錐形のチューブに移します。

細胞を遠心分離し、ペレットを新鮮な培地に懸濁します。次に、細胞を数え、培地13ミリリットルあたり3,500,000個の細胞をマスターミックスセル希釈します。マルチチャンネルピペットを使用して、130マイクロリットルの細胞を平底組織培養処理済み96ウェルプレートの各ウェルにゆっくりと移し、ピペットチップをプレートの底に触れずにウェルの中央に配置するように注意します。

細胞を播種したら、室温で10分間静置し、その後、摂氏37度、二酸化炭素5%、相対湿度80%以上でプレートを一晩インキュベートします。翌日、バイオセンサー細胞が60〜65%コンフルエントになったら、還元血清中リポソーム試薬と生物学的シードソースを組み合わせて形質導入複合体を作製します。次に、20マイクロリットルの形質導入複合体を個々のバイオセンサーウェルの側面にピペットで固定し、処理した細胞をさらに24〜48時間インキュベーターに戻してから収穫します。

未処理の細胞はびまん性蛍光のみを示します。ただし、タウシード材料で処理された細胞は、細胞を収穫するために1〜2日後に明るい凝集体を示し、細胞培養培地を50マイクロリットルのtryin EDTAに交換し、反応を停止します。150マイクロリットルのチルド培養液で5分後、すぐに細胞を96ウェルの丸底板に移し、細胞をペレット化し、ペレットを乱さずにS上清を吸引し、その後、穏やかに、しかし徹底的に蘇生し、2%パラアルデヒドの50マイクロリットルで細胞を10分間懸濁します。

その後、細胞を再びスピンダウンし、できるだけ早く200マイクロリットルのチルドフローサイトメトリーバッファーにペレットを再懸濁します。固定後、プレートをフレット対応フローサイトメーターにロードし、バリアントプロットごとに側方散乱領域と前方散乱領域を生成します。次に、細胞株1を稼働させた状態で、細胞集団が左下の象限に入るまで、側方散乱電圧と前方散乱電圧を調整します。

次に、ポリゴンツールを使用して、細胞集団を歩行P 1として定義します。次に、バリアントプロットによって前方散布図の高さと前方散布図の面積を作成し、P one ゲートを適用します。次に、1 つのセルを歩行 P 2 として定義し、それぞれに 1 つのヒストグラムを生成します。

C-F-P-Y-F-Pおよびフレットフィルタの場合、ゲートPを2〜3つの異なるヒストグラムに適用し、C-F-P-Y-F-Pと補正用のフレットフィルタにそれぞれ1つずつ適用します。細胞株1懸濁液の30マイクロリットルを細胞株2懸濁液の200マイクロリットルにスパイクする。次に、機器設定アイコンをクリックし、続いて[補正]タブをクリックし、マトリックスを確認して補正テーブルを開きます。

変量プロットによってフレット面積と CFP 面積を生成し、ゲート P 2 を適用します。次に、細胞株1と細胞株2を実行した状態で、象限アイコンをクリックし、蛍光陰性集団と陽性集団が下部の2つの象限で区切られているような象限を描画します。次に、LL 3 ゲートと LR 3 ゲートのフレットの蛍光強度 (MFI) の中央値を表示する統計テーブルを作成し、フレット信号の MFI が LL 3 と LR 3 の間でほぼ等しくなるまで、補償行列のフレット パラメーターを調整します。

次に、象限を使用して、YFPエリアとCFPエリアを変量プロットで作成します。YFP 信号の MFI が象限間でほぼ等しくなるまで、補償マトリックスの YFP パラメーターを調整します。フレットフローサイトメトリーの場合、前に示したものと同様です。

一次蛍光スピルオーバーは、フレット検出チャネルに放出されたCFPから発生し、これは、単一カラーポジティブコントロールセルを用いた蛍光補償によって補正することができる。目的のウェルを強調表示し、プレートの残りの部分を実行してデータを分析します。まず、フロー解析を設定するときと同じパラメータを使用して、セルと単一セルを定義します。

次に、細胞株3を使用して、YFPの単一陽性細胞をfret対YFPのバリアント別プロットにプロットします。多角形のゲートを描画し、フレット陽性細胞集団の傾きに沿って走り、フレットフィルターへのYFPスピルオーバーを除外する偽フレット歩行を定義します。偽のフレット歩行をすべてのサンプルに適用した後、空のリポソーム処理されたC-F-P-Y-F-P細胞をフレット対CFPに変量プロットでプロットし、集団から離れて上向きおよび左方向に伸びる集団の傾きに沿って多角形のgaを導入します。

このゲートに移行するイベントはすべてフレット陽性と見なされ、細胞の割合は治療中に使用される種子力価と相関します。最後に、フレット陽性率やフレット陽性細胞の蛍光強度中央値など、目的の分析パラメーターを記録します。次に、陽性率とMFIの積を測定して、積分フレット密度を手動で計算します。

タウ凝集体または種子がない場合、タウは、一貫した拡散性およびフレット陰性蛍光シグナルによって表される可溶性モノマー状態に維持されます。バイオセンサー細胞にタウシードを導入した後、内因性タウは凝集したフレット陽性状態のフレット定量に変換されます。フローサイトメトリー解析の結果、組換えタウのフェムトモル濃度が検出に十分であることが確認されました。ここは。

異なる年齢で犠牲にされたタウオパチーマウスの脳幹組織は、代表的な脳領域として機能し、生後1.5か月という早い時期に動物全体で播種活性が一貫して検出されることを示しています。この実験では、アルツハイマー病の被験者から均質な脳は強力な播種活性を示しましたが、年齢が一致した対照群とハンチントン病の被験者は、タウ、CFP、およびタウで形質導入された未処理の初代ニューロン培養物であるタウ凝集体に対するアッセイ特異性を示さなかった。YFPレンチウイルスコンストラクトは、組換えタウシードで処理するとびまん性蛍光シグナルを示しました。

しかし、内因性タウは、リポソームを介した形質導入がない場合でも、フレットフローサイトメトリーで検出可能な大きな凝集体を形成します。シードソースをヘパリンなどのタウ取り込みを阻害する薬剤と事前にインキュベートし、リポソームの非存在下で処理すると、組換えfisおよびタウオパチーマウスの脳サンプルの両方に含まれる播種活性を阻害することができます。一度マスターしたら。

このテクニックは3日で完了でき、1日1〜2時間のベンチワークで完了します。この手順を試みるときは、特定のステップで社内の最適化が必要になることを覚えておくことが重要です。例えば、さまざまな生物学的源からのプロチオ病性種子から有効な力価を決定する場合です。

このビデオを見れば、組換えおよび生物学的ソースからのプロチオパシーディング活性を検出する目的で、フレットフローサイトメトリー実験を設定、実行、および解析する方法を十分に理解できるはずです。