心筋梗塞後の分光分析により測定したラットの扁桃体におけるカスパーゼ-3活性

この手順の全体的な目的は、分光蛍光法を用いて、心筋梗塞後のラット扁桃体におけるcaspase-3活性を測定することです。この手法は、心筋梗塞が認知機能、メンタルヘルス、老化プロセス、および睡眠に及ぼす影響など、行動神経科学分野における重要な問いに答えることができます。この技術の主な利点は、簡便で迅速であり、信頼性が高いことです。

一般的に、この手法に不慣れな方は、手術や組織サンプリングに必要な器用さが求められるため、習得に苦労する可能性があります。本手順のデモンストレーションは、当研究室のリサーチアシスタントであるKim Gilbertが行います。承認済みの施設プロトコルに従って麻酔を導入した後、足底 l pinch 反射がないことを確認し、適切に麻酔がかかっていることを確認してください。

ラットに気管内チューブを挿入し、体温を37 °Cに維持するため、温熱パッドの上に腹臥位で安置します。気管内チューブを、2% isofluoraneを投与する麻酔機に接続します。次に、グルコン酸クロルヘキシジンとイソプロピルアルコールで手術部位を処置します。

そして、乾燥を防ぐために両眼に眼軟膏を塗布します。動物に滅菌ドレープを掛け、手術部位の周囲に滅菌領域を確保します。また、必要な滅菌手術器具を、動物の隣に設けた別の滅菌領域の上に配置します。

次に、10番のメス刃またははさみで皮膚を切開します。はさみまたは止血鉗子を使用して筋肉組織を剥離します。その後、はさみまたは止血鉗子で胸壁を開き、胸部開創器を配置して、止血鉗子で心膜を開きます。

冠動脈閉塞を誘導するために、まず360 mmの長さの4-0シルク縫合糸を下行冠動脈と隣接する心筋組織に回し入れます。シルク縫合糸の両端を、14ゲージで長さ1.25 cmのプラスチックチューブに挿入します。シルク縫合糸の両端を引っぱり、チューブを動脈に押し当てて閉塞させます。

止血鉗子でプラスチックチューブをクランプして閉塞させ、40分間維持します。40分後、止血鉗子を取り除いて閉塞を解除し、続いてフレキシブルチューブと絹縫合糸を取り除きます。2-0縫合糸で胸部を閉鎖し、胸腔にフレキシブルカテーテルを挿入して10 mLシリンジで胸腔内の空気を吸引し、気胸を防止します。

筋肉を4-0シルク縫合糸で、皮膚を3-0シルク縫合糸で縫合します。最後の皮膚縫合を閉じる前に、10 mLシリンジとカテーテルを使用して、再び胸腔内から空気を抜きます。皮膚の縫合を完了させ、その後、イソフルランの投与を停止します。

ラットを清潔なケージに入れ、麻酔からの回復を観察します。鎮痛剤を8時間おきに繰り返し投与してください。承認済みの手順に従い、動物を人道的に断頭した後、ラットの頭部を砕氷上のディッシュに置きます。

鋏を用いて頭蓋骨を開けます。次に、骨鉗子を使用し、下層の組織を傷つけないよう上方に引き上げることで、骨鞘を切り離します。その後、スパチュラの平らな刃を頭蓋骨の底部と脳の後腹面に挿入し、刃をゆっくりと前方へ押し出しながら、脳を頭蓋骨から持ち上げて取り出します。

脳を背側表面を下にして置きます。小脳の前方にある視床下部を確認し、視床下部の後端の前および前端の後方で、脳を冠状的に切断します。視床下部のすぐ隣、側頭葉の下にある2つの小さな球状の構造として、両側の扁桃体を特定します。

次に、脳を前頭端で平らに伏せ、背側を実験者とは反対側に向けます。続いて、大脳半球を分け、扁桃体と接している皮質を取り除きます。扁桃体が露出したら、メスで扁桃体を切り出します。

扁桃体を横切る暗色の縫合線に沿って切断し、基底外側部と中心内側部を分離させ、その後、2つの部位を氷上の別々のラベル付きチューブに入れます。酵素の劣化を防ぐため、この操作は可能な限り迅速に行う必要があります。もう一方の半球でも同様の解剖手順を繰り返した後、4本すべてのバイアルを液体窒素に1分間浸し、その後-80°Cのフリーザーで保存します。

まず、氷上で、サンプルの5〜10 mgあたり150 µLの溶解バッファーを加えます。各サンプルを氷上で最大強度で5秒間ソニケーションします。その後、氷上で30分間インキュベートします。

インキュベーション中、5分ごとにサンプルを5秒間ボルテックスします。次に、サンプルを液体窒素と37 °Cに設定した恒温加熱プレートに交互に配置し、凍結融解サイクルを3回行います。最後の凍結融解サイクルの後、組織サンプルを4 °C、1300 Gsで10分間遠心分離します。

次に、上清を慎重に吸引し、氷上の新しいチューブに移します。書面によるプロトコルの指示に従ってタンパク質を定量した後、0.8 µLの10 mM Ac-DEVD-AMCと反応バッファーを含む反応チューブに、25 µgのタンパク質を加え、最終容量を200 µLにします。陰性反応サンプルについては、25 µgのタンパク質に1 µLの800 µM Ac-DEVD-CHOおよび0.8 µLの10 mM Ac-DEVD-AMCを混合します。

すべてのサンプルとコントロールを、37°Cで3時間暗所でインキュベートします。インキュベーション終了後、各サンプルとコントロールに600 µLの0.4 Mグリシンおよび0.4 M水酸化ナトリウム（pH 10）を加えて反応を停止させます。ガラス製キュベット内の各反応液に2 mLの蒸留水を加えます。

分光光度法により蛍光を定量します。コントロールとサンプルの測定を、1秒ごとに1回の読み取りを行い、10秒間実施します。最後に、画面に表示されている式に従って、各サンプルの比活性を定量します。

このヒストグラムは、心筋梗塞を起こしたラットの扁桃体におけるcaspase-3活性を示しています。データは、シャム対照群の平均活性を100%としたときのパーセンテージとして表されています。各群は8匹のラットで構成されています。アステリスクは、p値が0.05未満の群間における有意差を示しています。

この手法に習熟すれば、心筋梗塞手術から組織サンプリングまでの時間を除き、7時間で完了させることができます。このビデオを視聴することで、ラットに心筋梗塞を誘発する方法と、分光蛍光光度法を用いてラットの扁桃体におけるcaspase-3活性を測定する方法について、十分に理解できるはずです。