心筋梗塞後の分光分析により測定したラットの扁桃体におけるカスパーゼ-3活性

心筋梗塞(MI)は、心機能の障害だけでなく、心筋梗塞の行動結果に関与する脳領域である扁桃体のアポトーシスも引き起こします。このプロトコルは、MIを誘発する方法、扁桃体組織を採取する方法、およびアポトーシスのマーカーであるカスパーゼ-3活性を測定する方法を説明しています。

この手順の全体的な目標は、分光蛍光法を使用して、心筋梗塞後のラット扁桃体のカスパーゼ-3活性を測定することです。この方法は、心筋梗塞が認知能力、メンタルヘルス、老化プロセス、睡眠に及ぼす影響など、行動神経科学の分野における重要な質問に答えることができます。この手法の主な利点は、シンプルで迅速、かつ信頼性が高いことです。

一般的に、この方法に不慣れな人は、手術や組織サンプリングの器用さが必要なため、苦労するでしょう。その手順を実演するのは、当研究室の研究助手であるキム・ギルバートです。承認された施設のプロトコルに従って麻酔を誘発した後、足のピンチ反射がない状態で適切な麻酔を確認します。

気管内チューブでラットを挿管し、動物を温熱パッドの腹側褥位に置いて、体温を摂氏37度に保ちます。.気管内チューブを麻酔器に接続し、2%イソフルオランを調剤します。次に、グルコン酸クロルヘキシジンとイソプロピルアルコールで手術部位を準備します。

そして、乾燥を防ぐために両目に眼科用軟膏を塗ります。動物に滅菌ドレープをかぶせて、手術部位の周囲に滅菌フィールドを作成します。そして、必要な滅菌手術器具を動物の隣の別の滅菌フィールドに置きます。

次に、10番のメスの刃やハサミで皮膚を切開します。ハサミまたは止血クランプを使用して、筋肉組織をはがします。次に、ハサミまたは止血クランプを使用して胸壁を開き、胸部開創器を配置し、止血クランプで心膜を開きます。

冠状動脈閉塞を誘発するには、まず、長さ 360 ミリメートルの 4 ゼロ シルク縫合糸を下行する冠状動脈の周りと隣接する心筋組織にループします。シルク縫合糸の両端を14ゲージの1.25センチメートルの長さのプラスチックチューブに挿入します。シルク縫合糸の両端を引っ張り、チューブを動脈に押し付けて閉塞させます。

プラスチックチューブを止血クランプでクランプして閉塞を固定し、閉塞を40分間維持します。40分後、止血クランプを取り外し、次にフレキシブルチューブとシルク縫合糸を取り外して閉塞を解除します。2つのゼロ縫合糸で胸部を閉じ、胸腔に柔軟なカテーテルを挿入し、10ミリリットルの注射器で胸部から空気を吸い込み、気胸を防ぎます。

筋肉は4つのゼロシルク縫合糸で縫い、皮膚は3つのゼロシルク縫合糸で縫い合わせます。最後の皮膚縫合糸を閉じる前に、10ミリリットルの注射器とカテーテルを使用して胸部から空気を再度引き出します。皮膚を閉じ終え、イソフルオランを止めます。

ラットを清潔なケージに入れ、麻酔からの回復中に監視します。8時間ごとに繰り返し投与して鎮痛剤を投与します。.承認された手順に従って動物を人道的に斬首した後、砕いた氷の上に置かれた皿にネズミの頭を置きます。

ハサミを使って頭蓋骨を開きます。次に、ロンゲールを使用して、上に引っ張ることによって下にある組織を切断することなく、骨の束を取り外します。次に、ヘラの平らな刃を頭蓋骨の底と脳の後腹面の間に置き、ブレードを静かに前方に押して脳を頭蓋骨から引き離し、脳を頭蓋骨から持ち上げます。

脳をその背側に置きます。小脳の前の視床下部を特定し、視床下部の後端の前と前端の後ろで脳を冠状に切断します。両側の扁桃体を、視床下部のすぐ隣の側頭葉の下にある2つの小さな球体として識別します。

次に、背側を実験者から離して、脳の前端を平らにします。次に、半球を分離し、連続した扁桃体から皮質を取り除きます。扁桃体が現れたら、メスで扁桃体を切り取ります。

扁桃体を横切る暗い縫合糸に沿って切断して、基底外側と中央の内側の部分を分離し、次に2つの部分を氷上の別々のラベル付きチューブに入れます。このステップは、酵素の劣化を防ぐために、できるだけ早く行う必要があります。もう一方の半球で解剖手順を繰り返した後、4つのバイアルすべてを液体窒素に1分間浸し、マイナス80°Cの冷凍庫に保管します。

まず、氷上の5〜10ミリグラムのサンプルに150マイクロリットルの溶解バッファーを追加します。各サンプルを最大強度で氷上で5秒間超音波処理します。その後、氷上で30分間インキュベートします。

インキュベーション中は、5分ごとに5秒間サンプルをボルテックスします。次に、サンプルを液体窒素に交互に置き、摂氏37度に設定されたサーモスタット制御の加熱プレートにサンプルを配置することにより、3回の凍結融解サイクルを実行します。最終凍結融解サイクルの後、組織サンプルを摂氏4度で1300Gで10分間遠心分離します。

次に、上清を慎重に吸引し、氷上の新しいチューブに移します。書面によるプロトコルの指示に従ってタンパク質を定量した後、0.8マイクロリットルの10ミリモルAc-DEVD-AMCと反応緩衝液を含む反応チューブに25マイクログラムのタンパク質を加えて、最終容量を200マイクロリットルにします。陰性反応サンプルの場合、25マイクログラムのタンパク質を1マイクロリットルの800マイクロモルAc-DEVD-CHOおよび0.8マイクロリットルの10ミリモルAc-DEVD-AMCと組み合わせます。

すべてのサンプルとコントロールを暗所で摂氏37度で3時間インキュベートします。インキュベーション時間が経過したら、各サンプル中の600マイクロリットルの0.4モルグリシンと0.4モルの水酸化ナトリウムで反応を停止し、制御します。ガラスキュベット内の各反応に2ミリリットルの蒸留水を加えます。

分光蛍光法による蛍光の定量化。コントロールとサンプルを 10 秒間読み取り、1 秒に 1 回の読み取りを行います。最後に、各サンプルの特定の活性を、画面に表示されている式に従って定量化します。

このヒストグラムは、心筋梗塞を発症したラットの扁桃体におけるカスパーゼ-3活性を示しています。データは、100%に設定された偽コントロールの平均活性の割合として表されます各グループは8匹のラットで構成されていました。アスタリスクは、p 値が 0.05 未満の有意なグループ間差を示します。

一度習得すれば、心筋梗塞手術と組織サンプリングの間隔を除いた7時間でこの技術を行うことができます。このビデオを見た後、ラットで心筋梗塞を誘発する方法と、蛍光分光法を使用してラットの扁桃体のカスパーゼ-3活性を測定する方法について十分に理解できるはずです。