Name: マウス脳血管の精製 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: 学ぶマウス脳血管の精製法。低速遠心と濾過を用いて構造的完全性を保ちながら血管区画を分離し、血脳関門の細胞・分子・薬理学的研究を可能にする簡便で迅速な手法です。

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1.ソリューションと材料<ol><li>分離容器の溶液を調製する：B1、HBSSの150ミリリットルにHEPES 1M、1.5mlのを追加します。 B2、B1の20ミリリットルにデキストラン3.6gのを追加します。 B3は、B1の100mlに、BSAの1グラムを追加します。 </li><li>上部のネジ止め部分から下部を切断してフィルターホルダーを変更します。 </li><li>免疫染色ソリューション準備：固定液、pH7.4のPBS中4％パラホルムアルデヒドを、透過処理は、/ブロッキング溶液、5％にヤギ血清を希釈し、pH7.4のPBS中の0.25％のトリトンX100。 注意：固定は、用いた一次抗体の種類によって異なります。 </li></ol> 2.解剖注意：容器は、細胞培養のために使用されていない限り、滅菌条件は、必要とされません。 <ol><li> B1の20mlで150ミリリットルのビーカーを用意します。氷上に保ち、空気汚染を避けるために、パラフィルムでカバーしています。 </li><li>深くint型を追加された純粋なイソフルランの1ミリリットルに浸した小さな紙タオルでボンネットの下にマウスを麻酔ケージO。麻酔は、つま先のピンチに反応の欠如によって確認されました。頸椎脱臼によりマウスを殺します。 注：これらの手順は、国家や機関の規制に準拠して達成されます。 </li><li>オプション：血液コンテンツ 24 を除去するために 、PBS 1×20mlで心臓内灌流を行います。 </li><li>第鼻に首からメスで皮膚と離れてそれを引っ張ります。 PBS 1Xを持つすべての汚染毛を削除します。 </li><li>頭蓋骨を開くには、最初の嗅球に前方にはさみを入れ、2つの部分で頭蓋骨を破壊するはさみを開きます。 </li><li>慎重に脳へらを使って脳を削除してください。彼らは血管の準備38を汚染するよう側脳室から脈絡叢を解剖。 注：オプション：最終製剤は実質および髄膜血管を含んでいます。望まれていない場合、髄膜38によって記載された手順に従って剥離することができます。 </li><li> Trの氷上B1溶液を含有するビーカーに脳をansfer。最大8脳を一緒に処理することができます。 </li></ol> 3.脳組織の均質化<ol><li>その後、約2mmの小片を取得B1溶液中で脳を破っ手動で、激しく、2メスを使用しました。 </li><li> 400 rpmで20ストロークを行う、自動化さダウンスホモジナイザーで準備を均質化。エアポケットの形成を防止するように、ガラス管を氷中に維持されると、上下移動時にdouncerの上部が溶液中にあることを確認します。いくつかのサンプルが用意されている場合は、それぞれの均質化の間にイオン水でdouncerを洗います。 </li></ol> 4.船の精製<ol><li> 50ミリリットルのプラスチックチューブにホモジネートを移し、4℃で10分間2000グラムで遠心分離に進みます。何の灌流を行わなかった場合は大きな白いインタフェース（主にミエリン）を容器ペレット（赤の上に形成することになります）。 </li><li>上清を捨てます。容器ペレットと白のインターフェイスが一緒に付着したままになります。氷冷B2溶液20mlを加え、1分間手で激しくチューブを振ります。 </li><li> 4℃で15分間4400グラムで2回目の遠心分離に進みます。ミエリンは、現在上清の表面に高密度の白色層を形成します。 </li><li>慎重にチューブを保持し、ゆっくり上清を壁に沿って通過させるためにそれを回転させることにより、チューブ壁からミエリン層を切り離します。上清とミエリンを捨てます。血管を含むペレットは、チューブの底に付着したままです。 </li><li> 5ミリリットルのプラスチックピペットに巻き付け吸収紙でチューブの内壁をブロットおよびすべての残留流体を除去、血管ペレットを触れないように注意してください。残りの液体を排出するために吸収紙の上にチューブ逆さまにしてください。 </li><li>低結合ヒントをピペッティングにより氷冷B3溶液1mlでペレットを中断し、keepiチューブを氷上にngのは、B3液の別の5ミリリットルを追加します。船を極力分散され、凝集体を形成しないことを確認します。 </li></ol> 5.ろ過<ol><li>氷冷B3液30mlで氷の上でビーカーを準備します。空気汚染を避けるためにパラフィルムでカバー。 </li><li>ベッカーフラスコの上に修正されたフィルターホルダーに20ミクロンメッシュフィルターを配置し、氷冷B3溶液10mlを適用することにより平衡化。 </li><li>フィルター上の容器の準備を注ぎ、氷冷B3液40mlで血管をすすぎます。 </li><li>きれいなピンセットを使用してフィルタを回復し、すぐB3液の入ったビーカーの中に浸します。軽く振ることによってフィルターから血管を外します。 </li><li> 4℃で5分間、2,000×gで50 mlのプラスチックチューブと遠心分離機でビーカーの内容を注ぎます。 </li><li>注：または、ステップ4.6からの脳船舶の懸濁液を100ミクロンメッシュフィルターに濾過することができます。フロースルーは、次いで、上記のように20μmのメッシュのフィルターで濾過された微小血管（主として毛細血管）を含むが、この場合には、より大きな血管が優先フィルター上に保持されます。 </li><li>氷冷B3溶液1mlに微小血管のペレットを再懸濁し、1.5mlのエッペンドルフチュー​​ブにそれをピペッティングすることにより、それを転送します。 4℃で5分間2000グラムで遠心。 </li></ol> 6.固定、透過処理およびブロッキング<ol><li> 1.0ミリリットル低い結合チップを用いて、PBSを含む0.2ミリリットルのPCRチューブにピペット操作による転送船。彼らは先端の外側の部分に付着し得るような血管を触れないように注意してください。双眼顕微鏡下で、次のすべての手順を実行します。 </li><li>以下の培地の変更ごとに、血管が底に到達するまで氷上にチューブを残して、長い事ゲルローディングピペットチップを使用して液体のほとんどをピペット。 </li><li> PBSの大部分を除去し、固定溶液の200μlを添加します。軽く振ることによって血管を一時停止し、室温で20分間インキュベートします。 </li><li>固定溶液をピペット1×PBS（第一洗浄）を200μlと交換し、室温で5分間インキュベートし、この手順を3回繰り返します。たびに、血管が正常血管が触れていない保証し、1×PBSアウトチューブ、ピペットの底に沈んでいることを確認してください。 </li><li>最後の洗浄後、随時穏やかに振とうすることにより、血管を再懸濁、透過処理/ブロッキング溶液によって1×PBSを交換し、室温で1時間インキュベートします。 </li></ol> 7.免疫染色<ol><li>透過化/ブロッキング溶液中に希釈した一次抗体（材料テンプレートテーブルでここと希釈液を用いた抗体の参考文献を参照）が混在する透過処理/ブロッキング溶液を交換し、4°CO / Nでインキュベートします。 </li><li>室温でPBS中で3回洗浄した後、2時間PBS中に希釈した二次抗体の混合物で血管をインキュベートRTで。 </li><li>注意：顕微鏡下で毛や埃の混入可能性から血管を区別するために：（2000 1）またはDAPI：私たちは強くヘキスト（2000 1）で核染色を行うお勧めします。 </li><li> PBS中で3回洗浄した後、PBSを50μlの血管を再懸濁します。 </li></ol> 8.取り付けと観測<ol><li>シリコン処理ガラスキャピラリーで先端を準備します。メスを用いてP200のピペットチップをカットし、内部の毛細血管を調整します。キャピラリーのおおよその量は40μLです。 </li><li>シリコン処理ガラスキャピラリーを用いてガラススライドに船を移し、慎重に吸収紙の切れ端で液体を除去します。 </li><li>船の上に封入剤の一滴を適用し、ドロップがスリップの縁に沿って拡散することを可能にする45°でカバーガラスを保持します。カバースリップをオフに行ってみようと媒体がゆっくりと広がりを可能にします。それ乾燥したO / N室温で光から保護してみましょう。容器はfluoresc下で観察することができENT共焦点顕微鏡。 </li></ol>

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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

血液脳関門は、CNSの中と外の生理学的物質の通過を調節し、血液中に存在する潜在的に有害な物質に対してそれを保護します。これは、神経変性疾患2と脳腫瘍28を含む、いくつかの中枢神経系の病態に関与しています。 BBBの極めて低い透過性はまた、神経細胞を標的治療薬の通過妨げと可逆的に脳のための有害な結果を伴うBBBを開くしようとする方法の開発は、研究3の非常に活発な分野です。多くの努力は、齧歯類脳から血管を分離するための貴重なモデルとBBBの、細胞の分子的および薬理学的研究を可能技術、特に、プロトコルを開発するために行われています。最初の試みは、単純に、脳実質細胞13を汚染廃棄する可変細孔サイズのメッシュを使用して機械的に分離脳組織からの微小血管を収集します、29、30、31。密度勾配遠心分離は、後の列32、33、15、ナイロンメッシュまたはガラスビーズで脳血管の濾過に関連し導入しました。これらの手順では、ナイロンメッシュ濾過対ガラスビーズは、高速遠心分離はまた、遺伝子発現の15、32に影響を与え</s...

中枢神経系（CNS）の適切な機能は、高度に調節された細胞外環境を必要とし、その代謝要求は、他の臓器1に比べて巨大です。 CNSはまた、一般的に末梢器官に無害それに、神経毒性の化学物質の広い範囲、に非常に敏感です。正しい機能を保証するために、CNS「血管系のほとんどは、内皮障壁を形成します。分子およびイオンの流れ、並びに、血液と脳の間の免疫細胞の通過を制御する血液脳関門（BBB）は、このようにして治療を妨げ、それによって適切な2ホメオスタシスを維持するだけでなく、治療薬の侵入を制限します神経疾患の3。細胞レベルでは、BBBは、主に内皮細胞、排出トランスポーターの偏発現と非常に低いトランスサイトーシス率4との間に大規模なタイトジャンクションによって維持されます。 BBBの性質や機能は、主にNEによって誘導されますighboring細胞4。具体的には、周皮細胞は、BBB 5,6を誘導し、維持する上で重要な役割を果たしています。大血管の周囲の平滑筋細胞がそうであるように、収縮された細胞、周皮細胞は、血液の流れ7を制御します 。最後に、アストロサイト、脳の主要なグリア細胞、脳血管系8のほとんどの周りにエンドフィートという名前の大きなプロセスを送信し、BBBの完全性と免疫静止9を調節し 、ニューロン10の代謝物の転送、および神経活動の間に緊密な結合を誘導し、血流11,12。 脳血管系の分子や細胞の性質を研究する能力は、脳生理学や生理病理への貢献をより良く特徴付けることが重要です。この質問に取り組むためには、脳の脳血管系を隔離するための戦略は、無傷の脳血管フラグメントの調製を可能にする、開発されています。脳血管Purificationは当初、特にげっ歯類14で、他の種にウシ脳13を用いて説明し、改善し、適応させました。この最後の研究では、様々なサイズのフィルターの使用は、異なる直径の容器内で濃縮画分に脳血管を分離するために導入されました。興味深いことに、このような製剤には、内皮細胞は、それらの代謝特性15、トランスポーターの機能16と、偏光17を保ちました。ここでは、具体的に、このプロトコルを記述し、さらに単離血管が自分の中でその場構造のほとんどを維持することを示しています。内皮細胞は、タイトジャンクショ​​ンによってリンクされ、連続的な基底膜に囲まれたままです。周皮細胞および平滑筋細胞、内皮層、ならびに血管周囲の星状細胞膜に付着したままです。しかし、アストロサイト、ミクログリア細胞、ニューロンおよびオリゴデンドロサイトが排除されます。最後に、我々は、単離された脳血管に免疫染色を行うための手順を説明します。 </P&gt; これまで脳血管系に関わる分子および細胞研究のほとんどは、細胞選別細胞特異的レポーターマウス系統または免疫染色に基づく手順18,19を使用して精製した解離脳血管細胞上で行われています。これらの技術は、ほぼ純粋な脳血管細胞集団の単離のために可能にするが、単離された細胞は、完全に順番に、非常にそれらの分子や細胞の特性に影響を与える彼らのその場での形態との相互作用を、失います。分離された脳血管の全体的な構造は、それらの分子特性に影響を小さく、したがって、保存されているとして、ここで説明されたプロトコルは、特異的な抗体またはトランスジェニックマウスの汚れの必要のない全脳血管の断片を単離を可能にする、優れた代替手段を提供しています。最近20,21に記載のように単離された容器は、その後BBBにおける遺伝子活性、タンパク質合成および調節を研究するために使用されるかもしれません</suP&gt;。最後に、レーザーキャプチャーマイクロダイセクション22,23と比較して、本発明のプロトコルは、安価で実行が容易で、任意の研究室に急速に適応可能です。

<table><tbody><tr><td>ティッシュグラインダー サイズC</td><td>トーマス・サイエンティフィック</td><td>3431E25</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機 5415&nbsp;R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機 5810 R</td><td>Eppendorf</td><td>5811000320</td><td></td></tr><tr><td>高性能、モジュール式実体顕微鏡</td><td>Leica</td><td>MZ6</td><td></td></tr><tr><td>Compact System は、高品質のライカLED1000</td><td>ライカ</td><td>LED1000</td><td></td></tr><tr><td>低結合チップを提供します (P1000)</td><td>Sorenson BioScience</td><td>14200T</td><td></td></tr><tr><td>Swinnex 47 mm フィルターホルダー PP 8/Pk</td><td>Millipore</td><td><a href="http://www.millipore.com/catalogue/itemdetail.do?id=SX0004700">SX0004700</a></td><td></td></tr><tr><td>ナイロンネットフィルターディスク親水性20 &m 47 mm 100/Pk</td><td>ミリポア</td><td><a href="http://www.millipore.com/catalogue/itemdetail.do?id=NY2004700">NY2004700</a></td><td></td></tr><tr><td>ナイロンネットフィルターディスク 親水性 100 & マイクロ;m 47 mm 100/Pk</td><td>Millipore</td><td><a href="http://www.millipore.com/catalogue/itemdetail.do?id=NY1H04700">NY1H04700</a></td><td></td></tr><tr><td>Standard Wall Hover Ω</td><td>Tubing Sutter</td><td>Instrument B150-86-7.5</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Slides</td><td>Thermo Scientific</td><td>1014356290F</td><td></td></tr><tr><td>Cover Slips, Thickness 1</td><td>Thermo Scientific</td><td>P10143263NR1</td><td></td></tr><tr><td>0.2 ml 薄肉チューブとドーム型キャップ</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB-0266</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;パラフィルム M (ロールサイズ 4 インチ; 125 フィート)</td><td>シグマ</td><td>P7793-1EA</td><td></td></tr><tr><td>HBSS、カルシウム、マグネシウム、フェノールレッドなし</td><td>ライフテクノロジー</td><td><a href="https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/14175129">14175-129</a></td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1M)</td><td>ライフテクノロジー</td><td>15630056</td><td></td></tr><tr><td>ロイコノストック属のデキストラン Mr. ~70,000</td><td>Sigma</td><td>31390</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Euromedex</td><td>ET330</td><td></td></tr><tr><td>16% ホルムアルデヒド (w/v), メタノールフリー&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>28908</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>bisBenzimide H 33342 trihydrochloride (Hoechst)</td><td>Sigma</td><td>14533</td><td></td></tr><tr><td>封入剤 Fluoromount-G</td><td>Southern Biotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 488 Conjugate;希釈 1/100</td><td>ライフテクノロジー</td><td>I21411</td><td></td></tr><tr><td>アグリン (ウサギ) ; 希釈 1/400</td> 提供:<td>Dr Markus A Ruegg</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti ZO-1 (マウス、クローン 1A12)</td><td>ライフテクノロジー</td><td>33-9100</td><td>希釈率 1:500</td></tr><tr><td>アンチ平滑筋アクチン (マウス、クローン 1A4)</td><td>シグマ</td><td>A2547</td><td>&nbsp;希釈率 1:500</td></tr><tr><td>Anti GFAP (マウス、クローン GA5)</td><td>Sigma</td><td>G3893</td><td>&nbsp;希釈率 1:500</td></tr><tr><td>抗AQP4(ウサギ)</td><td>Sigma</td><td>A5971</td><td>&nbsp;希釈 1:500</td></tr><tr><td>Anti Cx43 (mouse, Clone&nbsp; 2)</td><td>BD Biosciences</td><td>610061</td><td>&nbsp;希釈率 1:500</td></tr><tr><td>アンチオリッグ2(ウサギ)</td><td>ミリポア</td><td>AB9610</td><td>&nbsp;希釈率 1:200</td></tr><tr><td>Anti NF-M (mouse)</td><td>は、スイスのローザンヌ大学の Beat M. Riederer 博士によって提供されました。</td><td>&nbsp;希釈1:10</td><td></td></tr><tr><td>アンチイバ1(ウサギ)</td><td>和光</td><td>019-19741</td><td>&nbsp;希釈率 1:400</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 ヤギ抗マウス IgG (H+L) 抗体</td><td>Life テクノロジー</td><td>A11029</td><td>&nbsp;希釈率 1:2,000</td></tr><tr><td>ヤギ抗ウサギ IgG (H+L) 二次抗体、Alexa Fluor 488 コンジュゲート</td><td>ライフ テクノロジー</td><td>A11034</td><td>&nbsp;希釈率 1:2,000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 ヤギ抗マウス IgG (H+L) 抗体</td><td>Life テクノロジー</td><td>A21424</td><td>&nbsp;希釈率 1:2,000</td></tr><tr><td>ヤギ抗ウサギ IgG (H+L) 二次抗体、Alexa Fluor 555 コンジュゲート</td><td>ライフ テクノロジー</td><td>A21429</td><td>&nbsp;希釈率 1:2,000</td></tr></tbody></table>

マウス脳血管の精製

Purification of Mouse Brain Vessels

脳内、血管系の大部分は、選択的障壁から成り、脳と血液との間の分子および免疫細胞の交換を調節する血液脳関門（BBB）。また、巨大なニューロンの代謝要求は、血流のその時々の規制が必要です。注目すべきは、これらの規制の異常が最も脳の病理の病原特徴です。 、脳腫瘍、ならびに、多発性硬化症、髄膜炎、および敗血症によって誘発される脳機能障害のような炎症状態：神経膠芽腫、脳梗塞、浮腫、てんかん、変性疾患（パーキンソン病、アルツハイマー病例）を含みます。このように、脳血管生理機能を調節するシグナル伝達事象を理解することは大きな課題です。脳血管系を構成する種々の細胞型の細胞および分子の性質に非常に洞察を新たに分離した脳組織から選別初代培養または細胞から得ることができます。しかし、このような細胞極性、形態や細胞間の関係のような特性は、このような製剤中で維持されていません。ここで説明するプロトコルは、構造的完全性を維持しながら、脳血管断片を精製するために設計されています。我々は、単離された血管が連続基底膜で囲まれているタイトジャンクショ​​ンで封止された内皮細胞から構成されていることを示しています。周皮細胞、平滑筋細胞ならびに血管周囲のアストロサイトのエンドフィートの膜は、内皮層に付着したままです。最後に、精製された脳血管に免疫染色実験を実行する方法について説明します。

ここでは、脳血管14の機械的な分離を可能にするプロトコルを記述している。 図1は、この技術の主な手順をまとめたものです。脳血管の構造は複雑であり、いくつかの細胞型を含む、すなわち、内皮細胞のタイトジャンクションによって密封され、周皮細胞、平滑筋細胞、および星状細胞の足突起9によって囲ま。このように、脳血管の単離後、私たちはプロトコルの第2の部分で説明したように免疫染色することにより精製した血管の構造を特徴づけることを目的としました。アグリン、内皮基底膜の成分が連続的かつ均一に内皮表面（ 図2A）で標識しました。ソナはoccludens-1（ZO-1）を、内皮タイトジャンクションの構成要素の一つは、内皮タイトジャンクションが（ 図2B）保存されていたことを示唆し、明らかな不連続で免疫染色しました。周皮細胞の内皮報道、ラベル以前25（ 図2C）に記載されているようNG2により編、ほぼ連続登場。最後に、平滑筋アクチン標識が大き...

マウスの脳の血管コンパートメントの浄化を可能にするプロトコルを記述します。単離された脳血管には、タイトジャンクションによってリンクされ、連続した基底層、周皮細胞、血管平滑筋細胞、および血管周囲星膠膜に囲まれた内皮細胞が含まれます。

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and ...

本手順の全体的な目的は、特定の抗体やトランスジェニック系統を必要とせず、一連の低速遠心分離とろ過を用いることで、構造的な完全性を維持しながらマウス脳の血管区画を精製することです。血液脳関門の細胞学的、分子生物学的、および薬理学的な研究を可能にする手法の開発には、これまで多くの取り組みがなされてきました。分離、勾配、カラム、または高速遠心分離のステップを必要としないため、本手順による脳血管の精製は非常に簡便かつ迅速で、低コストに実施できます。脳血管は構造的に維持され、内皮細胞はタイトジャンクションによって密閉され、基底膜、血管平滑筋細胞、および血管周囲アストロサイト膜に囲まれます。このプロトコールは、脈絡叢血管区画の機能に関する重要な疑問への回答に役立ち、その分子組成の研究を可能にします。手順のデモンストレーションは、Martin Coen Sチームのポストドクターが行います。手順を開始する前に、フィルターホルダーの上部ねじ込み部品の底を切り取ってください。次に、メスを用いてマウスの首から鼻にかけて皮膚を切開し、皮膚を後方に引きます。頭蓋骨をPBSで洗浄して付着した毛を取り除き、その後、嗅球の前方に鋏を挿入します。鋏を開いて頭蓋骨を破砕し、スパチュラを用いて脳を取り出します。次に、側脳室から脈絡叢を摘出し、脳を氷上のB one solution 20 mLが入った150 mLビーカーに移します。続いて、2本のメスを用いて脳を2 mmの組織片になるまで激しく刻み、自動ダウンホモジナイザーを使用して、氷上で400 RPMで20ストローク、組織をホモジナイズします。血管を精製するため、ホモジネートを50 mLプラスチックチューブに移し、組織のスラリーを遠心分離して沈殿させます。スイングローター遠心機を使用すると、主にミエリンからなる大きな白い界面が容器内のペレットの上部に形成されます。上清を廃棄し、氷冷したB two溶液を20 milliliters加え、チューブを1分間激しく振盪します。2回目の遠心後、ミエリンは上清の表面に緻密な白い層を形成します。チューブをゆっくりと回転させながらB two溶液を注ぎ出し、溶液が壁面を伝うようにして、上清とともにミエリンを除去します。次に、吸水紙を巻いたプラスチックピペットを使用して、チューブ壁面に残った液体を取り除きます。管底のペレットに触れないように注意しながら、チューブを逆さまにして氷上に置きます。次に、ペレットを1 mLの氷冷B3溶液に懸濁させ、さらに5 mLのB3溶液を加えながら、小胞が凝集しないように注意します。次に、ビーカーの上に20 µmのナイロンメッシュフィルターを置き、10 mLの氷冷B3溶液でフィルターを平衡化します。調製した小胞をフィルターに注ぎ、さらに40 mLの氷冷B3溶液で小胞を丁寧に洗い流します。次に、清潔なピンセットを用いてフィルターを速やかに30 millilitersの新鮮なB three solutionを含むビーカーに移し、緩やかに振とうしてフィルターから容器を分離させます。ビーカーの内容物を50 milliliterのプラスチックチューブに注ぎます。その後、遠心分離を行い、免疫染色を行う前に、ペレットを1 milliliterの氷冷B three solutionで再懸濁します。容器を0.2 milliliter PCRチューブに移し、チューブ底に組織沈殿が生じるまで氷上に置きます。次に、ゲルロード用チップを用いて液体の大部分を吸引します。続いて、Siliconized 40 micrometer ガラスキャピラリーをP 200ピペットチップに挿入し、このキャピラリーを使用して容器をガラススライドに転送します。容器が静止した後、吸水紙を用いて慎重に液体を除去します。次に、封入剤を1滴、血管の上に載せ、カバーガラスを45度の角度で適用し、カバーガラスが固定されるまで封入剤がガラスの端に沿って広がるようにします。この画像では、神経内皮細胞の周囲に連続的なRIN標識が観察され、精製された血管に基底膜が保持されていることが確認できます。ZO-1などの内皮タイトジャンクションの構成成分も、同様に精製された血管上で検出されます。さらに、NG2および平滑筋アクチン（smooth muscle actin）の標識により、それぞれ完全な状態の寄生虫および血管平滑筋細胞が保持されていることが示された。また、血管周囲アストログリア膜タンパク質であるコネクシン43（connection 43）およびアクアポリン4（Aquaporin four）が精製血管の表面で検出され、精製過程において血管周囲アストロサイト膜がさらに保持されていることが証明された。しかしながら、単離した血管上には分散した短いGFAP陽性線維のみが観察され、アストロサイトの細胞体は共精製されていないことが明らかになった。血管に付着して残っている神経線維はごくわずかであった。同様に、IBA oneおよびoli two陽性細胞も検出されず、ミクログリアとオリゴデンドロサイトが共精製されていないことが確認されました。脳のホモジナイズを行う前に、脈絡叢をあらかじめ除去することを強く推奨します。これは、脈絡叢がコンタミネーションの原因となる可能性があることを経験的に知っているためです。また、抗体はこれらの物質に対して高い非特異的親和性を持つため、クリーンなエリアで作業し、毛髪や埃によるコンタミネーションを避けてください。また、常に核染色を併せて行うことも重要です。血管の抽出前にPBSを用いて心腔内灌流を行うことで、精製血管から血球を除去することが可能です。我々は、この手順で精製された新鮮な血管パレットおよび凍結保存された血管パレットの両方から、RNAおよびタンパク質の抽出に成功しています。また、蛍光プローブと共焦点顕微鏡を用いて、血管のex vivo内皮輸送機能を研究しました。皆様の実験が成功することを願っております。

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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学ぶマウス脳血管の精製法。低速遠心と濾過を用いて構造的完全性を保ちながら血管区画を分離し、血脳関門の細胞・分子・薬理学的研究を可能にする簡便で迅速な手法です。

マウス脳血管の精製

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