ラット腸間膜に微小血管透過性の調節を調査するために、微小灌流法
2015年9月12日
修正されたLandis技術は、微小灌流技術を用いた制御および試験条件下で、正常ラットと遺伝子組み換えラットの腸間膜における個々の微小血管の透水係数のペア測定を可能にします。これは、生理学的条件下で微小血管の透過性と経血管交換を調節するメカニズムを評価するための便利な方法を提供します。
次の実験の全体的な目標は、制御された実験条件下でラット中間体のUlar微小血管の壁の透水係数または透水率を繰り返し測定できるようにすることです。これは、ルーメン内の膠質浸透圧と静水圧を設定し、プロファイスエイトとスースエイトの化学組成を正確に制御できるように、ウラーマイクロ血管をカニューレすることで達成されます。次に、血管を閉塞させ、フローマーカーとして機能するPERFUSE eightに赤血球を懸濁させ、経血管液交換の指標として内腔内を移動するのを観察することができます。
次に、マーカー赤血球の位置と速度を、閉塞部位に向かって記録するか、閉塞部位から離れて記録します。最後に、閉塞が解除され、追加の測定のために繰り返されるか、血管が回収されます。カニューレを挿入し、変更した条件下で測定を繰り返します。
最終的には、制御条件と試験条件下での透水係数のペア測定を行うことで、微小血管を調節する要因を最も直接的に調査することができます。透過性。毛細管透過性の制御を調査するための修正ランディス技術の利点は、灌流ステップです。マイクロ灌流は、PERFUSE 8の組成、交換のための表面積、および微小血管の圧力がすべて直接制御されている条件下で、微小血管壁の透過性を測定することを可能にします。
この手法は、無傷の臓器を代表する微小血管における透過性制御の細胞および分子メカニズムに関する疑問に対処でき、分子メカニズムの詳細を調査するためによく使用される培養内皮単分子膜の結果との比較を提供できます。私たちのプロトコルを実演しているのは、研究所マネージャーのジョイス・クラークです。ジョイスは、ラボマネージャーとしてここにいる間、このプロトコルの多くの改善を担当してきました。
まず、電動プーラーを使用して、空気駆動の砥石と水に浸した0.5ミクロンの研磨紙、水平ベベルから30度の角度に設定されたマイクロピペットホルダーを使用して、それぞれが先端の長さが約1センチメートルのいくつかのきれいなホウケイ酸ガラスキャピラリーチューブをテーパー状の半分に形成します。 マイクロピペット。テキストプロトコルに従ってマイクロピペットを洗浄および乾燥させた後、開口部の長さが約50ミクロンで、開口の長さと幅の比率が3.1〜3.5のマイクロピペットを選択します。また、腸間膜の丈夫なコラーゲン繊維を貫通するのに役立つ、鋭く先細りの先端を持つ必要があります。
拘束具が斜めにされていない引っ張られたガラス毛細管をマイクロフレームの近くに短時間保持して、鈍い端を形成するようにします。繰り返していくつかの拘束具を作り、ほこりのない箱に保管します。次に、斜めになっていない引っ張られた毛細管をマイクロ炎の下で斜めに保持してマイクロオクルードを作成し、チューブアダプターまたは壊れたマイクロピペットを使用して、チューブを先端から約4ミリメートルの角度で120度に近い角度でゆっくりと曲げます。
シャフトに関しては、先端が炎に密封されたり、壊れたりしないことが重要です。ラットに麻酔をかけ、テキストプロトコルに従って間膜組織と腸を配置した後、動物トレイを顕微鏡ステージ上に配置して、眼球を通して間膜が見えるようにします。哺乳類のリンガー溶液の重力供給ドリップラインを連続的にスーパーヒューズに配置します。
次に、メッシュはガーゼパッドを使用して腸を所定の位置に保持し、水分を保持し、余分なリンガーを表面から吸い上げ、流れを調整して流出物を吸引してsuse eightの一定の層を維持し、収束流の下流の分岐していないセグメントと真の毛細血管の遠位にある1つまたは2つの分岐であるターゲットフラ微小血管を特定します。血流が活発で、血管壁に白血球が付着していない分岐していない血管を見つけます。持つ。テストマイクロ血管を顕微鏡フィールドの中央に配置し、選択したカニューレ挿入部位の近くにレストレインを移動します。
マイクロピペットを充填するには、灌流8を引き出し、赤血球をテキストプロトコルに従って調製されたシリンジに洗浄し、チューブ内に気泡がないことを確認します。チューブをマイクロピペットの大きい方の端に進めて、テーパー領域に接します。シリンジプランジャーを優しくすばやく押して、マイクロピペットの先端を満たします。
いっぱいになると、小さな流れや水滴が先端に現れます。チューブを引き出しながら、プランジャーをそっと押してマイクロピペットシャフトを充填します。次に、シャフト内の小さな気泡を軽くはじくようにして取り除きます。
次に、マイクロピペットをサイドポート付きのピペットホルダーに入れ、水圧計に連続的に流体を接続できるようにします。油圧ドライブとマイクロマニピュレーターに取り付けられたホルダーが、マイクロピペットテーパーの端が腸やトレイに当たらないように、わずかな水平角度に設定されていることを確認してください。シリンジまたは水入りゴム球を使用して、圧力計の水柱内の流体の高さを腸間膜から約40センチメートルの水に変更することにより、マイクロピペット内の流体に適用される静水圧を調整します。
充填されたマイクロピペットを顕微鏡下に置く前に、拘束装置を微小血管の近くの組織にそっと押し付け、組織をつかむのに十分な力を加え、拘束装置をわずかに引き戻し、腸間膜コラーゲン線維の応力が血管と整列するように組織を微小血管に沿って引き伸ばします。マイクロピペットを容器に合わせ、アイピースを通して見えるように下げます。選択したカニューレ挿入部位のすぐ上流に先端を置き、組織上に下げて、血管内の流れを部分的に妨げますが、血管を閉塞しないようにします。
油圧駆動を使用して、ピペットの先端を容器の内腔にゆっくりと駆動し、先端が容器の反対側に押し込まれないように注意しながら、容器をカニューレ状にします。マイクロピペットが内腔に入ると、灌流8は血管内腔から血液を急速に洗い流し、循環に入ります。赤血球が血管内腔内で穏やかに振動するまで、圧力計を調整して灌流圧力を下げます。
これにより、微小血管セグメントの遠位端にある静水圧微小血管圧力またはPCを測定するバランス圧力が決まります。血管の灌流をこのバランス圧力より上に維持して、微小閉塞を実行します。ビデオとオーディオを使用して、顕微鏡フィールドの下端近くの灌流血管の上にブロッカーを置きます。
赤のIピースに見られるように、ブロックサイトの位置を口頭で記録します。ブロックサイトは57で、ブロッカーの先端はマイクロベッセルのすぐ上に配置されています。マイクロマニピュレーターの細かいZコントロールを使用して、容器内の流れが閉塞するまでブロッカーを静かに下げます。
音声を使用して、圧力計の圧力を記録します。圧力は50です。その後、オクルージョンを3〜10秒間適用し、離します。
遊離灌流を回復するには、ブロック部位をピペット先端に向かって5〜10ミクロン刻みで血管上に移動し、各場所で3〜5回以下の閉塞を行い、ブロック部位での血管壁の損傷を防ぎます。テキストプロトコルに従ってデータを分析します。このタイムコースでは、水力伝導率の変化を測定するか、4つのパーフューズエイトで首尾よくカニューレ挿入されたラットの微小血管 LP.In
を測定します。一定圧力でのLPの大きさは、微小血管の変化を測定するために使用されました。コントロールとして1%BSAを灌流した場合の壁透過性 vs 炎症剤Brady Kininまたはbkの10モル。ここに示すように、BKはLPの一時的な増加を引き起こし、10〜15分以内に制御レベルに戻りました。
1%BSA 10ナノモルでベースラインレベルを再確立した後。BKは、1マイクロモルのpHシーン、1つのリン酸、またはSの1つのPとともに再灌流されました。その結果、Sの1つのPがbkへの応答を大幅に減衰させたことが示されています。一部の実験計画では、高分子の可溶反射係数とlpの両方を推定することが重要です。
これは、個々のマイクロ容器の複数の圧力でJVを測定することによって最もよく達成されます。この実験では、微小血管の周囲の組織にアルブミンがない場合のPERFUSE 8のLPと5%アルブミンの有効膠質浸透圧の両方を推定しました。JV over Sは、3つの異なる圧力で測定され、プロットされました。ここは。
LPは、S上のJVと圧力との関係の傾きであり、圧力軸上の切片は、血管壁を横切る有効な膠質浸透圧差です。免疫蛍光標識や共焦点顕微鏡、さらには透過型電子顕微鏡などの他の技術と組み合わせることで、マイクロプロフュージョンは、既知の透過性の血管を使用して微小血管の内皮と機能の強力な分析を提供します。このビデオを見れば、制御された実験条件下でラットメセントリーのular microvesselsの透水係数または透水率を繰り返し測定する方法を十分に理解できるはずです。
このアプローチは、現在利用可能なラットモデルでも使用できますが、特に興味があるのは、CRISPR Cas nine技術で利用可能になる新しい遺伝子改変ラットで使用できる可能性であり、このように拡張されることを願っています。
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概要
この研究では、ラットの腸間膜の個々の微小血管の水圧伝導率を測定するために、改良されたLandis法を用いました。この方法により、制御された実験条件下で微小血管の透過性と血管間交換を評価することができます。
主要な研究要素
科学分野
- 神経科学
- 微小血管生理学
- 実験生物学
背景
- 微小血管の水圧伝導率は、組織における流体交換を理解する上で重要です。
- 以前の方法では、個々の血管特性を測定する精度が不足していました。
- 改良されたLandis法は、これらの制限に対処します。
- 微小血管の挙動を理解することで、血管の健康と疾患に関する研究に情報を提供することができます。
研究目的
- 微小血管の水圧伝導率を繰り返し測定できるようにすること。
- 膠質浸透圧と静水圧が微小血管の透過性に与える影響を評価すること。
- 制御された条件下で血管間流体交換を調査すること。
使用された方法
- ラットの腸間膜のUlar微小血管のカニューレ化。
- 血管腔内での膠質浸透圧と静水圧の設定。
- 流体交換を観察するために赤血球を流れのマーカーとして使用すること。
- 実験中の流れのマーカーの位置と速度を記録すること。
主要な結果
- 様々な条件下での水圧伝導率の測定に成功しました。
- 圧力設定が流体交換率に与える影響を示しました。
- 微小血管の透過性ダイナミクスに関する洞察を提供しました。
- 堅固なデータ収集のための繰り返し測定を可能にしました。
結論
- 改良されたLandis法は微小血管特性を研究するのに効果的です。
- 結果は微小血管機能の理解に貢献します。
- この方法は様々な生理学的および病理学的研究に適用できます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
The microperfusion technique enables precise, repeated measurement of hydraulic conductivity in individual microvessels under controlled hydrostatic and oncotic pressures. This bridges molecular mechanisms observed in endothelial monolayers with functional permeability in intact vascular beds, supporting target validation in angiogenesis and inflammatory pathways. The method provides quantitative, reproducible data for de-risking vascular permeability targets in preclinical discovery.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by measuring direct microvessel responses to vasoactive agents like bradykinin and S1P under controlled pressure conditions.
- Operational Value: Enables paired comparisons within the same vessel, reducing biological variability and increasing statistical power for target engagement studies.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by isolating the effect of specific mediators on vascular permeability, informing go/no-go decisions in vascular biology programs.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative hydraulic conductivity (LP) measurements that serve as functional readouts for compound screening in vascular permeability assays.
- Operational Value: Standardizes perfusion and occlusion protocols across experiments, enabling reproducible assay performance in discovery settings.
- Scalability: Facilitates platform reuse with genetically modified rat models via CRISPR/Cas9, supporting longitudinal target validation campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects in vitro endothelial findings to ex vivo microvessel function, improving predictive confidence in disease-relevant systems.
- Preclinical Model Utility: Applicable to rat models with genetic modifications affecting vascular pathways, enabling mechanistic studies of vascular leak in inflammation, sepsis, or ischemia-reperfusion injury.
- Risk-Adjusted Advancement: Provides empirical data on permeability changes to inform dose selection and safety margins in vascular-targeted therapeutic development.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical evaluation, particularly for vascular permeability modulators and barrier-protective agents.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of molecular regulators (e.g., bradykinin, S1P) by measuring their direct impact on microvessel water permeability under controlled conditions.
- Screening: Delivers assay-ready, standardized microvessel preparations with quantifiable LP outputs for evaluating compound effects on vascular barrier function.
- Analytics: Generates slope-intercept analysis of fluid flux vs. pressure to derive hydraulic conductivity and effective oncotic pressure, enabling comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects molecular mechanisms to tissue-level fluid exchange, supporting biomarker alignment in vascular leak models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable perfusion and occlusion platform applicable across multiple vascular targets and disease models in rat mesentery.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in vascular targets by reducing mechanistic ambiguity through direct permeability measurements.
- Operational Value: Ensures reproducibility via standardized cannulation, perfusion, and occlusion steps with internal paired controls.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality by providing functional vascular permeability data early in discovery.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of vascular permeability modifiers based on empirical microvessel response data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in intravital microscopy, microcannulation, and microvascular dissection.
- Depends on specialized instrumentation including hydraulic drive, micromanipulators, and water manometer for pressure control.
- Necessitates standardization of perfusate composition, red cell preparation, and occlusion duration across users and labs.
- Limited to unbranched, straight venular segments; applicability constrained by vascular anatomy in certain species or models.
- Dependent on technical skill to avoid vessel wall damage during repeated occlusion and perfusion cycles.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
2:36
Preliminary Fabrication of Micropipettes, Restrainers, and Blockers
4:11
Arranging Mesentery Tissue and Identification of Microvessel
5:28
Fill Micropipiette and Mount in Holder
6:55
Microcannulation and Microvascular Pressure Measurement
8:26
Microocclusion and Collection of Data
9:43
Results: Microvessel Permeability Measurements
11:36
Conclusion
