Name: ラット腸間膜に微小血管透過性の調節を調査するために、微小灌流法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 48 s
Description: 学ぶ微小灌流法によるラット腸間膜微小血管の水圧伝導度測定技術。個別血管の透過性を制御条件下で繰り返し評価し、血管機能と病態生理の理解に貢献する実験手法です。

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この作品は、国立衛生研究所HL44485とHL28607を付与することによってサポートされていました。

倫理の声明：すべての手順を検討し、施設内動物管理使用委員会によって承認されました。 マイクロピペット、レストレーナー、およびブロッカーの1予備作製<ol><li>引っ張ったときにそのように調整電子プラーを使用して半分にいくつかのきれいなホウケイ酸ガラスキャピラリーチューブを引っ張り、チューブの延伸部分の長さは約1cmであり、2つの半体がいくらか対称的です。テーパーは、 図1の寸法と一致していることを確認してください。マイクロピペット、レストレーナーとブロッカーの両方の半分を使用してください。 <ol><li>ベベル水で浴び0.5μmの研磨紙で空気駆動砥石 30 を用いて、マイクロピペット。それは水平から約30度になるようにマイクロピペットホルダーの角度を設定します。 </li><li>徹底的に先端を通って、シャフトまできれいなアセトンを引っ張るために吸引を使用してマイクロピペットを洗浄し、乾燥させます。 （マイクロピペットを点検ワニ口クリップのマイクロピペットホルダーと接眼レチクルを装着した4×40×目標に小さな直立顕微鏡を用いて図1A）。 </li><li>約50μm、長、長さ/幅の比が3.1〜3.5と腸間膜にタフなコラーゲン繊維に浸透するのに役立ちます鋭くテーパー点であるベベルと先端開口部を持つマイクロピペットを選択します。 </li><li>無塵箱に少し様々なサイズの15〜20マイクロピペットを格納します。 </li></ol></li><li>ステップ1.1で調製した引っ張っ毛細管）を使用して、レストレーナーを作ります。平滑末端（ 図1B）を形成するためにマイクロフレームの近くに簡単に引っ張らガラスキャピラリーチューブを保持します。ダストフリーボックス内のいくつかを保管してください。 </li><li>ステップ1.1で調製した引っ張っ毛細管）を使用してmicrooccludersを行います。 （例えば、チューブアダプタを使用して、23G）マイクロフレームの下に引っ張らキャピラリーチューブを握り、ゆっくりと曲げ先端の細い（先端から約4mmに）軸に近い120度の角度を作るために（ <strong&gt;図1C）。作成し、いくつかの格納します。 </li></ol> 2.動物の準備と手術<ol><li>皮下注射を介してペントバルビタールナトリウム（80〜100ミリグラム/キログラム、Sigma-Aldrich社、P3761）と男性（350〜450グラム）または雌性Sprague-Dawleyラット（200〜300グラム）を麻酔。腹腔内注射を使用しないことで腸間膜を保護します。 </li><li>外科的手法と実験プロトコルを通して、必要に応じて補助的な注射（30 mgの/ kg）で麻酔を維持します。つま先のピンチや角膜反射によって麻酔の深さを決定します。実験手順の完了後、ペントバルビタールの過剰投与または麻酔下で飽和塩化カリウムの心臓内注射を介してラットを安楽死させます。 </li></ol> 3.フローマーカーとして使用するためのソリューションおよび赤血球を準備<ol><li> 10 mg / mlの脂肪酸を含むsuperfusateための哺乳類リンゲル液を調製し、灌流解決を制御する（通常は哺乳類リンゲル液無料のウシ血清アルブミン、BSA）。 <ol><li>マイクロピペットチップをブロックする可能性があります小さな粒子を除去するために0.2μmのシリンジフィルターを通して灌流液フィルタ。小さなきれいな容器にフィルタリングします。 </li></ol></li><li> 0.05ミリリットルのヘパリン（千U / ml）を含む小型の注射器に20G針に麻酔をかけたラットの尾静脈から約0.2ミリリットルの血液を描画することにより、赤血球を準備し、約14 mLの哺乳類リンゲル液溶液を含む15mlの遠心チューブに移します。 <ol><li>優しく（7分間最大200×gで約）赤血球をパックする遠心分離機。上清をオフに描画し、リンゲル液中の赤血球を再懸濁。 </li><li>上清3回遠心分離し、除去した後、後で使用するために、チューブの底に詰め赤血球を残します。この手順が正常レベル31の0.1％未満に、最終的な灌流液中の血小板が減少することに注意してください。 </li></ol></li></ol> 4.動物の組織をアレンジトレイ<ol><li>剣状突起にへそ下から麻酔したラットの腹部を剃ります。髪はよく組織の外にsuperfusateを描画するために芯を形成しないように剃った領域（右側に配置されたラットのための）右側の周りに延びていることを確認してください。濡れたガーゼパッドまたは組織でカット毛を削除します。 <ol><li>鈍鋸歯状の鉗子で皮膚を持ち、頑丈なハサミを用いて皮膚を通して（2-3センチ）中心線切開を行います。ファイン（アイリス）はさみを使用すると、腸の損傷を防ぐために、鋸歯状の鉗子で腹壁を持ち上げる、白線を通して同様の切開を行います。 </li><li>動物トレイにその側の動物で、優しくリンゲル液及び鈍鋸歯状の鉗子に浸した綿棒アプリケーター（木の棒）を使用して腹腔から腸を引き出します。腸間膜は腸間膜に触れないように注意しながら顕微鏡で観察するための柱に掛けられるようにウェル組織で腸を配置（potentially鉗子または綿のいずれかで）微小血管を損傷させます。 注：動物トレイ（ 図2A）はプレキシグラスから構成され、（約3ミリメートルの深）組織ウェルを必要とすることができ、光学的に透明な柱（例えば、研磨石英約2cmの直径と高5ミリメートル。）、加温パッド動物の体温を維持するように調整しました。柱の厚さは、目的の作動距離を超えてはなりません。 </li></ol></li><li>腸間膜が接眼レンズを通して見えるように顕微鏡ステージ上の動物トレイを置きます。 </li><li>連続して35〜37℃に維持哺乳類リンゲル液で腸間膜を表面かん流するために重力供給ドリップラインを配置します。 、所定の位置に腸を保持する水分を保持に役立ち、かつ表面から過剰リンゲル液を吸い上げるために、ガーゼパッドを使用してください。流れを調整し、一貫性のあるsuperfusateの厚さを維持するための廃液を吸引します。 </li><li>あるターゲット細静脈微小血管を識別収束流れ下流分岐していないセグメント、真の毛細血管の遠位に一つまたは二つの分岐。分岐していない容器を探す（理想的には、長さが600〜1000μm）の活発な血流と血管壁に付着する白血球の自由を持ちます。 </li><li>顕微鏡視野の中心にテスト微小血管の位置を調整し、選択されたカニューレ挿入部位近くの位置に拘束具を移動します。 </li></ol> 5.ホルダーにマイクロピペットとマウントを記入<ol><li>ただ、カニューレを挿入する前に、灌流液中の赤血球を中断。きれいなホウケイ酸試験管に0.5ミリリットル灌流液にパックされた赤血球の7μLを加えます。注意：1〜3％のヘマトクリットを使用することができますが、一貫性のヘマトクリットが赤血球から放出された任意の物質の一貫性の灌流液の濃度につながります。 </li><li> 23GチューブアダプタとPE 50チューブ（5-15センチの長さ）を1mlシリンジを取り付けます。注射器に赤/灌流液細胞混合物を描画します。ミックスし、チューブからすべての気泡を排出するために注射器を逆さにし、アダプタ。効率向上のために、実験開始前のいくつかの注射器に、フィットチューブと埃のない箱やビニール袋に保管してください。 </li><li>それはテーパ領域に当接するまでマイクロピペットの大端部にチューブを前進させることによって、マイクロピペットを埋めます。マイクロピペットチップを埋めるために、シリンジプランジャに優しい迅速なプッシュを適用します。注：小さなストリームまたは液滴が完全な充填を証拠する先端に表示されるはずです。 </li><li>静かにマイクロピペットシャフトの広い部分を埋めるために、プランジャーを押しながらチューブを撤回。慎重にマイクロピペットシャフトをフリックすることにより、広いシャフトの小さな気泡を除去。注：同様の手順32に示されています。 </li><li>水圧力計への連続的な流体接続を可能にするサイドポートを備えたピペットホルダーにマイクロピペットを置きます。マイクロピペットの非常に微細な進歩を制御するために使用される油圧ドライブに接続されているホルダは、わずかな角度（15〜25°）であることを確認します水平にマイクロピペットのテーパーのエッジは、腸やトレイに当たらないようにします。 </li><li>試験容器（ 図2）に近い位置合わせを可能にするためにx、y、zのドライブが可動マイクロマニピュレーター、上油圧ドライブをマウントします。 </li><li>約40 CMH 2腸間膜上記Oに圧力計の水柱内の流体の高さを変更するために、注射器や水を充填したゴム球を用いて、マイクロピペット内の流体に適用される静水圧を調整します。 </li><li>ピペットを充填した後、できるだけ早く微小血管にカニューレを挿入。約40分後に非常に少数の赤血球が血管内に流入するように、赤血球は、ピペットの底に沈殿。 </li></ol> 6. Microcannulationと微小血管の圧力測定<ol><li>顕微鏡下で満たされたマイクロピペットを配置する前に、そっと握りに組織を十分な力を付与する微小血管の近くの組織に拘束具を押してください。ドロー拘束後、腸間膜コラーゲン繊維の応力を容器に整列されるように、わずかに微小血管に沿って組織を伸ばします。 <ol><li>容器をマイクロピペットの位置を合わせ、接眼レンズを通してビューにそれを下げます。選択したカニューレ挿入部位のすぐ上流の先端を置き、それが部分的に血管内の流れを阻害するが、それを閉塞しないように、組織上にそれを下げます。 </li></ol></li><li>油圧ドライブを使用して血管内腔にゆっくりとピペットチップを駆動することにより、血管にカニューレを挿入。容器の下側を通ってプッシュしないように注意してください。 注：マイクロピペットは、内腔に入ると、灌流液が急速に内腔の外に血管内の血液を洗浄し、自由に灌流液下流の血管中の正常な血液灌流の一部を移動させる、テスト微小血管に動物の循環遠位に流れ込みます。 </li><li>示されているように（血液まで、圧力計を調整することにより、灌流圧を下げます灌流セグメントに引き戻されている）動物の赤血球によります。これは、赤血球を穏やか血管腔に振動バランス圧を決定し、微小血管セグメントの遠位端に微小血管静水圧力（P C）を測定します。このバランス圧力以上のすべての圧力で血管灌流を維持します。 </li></ol> 7. Microocclusionとデータの収集<ol><li>オプションの手順：先端が繰り返さマイクロ中の実験容器を保護する組織の微パッドが蓄積するように遠い任意の容器から腸間膜の未使用領域における組織にそれを押して、血管をブロックするために、マイクロ閉塞器を使用する前に閉塞。 </li><li>顕微鏡視野の下縁部の近くに灌流容器の上にブロックを配置します。 </li><li>ビデオとオーディオを次のように記録します。 <ol><li>接眼レチクル上に見られるように口頭でブロック部位の位置と下画面の端を記録します。 </li><li>先端でただ微小血管の上方に配置されたブロッカーの、容器内の流れが閉塞されるまで、そっとブロッカーを低下させるためにマイクロマニピュレータの細かいZコントロールを使用します。オーディオの圧力計の圧力（P cを）注意してください。 3-10秒間、通常、閉塞を適用し、その後放し、自由な灌流を復元します。時間に基づいて5〜10ミクロンのステップでピペットの先端に向かって血管までブロックサイトを移動します（&gt;サイトの最初のブロックの後5分）閉塞の、番号（3-5）、ブロックサイトで血管壁の損傷を防ぐために。 </li></ol></li></ol> L pのデータと測定の8解析（透水） <ol><li>ビデオの再生時には、ステージマイクロメーターと画像上の既知の位置の画像を用いて閉塞部位にマーカー赤血球から初期距離（ℓ0）を決定します 。記録画像の3-10秒の間にいくつかのフレーム内の位置からマーカーセルの初期速度（dℓ/ dt）を決定します。阻止します鉱山閉塞時に撮影した画像から血管の半径（R）（ 図3）。 </li><li> （dℓ/ dt）は、各閉塞するためのJ V / Sを算出×（1 /ℓ0）×（R / 2）。駆動圧で割った（JのV / S）などの一定の圧力で、L pを計算する（微小血管の圧力-効果的なコロイド浸透圧、ディスカッションを参照してください）。 </li></ol>

著者らは開示するものは何もない。

L pの計算の詳細。容器が自由に灌流されている間経流体運動が起こるが、それは通常、血管灌流速度の0.01％未満であるため、そのような交換は無料灌流の間に測定することがあまりにも小さいです。しかし灌流は一過性微小血管を閉塞することにより停止したときのように、マーカー赤血球や閉塞部位との間の流体の列が短くなるように、経フロー（ すなわち 、ろ過）はルーメン中のマーカー赤血球の動きから測定され、 図3。実験プロトコルの長さは600〜1000ミクロンが必要とされる分岐していない血管の複雑さと長さに応じて。 容器が閉塞されておらず、圧力計の圧力が微小血管を通る流れを駆動しているときに自由灌流中の微小血管の圧力は、典型的には、唯一であるように、ピペットチップの圧力降下が大きいです下流側の圧力よりも数CMH 2 0。対照的に、閉塞中にピペットを横切る圧力降下は、流体がゆっくりと血管壁を横切る流体フィルタを交換するために血管の内腔に入ると非常に小さいです。したが...

血管系における微小灌流は、通常、直径が40μm未満の血管内にマイクロピペットを介し既知の組成の人工灌流液の流れを制御する確立することを伴います。灌流容器は通常の組織環境内のままで、挿管時に動物の血液を上にして灌流されます。ビデオイメージングまたは蛍光技術の範囲と併せて使用される場合、 その場での微小灌流にこれらのフローのための駆動力が知られており、血管壁の透過性特性があることができる条件下で、微小血管の壁を横切って水と溶質の流れを測定することができます直接評価。さらに、組織（灌流液とsuperfusate）で微小血管の周囲の流体の組成を制御することにより、微小血管の透過性や為替の規制は、電子の多様にさらされる微小血管の壁を形成する内皮細胞を有効にして調べることができますxperimental条件の時間の正確に測定期間（時間秒）のために（アゴニスト、修正された灌流条件、蛍光指示薬は、細胞内の組成およびシグナル伝達を測定します）。加えて、障壁を調節する重要な細胞の分子構造の超微細または細胞化学的評価は、透過性が直接測定されるのと同じ微小血管に調べることができます。アプローチは、それによって、培養内皮細胞単層および無傷の微小血管における調査に内皮バリア機能を変更するための細胞および分子メカニズムの調査の間にブリッジを形成しています。さらなる評価1-6については、以下のレビューを見ます。 微小灌流の制限は、それだけで、薄く透明であり、ガラスマイクロピペットでのカニューレ挿入を可能にするのに十分な構造的完全性を有している微小血管床で使用することができることです。初期の研究は、腸間膜と薄い皮膚狭心症Mにカエルの微小血管を使用している間7,8 uscle、はるかに哺乳動物のモデルの中で最も一般的に使用される製剤は、ラットの腸間膜9-15です。ほとんどの調査は1-4時間の期間にわたって研究し、血管透過性の急性変化に焦点を当ててきたが、より最近の研究は、初期灌流12,16の後に個々の容器での測定に24〜72時間を拡張されています。血管透過性の調節17を研究するためのより多くの遺伝的に改変されたラットモデルを利用できるようにすることを約束し、最近開発されたCRISPR技術は、これらの重要な新しいラットモデルで腸間膜の細静脈微小血管に適用されるこの通信に記載されている方法を有効にする必要があります。 方法は、動物の準備と灌流容器に近い位置のマイクロツールに使用される少なくとも三つのマイクロマニピュレーターの両方を保持するために、容器に灌流マイクロピペットを整列させるために十分な大きさの特注の顕微鏡ステージを備えた倒立顕微鏡を必要としますルーメン。例えばXY顕微鏡ステージ（約90×60センチメートル）のカスタムプラットフォームは防錆コーティングで厚さ1cmの鋼板から製造することができます。ステージは、エンジニアリングインデックステーブルまたは水平面内での移動のためにテフロンピラーやボール転送に直角に取り付けられており、サポートされている2つの鳩尾スライドに取り付けられています。典型的なリグ（図2参照）は、血管平滑の単一血管の血流およびヘマトクリット、血液灌流微小血管による局所的酸素運搬、規制を測定するものなど生体内微小循環実験の範囲に使用する顕微鏡や微細位置決め装置と多くの共通点を持っています筋緊張、および全体の循環に注入された蛍光トレーサーの局所的な微小血管の蓄積。18-26 技術の基本的な側面は、微小血管壁の定義された表面積（S）全体の体積流量（JのV）の測定です。達成するためにこれは、本明細書に記載の修正ランディス技術によって、単純な倒立顕微鏡で十分です。小型ビデオカメラは、追加された時間基準と、画像ポートとビデオ信号上に搭載されたビデオモニタに表示され、コンピュータ上のデジタル形態又はビデオレコーダのデジタルまたはアナログ信号のいずれかとして記録されています。微小血管がカニューレを挿入されると、カメラに見える微小血管の一部が挿管を中断することなくユニットとしてステージとマニピュレータを移動することによって変更することができます。 経フローの測定はまた、溶質透過性の測定に使用リグ、蛍光細胞質カルシウムまたは他の細胞機構の比率を監視し、共焦点イメージング6,12,13、などの適切なフィルタを使用して洗練された蛍光顕微鏡を使用して、より詳細な調査と組み合わせてもよいです27。すべての微小灌流アプローチの重要な利点は、同じ容器に、反復測定を行うことができることですこのような静水圧および膠質浸透圧、または炎症状態に血管応答の誘発性変化として駆動力の制御された変化の下で。最も一般的な設計は、第二のピペットで、その後、ベースラインの透過性の状態を確立するために、第一の制御灌流液と赤の細胞懸濁液を充填したマイクロピペットを介して灌流容器と同じ容器に測定透水（のL p）の一対比較であります試験薬剤と灌流液に加えます。複数のカニューレ挿入は、制御ピペットで再灌流後に繰り返しサイクルで可能です。 現在のプロトコルでは、微小血管の壁を越えた水フラックスを記録し、血管壁のL P、そのまま全体の水と溶質のための共通の経路の透過性の有用な指標を測定するために、ラットの腸間膜に小静脈血管のカニュレーションおよび微小灌流を実証内皮障壁。手順が変更されたランディスtechniqと呼ばれています灌流がブロックされた後、経流体の交換の目安として、赤血球の相対的な動きを使用して、元のランディス原理は28に保存されているので、UEが、実験条件（例えば、微小血管壁全体の静水圧およびアルブミン膠質浸透圧の差）の範囲微小灌流後に使用可能にuncannulated血液灌流微小血管8,29に比べてはるかに大きいです。

<table><tbody><tr><td>顕微鏡、テーブル、ステージ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ビデオ用三眼ヘッド付き倒立顕微鏡(冶金タイプ):例</td><td>オリンパス</td><td>CK-40</td>は<td>、接眼レンズをステージに対して高く配置しようとします--接眼レンズを通して見ながら、ステージの上部に手を伸ばす必要があります マイクロマニピュレーター</td></tr><tr><td>ビデオ用三眼ヘッド付き倒立顕微鏡(冶金タイプ):例</td><td>ライカ</td><td>DMIL</td><td>は、接眼レンズをステージに対して高い位置に配置してみてください--接眼レンズを通して見ながら、介入するマイクロマニピュレータを介してステージの上部に手を伸ばす必要があります</td></tr><tr><td>狭い直径、長い作動距離の目標:例</td><td>ニコン</td><td>ニコンEプラン10&times;/ 0.25 LWD</td><td></td></tr><tr><td>ステージプラットフォーム--1/2インチまたは1cmの鋼板</td><td>溶接工場</td><td></td><td>これは振動</td></tr><tr><td>を減らすために重くする必要がありますUnislide x-yテーブル:鳩の尾のスライド</td><td>Velmex</td><td>AXY4006W1</td><td></td></tr><tr><td>VIDEO</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CCDビデオカメラ:例</td><td>Pulnix</td><td>TM-7CN(もはや利用できません)</td>オーディオ付き<td>色不要</td></tr>ビデオ<tr><td>キャプチャシステム-汎用</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ビデオ再生システム(完全に静止フレーム、単一フレームの動き)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>小さいマイク</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MICROMANIPULATORS、ホルダー</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>マイクロマニピュレーター、XYZ (3)</td><td>Prior / Stoelting(もはや利用できません)</td><td></td><td>細かいZを探し、油圧プローブドライブの位置決めを容易にするための粗いドライブでの移動範囲</td></tr>を拡大し<tr><td>、一方向</td><td>FHC</td><td>50-12-1C</td>は<td>手動ドライブまたは電子ドライブ</td></tr><tr><td>手動ドラムドライブのいずれかを購入する必要があります&nbsp;</td><td>FHC</td><td>50-12-9-02</td><td></td></tr><tr><td>または油圧ドライブ、3ウェイ</td><td>シスキユー株式会社</td><td>MX610(1ウェイ)またはMX630(3ウェイ)</td><td>ショートアーム、水充填のための素晴らしい、そして補充のために~2年ごとに</td></tr><tr><td>コネクター/ロッド/ホルダー</td><td>シスキユー株式会社</td><td>MXC-2.5、MXBなどを</td>送り返す必要があります。<td></td></tr><tr><td>ピンバイス</td><td>スターレット</td><td>162C</td><td>拘束ピ</td></tr><tr><td>ペットホルダー</td>を保持する <td>World Prescision Instruments</td><td>MPH3</td><td></td></tr><tr><td>水圧計 ~120 cm</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡トレイ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr>動物<td></td><td></td><td></td><td>用顕微鏡トレイ用プレキシガラス</td></tr><tr><td>3/4 インチ ポリッシュ クォーツ ディスク ~1/4 インチ 高さ</td><td>クォーツ・サイエンティフィック(株)</td><td>カスタム</td><td>&nbsp;(または磨かれたプレキシガラス、ガラス);高さが客観的</td></tr><tr><td>なプレキシガラス接着剤(溶接4:注意CARCINOGEN)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ティッシュウェル</td><td>NuSil</td><td>MED-1037</td><td></td></tr><tr><td>万能シリコーンゴムヒートマット、5 "L x 2" W</td><td>コールパー</td><td>マーEW-03125-20</td>顕微鏡トレイ用ヒーターの作動距離未満であることを確認してください<td>--コードとコントローラーが必要です--240Vバージョンが利用可能</td></tr><tr><td>カプトンヒーターおよびキット用電源コードアダプター、6フィート、120VAC</td><td>コールパー</td><td>マーEW-03122-75</td><td></td></tr><tr><td>STACO 3PN1010B可変電圧コントローラー、10 A、120 V入力、0-140 V出力</td><td>コールパー</td><td>マーEW-01575-00</td><td></td></tr><tr><td>PIPET MANUFACTURE</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>垂直ピペットプー</td><td>ラーSutter Instrument Company</td><td>P-30、ニクロムフィラメント</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mm OD薄肉キャピラリーチューブ付き</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>B150-110-10</td><td></td></tr>ピ<tr><td>ペットグラインダーエアストーンおよび解剖顕微鏡-テキスト</td><td></td><td></td>の参照を参照する<td>か、Sutter InstrumentsまたはWorld Precision Instruments</td></tr><tr><td>RXホーニングマシン、システムII</td><td>RXホーニングマシンコーポレーション</td><td>MAC-10700 RxシステムIIマシン</td><td>のエアストーンの代替品、斜め</td></tr><tr><td>に取り付けられた解剖顕微鏡と併用&nbsp;&nbsp;セラミックシャープニングディスク付き</td><td>RXホーニングマシンコーポレーション</td><td></td><td>は、「そのまま」使用するか、ラッピングフィルム</td></tr><tr><td>ラッピングフィルムシート、0.3または0.5 um</td><td>3M</td><td>部品番号051144 80827</td><td>268Xインペリアルラッピングフィルムシートを接着バックで取り付けます--アマゾンから購入できます</td></tr></tbody></table>

ラット腸間膜に微小血管透過性の調節を調査するために、微小灌流法

Microperfusion Technique to Investigate Regulation of Microvessel Permeability in Rat Mesentery

個別灌流微小血管の透過性を測定するための実験は、培養内皮細胞単層全体微小血管床の機能交換特性における血管透過性を調節する分子・細胞メカニズムの調査の間のブリッジを提供します。カニューレを挿入し、ラット腸間膜の細静脈微小血管を灌流し、微小血管壁の透水係数を測定する方法が記載されています。必要な主要機器は、3つの異なるマイクロツールを配置するためにマイクロマニピュレーターをサポートし、大きな修正段階で生体顕微鏡含まれています：微小血管にカニューレを挿入し、潅流する（1）面取りガラスマイクロピペットを、 （2）ガラスマイクロオクルーダ一過かん流を遮断し、測定された静水圧で経水流の運動の測定を可能にし、（3）鈍いガラス棒は、カニュレーション部位で腸間膜組織を安定化させることにします。修正されたランディスマイクロ閉塞techniqUEは、微小血管を横切るように、これらの実験条件は変更される流れと静水圧とコロイド浸透圧の差の繰り返し測定を慎重に制御される可能も経流体運動のマーカーとして人工灌流液中に懸濁させた赤血球を使用し、。第一制御灌流液を使用して、透水係数の測定、試験灌流液と同じ微小血管の再挿管後に、これらのよく制御された条件下での微小血管応答の一対比較を可能にします。なぜなら、マウスの腸間膜に長いストレートと分岐していない微小血管の不在で厳しく制限された血管透過性を変更することが予想遺伝子改変マウスでの腸間膜に微小血管にメソッドを拡張しようとしますが、使用して、同様の遺伝子改変ラットの最近の可用性CRISPR / Cas9技術は、本明細書に記載の方法を適用することができる研究の新しい分野を開くことが期待されます。 </P&gt;

図4は、4つの灌流液で連続的にカニューレを挿入微小血管細静脈ラットにL Pにおける変化の時間経過を測定し結果を示す。33定圧で算出さL pの大きさは、微小血管壁の透過性の変化の指標として使用された、第一容器を10 nMのBkのを含む第二のマイクロピペットを用いて炎症剤のブラジキニン（BK）に暴露したときに1％ウシ血清アルブミンを含有する灌流液での制御状態です。ブラジキニンは、その後の10〜15分かけて制御値に向けて返さL pの中に一時的な増加を引き起こしました。容器はその後、安定したベースラインを再確立するために30分間制御灌流液で再潅流しました。微小血管が同じのBkの濃度だけでなく、灌流液中の1μMのスフィンゴシン-1- phospate（S1P）第4マイクロピペットを用いて灌流した場合には、Bkのへの応答が大幅に減衰しました。度BkのS1Pと同時に灌流した減衰は、BkのS1Pへの曝露の前に20分に灌流までに追加された他の実験で測定されたものと同様であることが見出されました。これらの結果は、単一の容器にL <su...

修正されたLandis技術は、微小灌流技術を用いた制御および試験条件下で、正常ラットと遺伝子組み換えラットの腸間膜における個々の微小血管の透水係数のペア測定を可能にします。これは、生理学的条件下で微小血管の透過性と経血管交換を調節するメカニズムを評価するための便利な方法を提供します。

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular ...

本実験の全体的な目的は、制御された実験条件下で、ラット腸間膜におけるUlar微小血管壁の透水係数または水透過性の反復測定を可能にすることです。これは、Ular微小血管をカニュレーションすることで、管腔内の浸透圧および静水圧を設定し、さらに管腔側（perfuse eight）および管外側（Suses eight）の化学組成を精密に制御できるようにすることで達成されます。次に、血管を閉塞させ、perfuse eightに懸濁させた赤血球を血流マーカーとして用いることで、血管内腔を移動する赤血球を観察し、経血管液量交換の指標として利用します。次に、マーカーとなる赤血球の位置と速度を、閉塞部位に向かう方向または閉塞部位から離れる方向のいずれかで記録します。最後に、閉塞を解除し、追加の測定のためにこれを繰り返すか、あるいは血管を再カニュレーションして条件を変更した状態で測定を繰り返します。最終的に、対照条件と試験条件下での透水性のペア測定を行うことで、微小血管の透過性を調節する因子の最も直接的な調査が可能になります。毛細血管透過性の調節を調査するための改良ランドリス法の利点は、灌流ステップにあります。微小灌流により、灌流液の組成、交換表面積、および微小血管圧がすべて直接制御された条件下で、微小血管壁の透過性を測定することができます。この手法は、完全な臓器を代表する微小血管における透過性調節の細胞および分子メカニズムに関する疑問を解決することができ、また、分子メカニズムの詳細を調べるためによく用いられる培養内皮細胞単層の結果との比較を提供することが可能です。本プロトコルを実演するのは、研究室マネージャーのJoyce Clarkです。Joyceは、研究室マネージャーとしての在任期間中、本プロトコルの多くの改善に取り組んできました。まず、電子プルラーを使用して、数本の清潔なホウケイ酸ガラスキャピラリーチューブをテーパー状の半分に形成します。各チップの長さは約1 cmとし、空気駆動の研磨ホイールと、水に浸した0.5 µmの研磨紙、および水平面から30度の角度に設定したマイクロピペットホルダーを用いて、マイクロピペットを研磨します。テキストプロトコルに従ってマイクロピペットを洗浄および乾燥させた後、開口部が約50 µmで、ベベルの長さ対幅の比率が3.1から3.5の間にあるマイクロピペットを選択します。また、腸間膜内の強固なコラーゲン繊維を貫通しやすくするため、先端が鋭くテーパー状になっている必要があります。リストレイナーを作製するには、研磨されていない引きガラスキャピラリーをマイクロフレームの近くに短時間かざし、先端を鈍角に形成します。この操作を繰り返し、複数のリストレイナーを作製して、防塵ボックスに保管します。次に、研磨されていない引きキャピラリーチューブをマイクロフレームの下で斜めに保持し、チューブアダプターまたは破損したマイクロピペットを用いて、先端から約4 mmの箇所を約120度の角度に緩やかに曲げ、マイクロオクルーダーを作製します。シャフトに関して、先端が火炎で塞がれたり、破損したりしていないことが重要です。ラットを麻酔し、本文のプロトコルに従って腸間膜組織と腸管を配置した後、接眼レンズを通して腸間膜が見えるように動物用トレイを顕微鏡ステージ上に配置します。哺乳類用リンゲル液の重力式点滴ラインを設置し、持続的に還流させます。次に、腸間膜を操作し、ガーゼパッドを用いて腸を固定します。これにより、水分を保持し、表面の余分なリンゲル液を吸収させます。流量を調整し、流出液を吸引して、suse eightの一定の層を維持します。標的となるflar微小血管を特定します。これらは、収束流の下流にあり、真毛細血管から遠位に1〜2本の分枝を持つ非分枝セグメントです。血流が速く、血管壁に白血球が付着していない非分枝血管を探します。テスト用の微小血管を顕微鏡視野の中心に配置し、選択したカニューレ挿入部位の近くにリストレイナーを移動させます。マイクロピペットに充填するため、テキストプロトコルに従って準備したシリンジに、perfuse eightと洗浄赤血球を吸い込み、チューブ内に気泡がないことを確認します。チューブをマイクロピペットの太い端から、テーパー部分に接するまで挿入します。シリンジのプランジャーを軽く素早く押し、マイクロピペットのチップに充填します。満タンになると、チップの先端に小さな液柱または液滴が現れます。チューブを引き抜きながら、プランジャーをゆっくりと押し、マイクロピペットのシャフト内に液体を満たします。次に、シャフトを軽く指で弾き、内部の小さな気泡を取り除きます。次に、マイクロピペットを、水 manometer への連続的な流体接続が可能なサイドポート付きのピペットホルダーに設置します。油圧駆動装置とマイクロマニピュレーターに取り付けられたホルダーを、マイクロピペットテーパーの端が腸やトレイに当たらないよう、わずかに水平な角度に設定してください。シリンジまたは水を満たしたゴム球を用いて、manometer の水柱の高さを腸間膜より約 40 centimeters of water 上に調整し、マイクロピペット内の流体に加わる静水圧を調節します。充填したマイクロピペットを顕微鏡下に配置する前に、微小血管付近の組織にリストレイナーをゆっくりと押し当て、組織を固定するのに十分な力を加え、リストレイナーをわずかに後方に引いて、腸間膜のコラーゲン繊維の応力が血管と平行になるように、微小血管に沿って組織を伸ばします。マイクロピペットを血管に合わせ、接眼レンズを通して視界に下ろします。チップを選択したカニュレーション部位のすぐ上流に配置し、血管内の血流を部分的に妨げるものの、完全に閉塞させない程度に組織上に下ろします。油圧駆動装置を用いて、ピペットチップを血管腔内にゆっくりと挿入して血管をカニューレ化します。この際、チップが血管の反対側を突き抜けないように注意してください。マイクロピペットが腔内に入ると、灌流液が血管腔内の血液を急速に洗い流し、循環系へと流入します。マノメーターを調整して灌流圧を下げ、赤血球が血管腔内で緩やかに振動する状態にします。これにより、微小血管セグメントの末端における静水圧微小血管圧またはPCを測定するバランス圧を決定します。微小閉塞を行う際は、血管灌流をこのバランス圧以上に維持してください。ビデオとオーディオを使用して、顕微鏡視野の下端付近にある灌流血管の上にブロッカーを配置します。Iピース赤で見えるブロック部位の位置を口頭で記録します。ブロック部位は57です。ブロッカーの先端をマイクロ血管の直上に配置します。マイクロマニピュレーターの微細Z制御を使用して、血管内の血流が遮断されるまでブロッカーをゆっくりと下げます。オーディオを使用してマノメーターの圧力を記録します。圧力は50です。次に、3～10秒間閉塞させ、その後解除します。遊離灌流を回復させるには、血管内の閉塞部位をピペットチップ方向へ5〜10 µmステップで移動させます。閉塞部位での血管壁の損傷を防ぐため、各位置での閉塞回数は3〜5回に留めてください。データはテキストプロトコルに従って解析します。このタイムコースでは、水力伝導度またはLPの変化を測定します。これは、4つの灌流口を用いて正常にカニュレーションされたラットの小血管において行われます。定圧下におけるLPの大きさを用いて、微小血管の変化を測定しました。コントロールとして1%BSAを灌流させた場合と、10 molarの炎症剤であるブラジキニン（BKまたはbk）を灌流させた場合の壁透過性を比較しました。ここで示されているように、BKはLPの一時的な上昇を引き起こしましたが、10分から15分以内にコントロールレベルまで戻りました。1% BSA 10 nanomolarを用いてベースラインレベルを再確立した後、1 micromolarのpH scene one phosphate（S1P）と共にBKを再灌流させました。その結果、S1PがBKに対する反応を有意に減衰させることが示されました。一部の実験デザインでは、高分子の溶質反射係数とLpの両方を推定することが重要です。これは、個々の微小血管において複数の圧力でJVを測定することで最適に達成されます。この実験では、微小血管周囲の組織にアルブミンが存在しない状態で、PERFUSE 8におけるLPと5% albuminの有効コロイド浸透圧の両方を推定しました。SあたりのJVを3つの異なる圧力で測定し、ここにプロットしました。LPは、SあたりのJVと圧力の関係の傾きであり、圧力軸の切片は血管壁を挟んだ有効浸透圧差です。免疫蛍光標識や共焦点顕微鏡、あるいは透過電子顕微鏡などの他の手法と組み合わせることで、微小灌流法は、透過性が既知の血管を用いて微小血管内皮とその機能を強力に分析することを可能にします。このビデオを視聴することで、制御された実験条件下で、ラット腸間膜の微小血管における水透過性または水力伝導率を繰り返し測定する方法を十分に理解できるはずです。この手法は現在利用可能なラットモデルに使用できますが、私は特にCRISPR Cas9技術によって今後利用可能になる新しい遺伝子改変ラットへの応用の可能性に関心を持っており、このように展開されることを期待しています。

microperfusion-technique-to-investigate-regulation-microvessel

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

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ラット腸間膜に微小血管透過性の調節を調査するために、微小灌流法

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