ラット腸間膜に微小血管透過性の調節を調査するために、微小灌流法

本実験の全体的な目的は、制御された実験条件下で、ラット腸間膜におけるUlar微小血管壁の透水係数または水透過性の反復測定を可能にすることです。これは、Ular微小血管をカニュレーションすることで、管腔内の浸透圧および静水圧を設定し、さらに管腔側（perfuse eight）および管外側（Suses eight）の化学組成を精密に制御できるようにすることで達成されます。次に、血管を閉塞させ、perfuse eightに懸濁させた赤血球を血流マーカーとして用いることで、血管内腔を移動する赤血球を観察し、経血管液量交換の指標として利用します。

次に、マーカーとなる赤血球の位置と速度を、閉塞部位に向かう方向または閉塞部位から離れる方向のいずれかで記録します。最後に、閉塞を解除し、追加の測定のためにこれを繰り返すか、あるいは血管を再カニュレーションして条件を変更した状態で測定を繰り返します。

最終的に、対照条件と試験条件下での透水性のペア測定を行うことで、微小血管の透過性を調節する因子の最も直接的な調査が可能になります。毛細血管透過性の調節を調査するための改良ランドリス法の利点は、灌流ステップにあります。微小灌流により、灌流液の組成、交換表面積、および微小血管圧がすべて直接制御された条件下で、微小血管壁の透過性を測定することができます。

この手法は、完全な臓器を代表する微小血管における透過性調節の細胞および分子メカニズムに関する疑問を解決することができ、また、分子メカニズムの詳細を調べるためによく用いられる培養内皮細胞単層の結果との比較を提供することが可能です。本プロトコルを実演するのは、研究室マネージャーのJoyce Clarkです。Joyceは、研究室マネージャーとしての在任期間中、本プロトコルの多くの改善に取り組んできました。

まず、電子プルラーを使用して、数本の清潔なホウケイ酸ガラスキャピラリーチューブをテーパー状の半分に形成します。各チップの長さは約1 cmとし、空気駆動の研磨ホイールと、水に浸した0.5 µmの研磨紙、および水平面から30度の角度に設定したマイクロピペットホルダーを用いて、マイクロピペットを研磨します。テキストプロトコルに従ってマイクロピペットを洗浄および乾燥させた後、開口部が約50 µmで、ベベルの長さ対幅の比率が3.1から3.5の間にあるマイクロピペットを選択します。また、腸間膜内の強固なコラーゲン繊維を貫通しやすくするため、先端が鋭くテーパー状になっている必要があります。

リストレイナーを作製するには、研磨されていない引きガラスキャピラリーをマイクロフレームの近くに短時間かざし、先端を鈍角に形成します。この操作を繰り返し、複数のリストレイナーを作製して、防塵ボックスに保管します。次に、研磨されていない引きキャピラリーチューブをマイクロフレームの下で斜めに保持し、チューブアダプターまたは破損したマイクロピペットを用いて、先端から約4 mmの箇所を約120度の角度に緩やかに曲げ、マイクロオクルーダーを作製します。

シャフトに関して、先端が火炎で塞がれたり、破損したりしていないことが重要です。ラットを麻酔し、本文のプロトコルに従って腸間膜組織と腸管を配置した後、接眼レンズを通して腸間膜が見えるように動物用トレイを顕微鏡ステージ上に配置します。哺乳類用リンゲル液の重力式点滴ラインを設置し、持続的に還流させます。

次に、腸間膜を操作し、ガーゼパッドを用いて腸を固定します。これにより、水分を保持し、表面の余分なリンゲル液を吸収させます。流量を調整し、流出液を吸引して、suse eightの一定の層を維持します。標的となるflar微小血管を特定します。これらは、収束流の下流にあり、真毛細血管から遠位に1〜2本の分枝を持つ非分枝セグメントです。血流が速く、血管壁に白血球が付着していない非分枝血管を探します。テスト用の微小血管を顕微鏡視野の中心に配置し、選択したカニューレ挿入部位の近くにリストレイナーを移動させます。

マイクロピペットに充填するため、テキストプロトコルに従って準備したシリンジに、perfuse eightと洗浄赤血球を吸い込み、チューブ内に気泡がないことを確認します。チューブをマイクロピペットの太い端から、テーパー部分に接するまで挿入します。シリンジのプランジャーを軽く素早く押し、マイクロピペットのチップに充填します。

満タンになると、チップの先端に小さな液柱または液滴が現れます。チューブを引き抜きながら、プランジャーをゆっくりと押し、マイクロピペットのシャフト内に液体を満たします。次に、シャフトを軽く指で弾き、内部の小さな気泡を取り除きます。

次に、マイクロピペットを、水 manometer への連続的な流体接続が可能なサイドポート付きのピペットホルダーに設置します。油圧駆動装置とマイクロマニピュレーターに取り付けられたホルダーを、マイクロピペットテーパーの端が腸やトレイに当たらないよう、わずかに水平な角度に設定してください。シリンジまたは水を満たしたゴム球を用いて、manometer の水柱の高さを腸間膜より約 40 centimeters of water 上に調整し、マイクロピペット内の流体に加わる静水圧を調節します。

充填したマイクロピペットを顕微鏡下に配置する前に、微小血管付近の組織にリストレイナーをゆっくりと押し当て、組織を固定するのに十分な力を加え、リストレイナーをわずかに後方に引いて、腸間膜のコラーゲン繊維の応力が血管と平行になるように、微小血管に沿って組織を伸ばします。マイクロピペットを血管に合わせ、接眼レンズを通して視界に下ろします。チップを選択したカニュレーション部位のすぐ上流に配置し、血管内の血流を部分的に妨げるものの、完全に閉塞させない程度に組織上に下ろします。

油圧駆動装置を用いて、ピペットチップを血管腔内にゆっくりと挿入して血管をカニューレ化します。この際、チップが血管の反対側を突き抜けないように注意してください。マイクロピペットが腔内に入ると、灌流液が血管腔内の血液を急速に洗い流し、循環系へと流入します。マノメーターを調整して灌流圧を下げ、赤血球が血管腔内で緩やかに振動する状態にします。

これにより、微小血管セグメントの末端における静水圧微小血管圧またはPCを測定するバランス圧を決定します。微小閉塞を行う際は、血管灌流をこのバランス圧以上に維持してください。ビデオとオーディオを使用して、顕微鏡視野の下端付近にある灌流血管の上にブロッカーを配置します。

Iピース赤で見えるブロック部位の位置を口頭で記録します。ブロック部位は57です。ブロッカーの先端をマイクロ血管の直上に配置します。マイクロマニピュレーターの微細Z制御を使用して、血管内の血流が遮断されるまでブロッカーをゆっくりと下げます。

オーディオを使用してマノメーターの圧力を記録します。圧力は50です。次に、3～10秒間閉塞させ、その後解除します。

遊離灌流を回復させるには、血管内の閉塞部位をピペットチップ方向へ5〜10 µmステップで移動させます。閉塞部位での血管壁の損傷を防ぐため、各位置での閉塞回数は3〜5回に留めてください。データはテキストプロトコルに従って解析します。このタイムコースでは、水力伝導度またはLPの変化を測定します。これは、4つの灌流口を用いて正常にカニュレーションされたラットの小血管において行われます。

定圧下におけるLPの大きさを用いて、微小血管の変化を測定しました。コントロールとして1%BSAを灌流させた場合と、10 molarの炎症剤であるブラジキニン（BKまたはbk）を灌流させた場合の壁透過性を比較しました。ここで示されているように、BKはLPの一時的な上昇を引き起こしましたが、10分から15分以内にコントロールレベルまで戻りました。

1% BSA 10 nanomolarを用いてベースラインレベルを再確立した後、1 micromolarのpH scene one phosphate（S1P）と共にBKを再灌流させました。その結果、S1PがBKに対する反応を有意に減衰させることが示されました。一部の実験デザインでは、高分子の溶質反射係数とLpの両方を推定することが重要です。

これは、個々の微小血管において複数の圧力でJVを測定することで最適に達成されます。この実験では、微小血管周囲の組織にアルブミンが存在しない状態で、PERFUSE 8におけるLPと5% albuminの有効コロイド浸透圧の両方を推定しました。SあたりのJVを3つの異なる圧力で測定し、ここにプロットしました。

LPは、SあたりのJVと圧力の関係の傾きであり、圧力軸の切片は血管壁を挟んだ有効浸透圧差です。免疫蛍光標識や共焦点顕微鏡、あるいは透過電子顕微鏡などの他の手法と組み合わせることで、微小灌流法は、透過性が既知の血管を用いて微小血管内皮とその機能を強力に分析することを可能にします。このビデオを視聴することで、制御された実験条件下で、ラット腸間膜の微小血管における水透過性または水力伝導率を繰り返し測定する方法を十分に理解できるはずです。

この手法は現在利用可能なラットモデルに使用できますが、私は特にCRISPR Cas9技術によって今後利用可能になる新しい遺伝子改変ラットへの応用の可能性に関心を持っており、このように展開されることを期待しています。