VDJ-のSeq：B細胞リンパ腫のクローン進化のパターンを明らかに転位免疫グロブリン重鎖遺伝子のディープシーケンシング解析

本手順の全体的な目的は、リンパ腫サンプルのクローン組成を特徴づけ、リンパ腫再発におけるクローン進化パターンの同定を行うことです。この手法は、再発腫瘍が元の腫瘍からどのように発生したかなど、リンパ腫領域における重要な課題の解決に寄与します。本プロトコルの主な利点は、最新の高スループットシーケンス技術を導入することで、リンパ腫の共通性をより包括的にマッピングできる点にあります。

本プロトコルでは、凍結OCT埋込組織およびホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）の正常または悪性組織の薄切片からDNAを抽出します。まず、10～30枚の薄切片を、Proteinase Kおよび0.625% SDSを含む4 mLの核酸溶解バッファーに入れ、37 °Cの恒温水槽で一晩消化させます。翌日、消化混合液に飽和5 M 塩化ナトリウムを1 mL加え、15秒間激しく振盪した後、1,100 ×gで15分間遠心分離します。

室温で、上清を新しい15 mL遠心チューブに移します。2倍量の100% ethanolを加え、チューブを6〜8回反転させて混ぜ合わせ、4°Cで5,000 ×gにて60分間遠心分離します。沈殿したDNAを回収するため、DNAペレットを70% ethanolで2回洗浄し、その都度5,000 ×gで15分間遠心分離します。

ホルマリン固定パラフィン埋没組織の薄切片からDNAを抽出するため、ペレットを100から400 µLのTE緩衝液に溶解し、シェーカーを用いて室温で一晩静置します。まず、パラフィン切片を1 mLのキシレンに浸し、室温で10分間の処理を2回繰り返し、脱パラフィン化を行います。その後、室温で13,000 ×gにて5分間遠心分離し、組織切片を回収します。

次に、切片を1 mLの100% Ethanolで室温にて10分間、2回インキュベートし、残留キシレンを除去します。13,000 ×gで5分間遠心分離し、組織切片を回収します。室温にて10〜15分間、切片を風乾させます。

新しく調製したプロテアーゼK溶液を、最終容量が50〜100 µLとなるようにサンプルに添加し、37 °Cで一晩インキュベートします。翌日、サンプルを95 °Cで10分間加熱し、プロテアーゼを不活性化させます。前段で示した抽出によるDNA収量は、組織のサイズに応じて5〜200 µgとなります。

次のステップは、PCRチューブミックスを用いて各DNAサンプルの品質を評価することです。市販のラダーキットのマスターミックス 45 µLに、TDNA polymerase 25 µLを分注します。PCRチューブにDNA 5 µLを加え、ピペッティングで少なくとも5回以上上下に混ぜ合わせます。

プロトコルの本文に記載された条件に従ってDNAを増幅します。次に、PCR反応液20 µLに6xローディングダイ 4 µLを混ぜ合わせ、2%アガロースゲルにロードします。電気泳動の完了後、アガロースゲルを臭化エチジウムで染色し、PCR産物を検出します。

ゲルイメージングシステムを用いて、100、200、300、400、および600 bpの5つのPCR産物が得られたサンプルを使用し、VDJアンプリコンのみを生成します。本ビデオでは、フレームワーク領域1（IGV HFR1）からの組み換えI-G-H-V-D-Jセグメントの増幅について解説します。フレームワーク領域2からの組み換えI-G-H-B-D-Jセグメントの増幅についても同様の手順で行い、その詳細はプロトコル本文のPCRチューブミックスの項に記載されています。

市販のsomatic IGH HYPERMUTATIONアッセイゲル検出キットの「mix two」とラベルされたチューブからマスターミックスを45 µL分注し、Taq DNA polymeraseを0.25 µL、サンプルDNAを5 µL加えます。プロトコル本文に記載された条件に従ってDNAを増幅させます。 suboptimalなDNAを増幅させる場合は、アニーリング時間を延長するか、増幅サイクル数を増やすことでPCR条件を調整できます。PCR産物全体を2%アガロースゲル電気泳動により分離します。アガロースゲルを0.5 µg/mLのエチジウムブロミド溶液で染色し、PCR産物を検出します。

ゲルイメージングシステムを用いて、310から380 base pairsのサイズ範囲のモノクローナルアンプリコンを確認します。モノクローナルアンプリコンを含むゲル部分を切り出します。その後、標準的なゲル抽出キットを用い、製造元のプロトコルに従って切り出したゲルからDNAを精製します。

この手順を開始するには、精製したV-D-J-P-C-R産物をPCRチューブに移し、DNAサンプル調製キットのResusサスペンションバッファーを加えて、全量を60 microlitersに調整します。DNAサンプル調製キットのエンドリペアミックスを40 microliters加え、十分に混合した後、100 degrees Celsiusに予熱した蓋付きのサーモサイクラーを用いて、反応液を30 degrees Celsiusで30分間インキュベートします。次に、1.5 milliliterチューブ内で磁気ビーズ136 microlitersとPCRグレードの水24 microlitersを混合し、エンドリペア反応液全量をそのチューブに移して、ビーズ溶液と十分に混合します。

チューブをマグネットスタンドに2分間置き、ビーズを溶液から分離させます。上清を吸引し、調製したばかりの80% ethanolでビーズを2回洗浄します。エタノール溶液を完全に吸引し、室温で15分間ビーズを風乾させます。

15分後、チューブをマグネットスタンドから外し、17.5 µLのResus Suspension Bufferでビーズを再懸濁します。チューブを再びマグネットスタンドに2分間置き、ビーズをResus Suspension Bufferから分離させます。エンドリペア産物が含まれているResus Suspension Bufferを、清潔なPCRチューブに移します。

次のステップは、末端修復産物にa-tailを付加することです。末端修復産物が含まれているPCRチューブにa-tailingミックスを12.5 µL加え、十分に混ぜ合わせます。蓋を100 °Cに予熱したサーマルサイクラーを用い、PCRチューブを37 °Cで30分間インキュベートします。

アダプターライゲーションを行うには、a-tailing反応液にResusサスペンションバッファー2.5 µL、ライゲーションミックス2.5 µL、およびDNAアダプターインデックス2.5 µLを加えます。蓋を100 °Cに予熱したサーモサイクラーを用い、反応液を30 °Cで30分間インキュベートします。30分後、各反応液にストップライゲーションバッファー5 µLを加え、十分に混合します。

十分に混合した磁性ビーズを各反応液に42.5 µL加え、前述のように80%エタノールで洗浄します。アダプターライゲーション産物を溶出させるため、Resus suspension bufferを50 µL加えます。十分に混合したampu XP beadsを50 µL用いて、アダプターライゲーション産物を再度精製し、産物を25 µLのResus Suspension Bufferで溶出させて、清潔なPCRチューブに回収します。

VDJアンプリコンを増幅させるため、アダプターがライゲーションされた産物を含むPCRチューブに、5 µLのPCRプライマーカクテルと25 µLのPCRマスターミックスを加え、十分に混合します。プロトコル本文に記載された条件でサーモサイクラーを用いて増幅を行います。増幅完了後、十分に混合した50 µLの磁気ビーズを用いて反応液を精製し、最終産物を30 µLのResus Bufferで溶出させます。その後、VTJアンプリコンライブラリのバリデーション、プーリング、およびシーケンシングをプロトコル本文に従って行います。

VVGシーケンシングライブラリの複雑性が低いため、正確なベースコーリングを可能にするために、承認済みのシーケンシングサンプルに20〜50%のスパイクインを加えることを推奨します。これらの代表的なゲル画像は、リンパ腫患者サンプルから抽出したDNA由来のV-D-J-P-C-Rアンプリコン産物を示しています。ライブラリ構築前後のV-D-J-P-C-Rアンプリコンの品質を、バイオアナライザーを用いて評価しました。

334塩基対から459塩基対へのサイズのシフトは、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫の再発症例におけるクローン進化を追跡するためのアダプターが付加されたことを示しています。診断時サンプルと再発時サンプルの間における、主要な重鎖VDJ再構成の体細胞超変異（SHM）プロファイルの系統解析が行われました。

後期の分岐的クローン進化様式が観察されました。クローン進化を可視化するための新しいグラフィカルな手法が開発されました。図示されているパターンは、後期の分岐的再発モデルと早期の分岐的再発モデルの多次元尺度構成法プロットです。

各円の半径は、特定のSHMプロファイルに対応するサブクローンの数を示しています。青色は診断時のサンプルに、赤色は再発時のサンプルに対応しています。同様に、無向グラフは、後期分岐例におけるサブクローン数の分布が早期分岐例とは異なることを示しています。

エッジは、文字列距離が1文字差である2つのSHMプロファイルに対応しており、カラースケールバーは、赤色の診断時サンプルまたは黄色の再発サンプルに対応する特定のSHMプロファイルにマッピングされる配列の割合を示しています。この手順を行う際は、サンプル間の相互汚染を避けることが重要です。このビデオを視聴することで、リンパ腫腫瘍サンプルの質を評価する方法について十分に理解できるはずです。

この手法は、微小残存病変の追跡や、がんに対する免疫監視応答の調査にも利用可能です。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功を願っております。