Name: VDJ-のSeq：B細胞リンパ腫のクローン進化のパターンを明らかに転位免疫グロブリン重鎖遺伝子のディープシーケンシング解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 7 s
Description: 学ぶB細胞リンパ腫のクローン進化パターンを免疫グロブリン重鎖VDJ領域のディープシーケンス解析で明らかにする方法。診断時と再発時のサンプル比較により腫瘍異質性と治療抵抗性の理解を深める。

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著者は、Rita Shaknovich博士とElemento研究室、Melnick研究室、Tam研究室のメンバーに感謝したいと思います。また、VDJシーケンシングを実施してくださったWeill Cornell Medical CollegeのGenomics Resources Core Facilityにも感謝いたします。YJはASH Scholar Awardの支援を受けました。WTとOEは、Weill Cornell Cancer Center Pilot Grantの支援を受けています。OEは、NSF CAREER賞、Starr Cancer Consortium、およびHirschl Trustによってサポートされています。また、このプロジェクトへの寛大な支援について、キャサリン・ベネッシュ、JD、MPHに感謝します。

1. VDJ増幅腫瘍試料から1.1）のDNA抽出<ol><li>冷凍10月埋め込み正常または悪性組織の薄い切片（10〜20ミクロン）からDNAを抽出します。 <ol><li>プロテイナーゼK（0.5 mg / mlの最終濃度で4 mlの核酸の溶解緩衝液（0.002 MのNa 2 EDTA; 0.3 MのNaCl 0.0075 MトリスHCl、pHは8.2）でクリオスタットミクロトームにより切断包埋組織の10-30薄い部分をダイジェスト）、一晩37℃の水浴中で15 mlの遠心管中で0.625％SDS。 </li><li>消化混合物を飽和NaCl（5 M）の1ミリリットルを加え、15秒間激しく振ります。 </li><li>室温で15分間1100×gで遠心分離します。 </li><li>新しい15ミリリットルの遠心チューブに上清を移し、100％の2容量のエタノールを追加します。 </li><li>チューブを6-8回転倒混和します。 4℃で60分間、5,000×gで遠心分離し、沈殿したDNAを収集します。 </li><li> 70％エタノールで2回DNAペレットを洗浄します。 CENTR15分ペレットを収集するたびに、5,000×gでifuge。 </li><li>シェーカーで一晩の室温で100-400μlのTEバッファーでDNAを溶解します。 DNAの収量は、組織の大きさに応じて5〜200μgの（50-500 ngの/μlの間の最終濃度）であります</li></ol></li><li>ホルマリン固定、パラフィン包埋（FFPE）正常または悪性組織の薄い切片（10〜20ミクロン）からDNAを抽出します。 <ol><li> - パラフィンを塗るを解除1.5 mlのマイクロ遠心チューブに毎回10分間、室温で二回キシレン1ml中パラフィン切片をインキュベートします。室温で5分間、13,000×gで回転させて組織切片を収集します。 </li><li>室温で10分間2回1 mlの100％エタノールに残留キシレンを除去するたびに、切片をインキュベートします。室温で5分間、13,000×gで回転させて組織切片を収集します。パラフィンは、完全にこの時点で溶解し、唯一の組織切片が残っています。 </li><li>部屋teにおけるセクションを空気乾燥10〜15分間mperature。 </li><li> （ヌクレアーゼフリー水で10倍PCR緩衝液から希釈）を1×PCRバッファーで0.5 mg / mlのプロテ​​イナーゼK溶液を作ります。 50〜100μlの最終容量で、サンプルのプロテイナーゼK溶液を加え、37℃で一晩インキュベートします。 </li><li>プロテイナーゼKを不活性化するために10分間95℃でサンプルを加熱します 注：このステップでは、サンプルのDNAは、PCR緩衝液に溶解し、直接ステップ1.2および1.3で使用することができます。 DNAの収量は、組織の大きさに応じて、0.5〜20μgの（10-200 ngの/μlの間の最終濃度）です。 </li></ol></li></ol> 1.2）のDNAの品質評価<ol><li> PCRチューブの商業ラダーキットからマスターミックスの45μlの0.25μlのTaq DNAポリメラーゼを混ぜます。 </li><li> PCRチューブに1.1.1.7または1.1.2.5から調製され、少なくとも5回のピペッティングによりよく混ぜ5μlのDNAを追加します。 </li><li> 95°Cの場合：DNAを増幅するために、以下の条件を使用して、7分。 95℃で45秒の35サイクル、60℃45秒間、および72℃で90秒間、続い。その後、72℃で10分間、15℃で保持します。 </li><li> TBE（トリス/ホウ酸塩/ EDTA）中の2％アガロースゲルを準備します。 </li><li> 4μlの6×ローディング色素と20μlのPCR反応をミックスし、2％アガロースゲル上にロードします。 </li><li> 0.5μg/ mlの臭化エチジウム溶液でアガロースゲルを染色し、ゲル想像システムでPCR産物を検出します。注：100、200、300、400、600塩基対のサイズで5 PCR産物を得たサンプルVDJアンプリコンを生成するために継続されます。 注意：エチジウムブロマイドは、強力な変異原です。保護具、 すなわち手袋を身に着けていることによって細心の注意を払って処理し、機関のガイドラインに従って、特定の容器に廃棄してください。 </li></ol> 1.3）VDJ PCR 1.3.1フレームワーク領域1（IgVHFR1）から）を増幅再結合のIgH VDJセグメント<ol><li>チューブラベルから45μlのマスターミックスを混ぜますED商業体細胞超変異IGHアッセイゲル検出のためのキットの「ミックス2」、Taq DNAポリメラーゼμlの0.25、およびPCRチューブに1.1.1.7または1.1.2.5から調製された5μlのサンプルDNAとして。 </li><li> DNAを増幅するために、以下の条件を使用してください：95℃7分間。 95℃で45秒の35サイクル、60℃45秒間、および72℃で90秒間、続い。その後、72℃で10分間、15℃で保持します。 </li><li>電気泳動による2％アガロースゲルで全体のPCR産物を解決します。 </li><li> 0.5μg/ mlの臭化エチジウム溶液でアガロースゲルを染色し、ゲル画像化システムを用いてPCR産物を検出します。モノクローナルアンプリコンは、310から380塩基対のサイズ範囲と予想されます。 </li><li> 310から380塩基対の間のモノクローナルアンプリコンを含むゲル部分を切り出します。 </li><li>製造業者のプロトコルに従って、標準的なゲル抽出キットを使用して切り出したゲルからDNAを精製します。注意：FR1の断片が得られたサンプルに対して、のIgVを十分にする必要はありませんHFR2とIgVHFR3。 </li></ol> 1.3.2フレームワーク領域2（IgVHFR2）から）を増幅再結合のIgH VDJセグメント<ol><li> PCRチューブに1.1.1.7または1.1.2.5から調製したゲル検出キット用の市販IGH遺伝子クローン性アッセイの「チューブB」、Taq DNAポリメラーゼμlの0.25、および5μlのサンプルDNAとしてラベルチューブから45μlのマスターミックスを混ぜます。 </li><li> DNAを増幅するために、以下の条件を使用してください：95℃7分間。 95℃で45秒の35サイクル、60℃45秒間、および72℃で90秒間、続い。その後、72℃で10分間、15℃で残します。 </li><li>電気泳動による2％アガロースゲルで全体のPCR産物を解決します。 </li><li> 0.5μg/ mlのエチジウムブロマイド染色によってPCR産物（単数または複数）を視覚化します。モノクローナルアンプリコンは、250から295塩基対のサイズ範囲内で観察することができます。 </li><li> 250から295塩基対の間のモノクローナルアンプリコンを含むゲル部分を切り出します。 </li><li>標準ゲルエキスを使用して切り出したゲルからDNAを精製製造業者のプロトコールに従って、イオンのキット。 </li></ol> 1.4）の最適化VDJ PCR <ol><li> 7分、60秒、60秒、60℃95℃の40サイクル、および90秒間72℃、の最終伸長95℃：IgVHFR1とIgVHFR2は次善のDNAを用いて増幅するために、次の修正PCR条件を使用してください10分間72℃です。 </li></ol> 2. VDJアンプリコンライブラリの準備とシーケンシング 2.1）ライブラリの準備 2.1.1）エンド・修理<ol><li> PCRチューブに1.3からVDJ PCR産物を移し、60μlにボリュームを起動するためのDNAサンプル調製キットの再懸濁バッファーを追加します。 </li><li>最後の40μlのDNAサンプル調製キットからミックスを修復し、十分に混合を追加します。 </li><li> 100℃に予熱された蓋で予熱されたサーモ（30°C）で30分間30℃で反応をインキュベートします。 </li><li> 136μlの磁気ビーズと24μlのPCRグラムを混ぜますRADE水は最初の1.5mlチューブに、その後、1.5mlチューブに2.1.1.3から全体エンド修復反応を転送し、ビーズ溶液とよく混ぜます。 </li><li>溶液からのビーズの分離を可能にするために2分間の磁気スタンドにチューブを置きます。上清を吸引除去し、チューブを磁気スタンド上にある間に二度80％の新鮮な準備EtOHでビーズを洗浄します。 </li><li>完全にエタノール溶液を吸引し、15分間、室温で15分間空気乾燥したビーズを可能にします。 </li><li> 17.5μlの再懸濁バッファーに磁気スタンド再懸濁ビーズからチューブを取ります。 </li><li>バック再懸濁バッファーとは別個のビーズに2分間磁気スタンドの上に置きチューブ。きれいなPCRチューブに再懸濁バッファーを（エンド修復製品は現在、再懸濁緩衝液に再懸濁する）を外します。 </li></ol> 2.1.2）A-テーリング<ol><li>エンド修復製品を含むPCRチューブに12.5μlのA-テーリングミックスを加え、よく混ぜます。 </LI&gt; <li> 100℃に予熱された蓋で予熱されたサーモ（37°C）で30分間37℃でPCR管をインキュベートします。 </li></ol> 2.1.3）アダプターライゲーション<ol><li> A-テーリング反応に2.5μlの再懸濁バッファー、2.5μlのライゲーションミックス、および2.5μlのDNAアダプターのインデックスを追加します。 </li><li> 100℃に予熱された蓋で予熱されたサーモ（30°C）で30 minl 30℃で反応をインキュベートします。 </li><li>各反応に5μlの停止ライゲーションバッファーを添加し、十分に混合します。 </li><li> 2.1.1.5 2.1.1.8への手順は以下の反応をきれいに42.5μL、よく混合した磁気ビーズを混ぜます。アダプターライゲーション生成物を溶出するために50μlの再懸濁バッファーを追加します。 </li><li> 50μlのよく混合さAMPure XPビーズを使用して二度目のアダプター連結産物を清掃し、クリーンPCRチューブに25μlの再懸濁バッファー中で生成物を溶出。 </li></ol> 2.1.4）を増幅したDNA断片<ol><li>アダプター連結産物を含むPCRチューブに5μlのPCRプライマーのカクテルと25μlのPCRマスターミックスを加え、よく混ぜます。 </li><li>以下の条件で事前にプログラムされたサーマルサイクラーで増幅を実行します。30秒間、98℃; 30秒30秒、72℃10秒、60℃98℃の10サイクル;その後、72℃で5分間、10℃で保持します。 </li><li> 50μlのよく混合した磁気ビーズを使用して反応をクリーンアップし、30μlの再懸濁バッファーの最終生成物を溶出。 </li></ol> 2.1.5）ライブラリの検証<ol><li>製造業者のプロトコルを使用して、蛍光光度計を用いて、最終生成物を定量します。最終ライブラリー濃度は2.5〜20 ngの/μlの間です。 </li><li>製造業者のプロトコルに従って高感度DNAチップで分析機器を使用して、最終製品の品質を評価します。 IGVHFR1、IGVHFR2またはIGVHFR3のいずれかの予想サイズの単一のバンドを期待しています。電子ライブラリ製品のxpectedサイズはオリジナルのVDJアンプリコンのサイズ+アダプタ（〜125塩基対）の大きさに等しいです。 </li></ol> 2.2）VDJ-PCRライブラリプールとシーケンシング<ol><li>次の式を使用して、各ライブラリー画分のモル濃度を計算します。nMで= [（NG /千）/ BP * 660] NGはステップ2.1.5.1で測定されたVDJ-PCRライブラリーの濃度であり、BPがピークである10 9 xはVDJ-PCRライブラリーのサイズは、ステップ2.1.5.2で測定。 </li><li> DNアーゼを含まない水で2 nMの（10μlの合計）にライブラリを希釈します。 </li><li> 1.5mlチューブに一緒に希釈した2 nMのライブラリの10μLを結合します。 </li><li> 1.5mlチューブにPHIXスパイクインコントロール等量のを追加します。 </li><li>フローセル上に7 PM濃度でプールをロードします。 </li><li>シーケンス製造業者のプロトコルに従って、ペアエンド150サイクルシーケンサーを使用してライブラリ。 </li></ol> 3.データ分析注：SUMMこのセクションで使用されているバイオインフォマティクスの進スクリプトは、補助コードファイルとして求めることができます。 3.1）アラインメントとQC <ol><li>地図ペアエンド配列決定、2のギャップオープンペナルティ、NCBIから入手可能な「BLASTN」に基づく適応ヌクレオチドBLASTアルゴリズムを使用して、IMGTのウェブサイト11からダウンロードした人IGH V、DおよびJ領域データベース、1のギャップ伸長ペナルティに対して読み込み7のワード長、および10 -4の電子値しきい値。 IGH VおよびJ領域の両方にマップされない読み取りペアを捨てます。 </li><li>すべてにわたってVJの組み合わせに一致する周波数を得るためにIGH VおよびJマッピングが残りの読み取りペアを数えるサンプルのシークエンスの実行から得たペアをお読みください。それはIGH VおよびJ遺伝子の両方にマップされている場合は、読み取りペアをカウントした後、特定のVJの組み合わせで対応するカウントにその対立遺伝子を追加します。 </li><li>高いから3.1.2から得られた各再結合VDJ領域についてカウントランク最低のEST。 VDJ領域が最も高いが、カウントが主要な再配置の組み合わせとして定義されて読み込みがあります。 </li><li> 3.1.3で同定されたドメインの主要な転位の35％未満をカバーする整列された配列を破棄します。 </li></ol> 3.2）SHMのプロファイル識別<ol><li>ステップ3.1.3からの読み取りを越え、すべてのSHMパターンをカウントします。サブクローンとして各SHMパターンを定義します。 </li><li>異なるユニークなSHMパターンに対応しているサブクローンの数、および個々のサブクローンにマッピングされている読み込みの数をカウントします。 </li></ol> 3.3）結果をグラフィカルに<ol><li>製造業者のプロトコルに従ってRパッケージ「猿」から接合方法近所を使用して、それらに対応するSHMパターンを使用してサブクローンの系統解析を実行します。 Vの生殖細胞系配列に根ざしたサブクローンの系統発生を再作成するために、個々の異なるアラインメントからの距離行列を計算します各ペアのサンプルセットのための問題のJの組み合わせ。 </li><li>文字ベクトルとして各サブクローンのヌクレオチド配列を使用する二つの整列の間の距離をdとX、Yによって与えられる数学的に診断し、レーベンシュタイン距離の尺度を使用して、対応する再発試料の両方の主要なVJ再配列内のすべてのサブクローン間の近似文字列の距離を計算します私はそれ以外の場合は、J≠0とし、その後の配列iとjのヌクレオチド配列に対応する文字列の長さにわたって、この関数を合計すると（i、j）は、 ここで、d は 、X、Y（i、j）が 1 =。 </li><li>グラフィカルに、以下の2つの方法でサブクローン距離とそれに対応するサブクローンカウントの結果の行列を表示します。 <ol><li>使用Rパッケージ「質量」とは、サブクローン距離行列に多次元スケーリングを適用し、2次元の原理を生成するために、製造業者のプロトコルによれば、その後対数と一緒にプロットされているマップを、座標円の半径としてsubclonalカウント。 </li><li>頂点が主要なVJ再配列から生じる各個別のサブクローンに対応レーベンシュタイン距離に基づいて、無向グラフを構築します。 注：二つの異なるクローン間の距離が1に等しい場合には、これらの2つの頂点の間にエッジが存在します。距離が1より大きい場合には、それらを連結するいかなるエッジが存在しません。 </li><li>製造業者のプロトコルに従って鎌田河合レイアウトで「IGRAPH「Rパッケージのtkplot機能を使用して3.3.3.2のグラフをプロットします。頂点の半径はそれにマッピングされたクローンの総数の三乗根に比例し、シェーディングが診断（青）に属しているいずれかのクローンの割合または再発（赤）のサンプルを表すために赤と青の範囲を使用しています。 </li></ol></li></ol> 3.4）異質性（エントロピー）の測定<ol><li>の番号とサブクローン数を調べサンプルの各ペアのセットのための主要なVJ再配列に生じる体細胞超変異の個々のパターン。 </li><li>標準ヒストグラムベースのエントロピー推定を使用して、各サンプル中の異なるクローンの数に合わせて調整経験的エントロピーと残留経験的エントロピーを計算します。 </li></ol>

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著者には開示すべき利益相反はありません。

そのため、ヒトB細胞のIGH遺伝子座にVDJ再配列とSHMによってコード化された配列情報の反復のほぼ無制限の数の、ハイスループットディープシークエンシングにより全体IGHレパートリーの検査は、クローン描写するための効率的かつ包括的な方法であることが判明しましたサブクローン性B細胞集団。さらに、この方法は、疾患の種々の段階に沿って収集された患者サンプルのクローンおよびサブクローンのアーキテクチャを比較することにより、B細胞腫瘍の発生、寛解および再発のクローン進化経路を研究するために使用することができます。一次サンプルからのDNA再配列VDJ配列の増幅を容易に商業的に入手可能なプライマーを用いて、実験室の設定で行われるが、増幅の効率は、試料DNAの品質に大きく依存します。具体的には、FFPEサンプルから抽出したDNAは、低い増幅効率を示し、しばしばわずかFR3断片が正常これらから増幅することができますサンプル、その後の分析のためにそれらは不適当。本明細書中に記載の我々の研究は、1つまたは腫瘍全体を支配するいくつかの主要なクローンとクローン性疾患であるB細胞リンパ腫のクローン性を理解するために設計されたので、私たちは、収集され、主要なVDJ-...

がんはクローン病です。ピーターC. Nowellが癌クローン進化モデル1を提案したときに30年前から、多くの研究は、腫瘍サンプル内のクローン集団を分析し、腫瘍形成プロセス2の根底にあるクローン拡大と進化パターンを再構築しようとしています。最近では、全ゲノム配列決定は、クローン異質と進化3,4で深く見てみるために研究者を可能にしました。しかし、多くの細胞型で扱いやすいマーカーの欠如に起因し、それは正確なクローンのアーキテクチャおよび進化の経路を推測することは困難です。幸いDLBCLを含む多くのリンパ系悪性腫瘍は、発信元の成熟B細胞における天然クローン性マーカーがあります。抗原刺激に応答して、これらのセグメントの大きなプールから一緒にセグメントを、各B細胞は、V H（可変）、D（多様性）を結合することによって、単一の生産のIgH VDJ配列を形成することができ、およびJ Hの （参加します）。このPRの間にocessは、元の配列の小さな部分を削除することができ、追加の非鋳型ヌクレオチドはユニークなVDJ再構成を作成するために添加されてもよいです。この特定のVDJ再配列は、したがって、個々の成熟B細胞およびその子孫5をタグ付け、このB細胞のすべての子孫に継承することができます。また、SHMは、抗体プールの拡大や抗体アフィニティー6の強化のための追加の突然変異を導入するために、その後の胚中心（GC）反応における再結合VDJ配列に発生します。したがって、比較し、これらのプロセスを経たリンパ腫サンプルのVDJ及びSHMパターンを対比することによって、腫瘍内の不均一性を描写することができ、疾患のクローン進化経路を推定することができます。 以前は、VDJ再構成とSHMのPCR産物をクローニングし、再結合領域を増幅するPCRによって同定することができ、配列情報を得るために、その後サンガー配列決定。このアプローチの私全体再結​​合VDJレパートリーのごく小さな部分を取得し、与えられたサンプル中のクローン集団の全体的な表現の特性を妨げ、低スループットと低収量です。修正されたアプローチは、VDJ PCR産物からNGSインデックスさシーケンシングライブラリーを作製し、サンプルあたり万人以上の組換えVDJ配列を得るために、PE 2x150 bpの塩基配列決定を行うことによって作成されました。また、カスタムパイプラインは、フィルタVDJ配列決定は、各リードの再配置とSHMSを識別し、各サンプルのクローンアーキテクチャに系統学的解析を実行するために読み出して、品質管理（QC）を行う位置合わせするために開発されました。また、新たなアプローチは、さらに、様々な病期で収集したサンプルについて、クローン進化パターンを特徴付けるために確立されています。 私たちは、DLBCL患者試料にこの手法を適用しています。 DLBCLは、1回目までに頻繁に再発と非ホジキンリンパ腫の積極的な形であります患者7のIRD。いくつかは、5年8後に発生するんがDLBCLの再発は、通常、最初の診断の2〜3年以内に、早期に発生します。再発患者の予後は10％だけが原因限られた治療選択肢に3年無増悪生存率を達成することで、不良です。これは、DLBCLの再発9,10を治療するための新規なアプローチが緊急に必要に基礎です。しかし、DLBCLの再発に関連する分子メカニズムはまだ不明な点が多いです。特に、DLBCLの再発の開発中に診断し、クローン進化でクローン異質の役割は、それが困難な再発を予測するために、正確かつ有用なバイオマーカーを定義すること、現在特徴付けられていないです。これらの質問に対処するために、我々は一致した一次診断、再発DLBCLサンプルのペアの複数のペアに私たちのVDJシーケンシングアプローチを適用しました。再発2つの異なるクローン進化のシナリオは、診断と再発SAMPの間にクローンアーキテクチャの比較から登場しましたレ複数の分子機構は、DLBCLの再発に関与する可能性があることを示唆しています。

<table><tbody><tr><td>エタノール</td><td>VWR</td><td>89125-170</td><td>200プルーフ、分子生物学</td></tr><tr><td>TEバッファ</td><td>ライフ</td><td>テクノロジー12090-015</td><td>10 mM Tris&middot;Cl、pH 8.0;10 mM EDTA</td></tr><tr><td>キシレン</td><td>VWR</td><td>EM-XX0055-6</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>プロテイナーゼ K&nbsp;</td><td>Life Technonogies</td><td>25530-015</td><td>100 mg</td></tr><tr><td>デオキシヌクレオチド三リン酸 (dNTP) 溶液ミックス</td><td>Promega</td><td>U1515</td><td>各ヌクレオチド</td></tr><tr><td>10x PCR バッファー&nbsp;</td><td>ロシュ</td><td>11699105001</td><td>MgCl2</td></tr><tr><td>AmpliTaq Gold DNA ポリメラーゼ 金バッファーおよび MgCl2</td><td>Life Technonogies</td><td>4311806</td><td>50 & micro;5 U/&microのl;l</td></tr><tr><td>試料制御サイズラダー</td><td>Invivoscribe Technologies&nbsp;</td><td>2-096-0020</td><td>33反応</td></tr><tr><td>IGH 体細胞超突然変異アッセイ v2.0 - ゲル検出</td><td>Invivoscribe Technologies&nbsp;</td><td>5-101-0030</td><td>33反応、IGVHFR1検出用ミックス2</td></tr><tr><td>IGH遺伝子クローン性アッセイ - ゲル検出</td><td>Invivoscribe Technologies&nbsp;</td><td>1-101-0020</td><td>33反応、IGVHFR2検出用チューブB</td></tr><tr><td>GoTaq Flexi DNAポリメラーゼ</td><td>Promega</td><td>M8291</td><td>20 &micro;5 U/&microのl;l</td></tr><tr><td>10X トリス-ホウ酸-EDTA(TBE)バッファ</td><td>Corning(セルグロ)</td><td>46-011-CM</td><td>6x1 L</td></tr><tr><td>50X TAEバッファ&nbsp;&nbsp;</td><td>VWR</td><td>101414-298</td><td>1 L</td></tr><tr><td>臭化エチジウム</td>溶液 <td>Sigma-Aldrich</td><td>E1510</td><td>10 mg/ml</td></tr><tr><td>25 bp DNA Ladder</td><td>Life Technologies</td><td>10597011</td><td>1 & micro;g/&micro;l</td></tr><tr><td>100 bp DNAラダー</td><td>ライフテクノロジー</td>ズ<td>15628-019</td><td>1 & マイクロ;g/&micro;l</td></tr><tr><td>UltraPure Agarose</td><td>Life Technologies</td><td>16500-500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>40% アクリルアミド/Bis 溶液</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1610144</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>QIAquick Gel Extraction Kit</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>50 columns</td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA High Sensitivity Assay Kit</td><td>Life Technologies</td><td>Q32854</td><td></td></tr><tr><td>高感度DNAキット</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>2100 バイオアナライザー</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PhiX Control v3</td><td>Illumina</td><td>FC-110-3001</td><td></td></tr><tr><td>MiSeq</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qubit 2.0 Fluorometer</td><td>Life Technologies</td><td>Q32872</td><td></td></tr><tr><td>再懸濁バッファー (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)</td><td>Illumina</td><td>FC-121-2001</td><td></td></tr><tr><td>End repair mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)</td><td>Illumina</td><td>FC-121-2001</td><td></td></tr><tr><td>A-tailing mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)</td><td>Illumina</td><td>FC-121-2001</td><td></td></tr><tr><td>Ligation mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)</td><td>Illumina</td><td>FC-121-2001</td><td></td></tr><tr><td>DNA アダプターインデックス (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)</td><td>Illumina</td><td>FC-121-2001</td><td></td></tr><tr><td>Stop ligation buffer (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)</td><td>Illumina</td><td>FC-121-2001</td><td></td></tr><tr><td>PCR primer cocktail (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)</td><td>Illumina</td><td>FC-121-2001</td><td></td></tr><tr><td>PCR master mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)</td><td>イルミナ</td><td>FC-121-2001</td><td></td></tr><tr><td>磁気スタンド</td><td>ライフテクノロジー</td><td>4457858</td><td></td></tr><tr><td>ゲルイメージングシステム</td>バイオ<td>・ラッドラボラトリーズ</td><td>170-8370</td><td></td></tr></tbody></table>

vdj-のseq：b細胞リンパ腫のクローン進化のパターンを明らかに転位免疫グロブリン重鎖遺伝子のディープシーケンシング解析

VDJ-Seq: Deep Sequencing Analysis of Rearranged Immunoglobulin Heavy Chain Gene to Reveal Clonal Evolution Patterns of B Cell Lymphoma

腫瘍クローン性を理解することは、腫瘍形成および疾患の進行に関与するメカニズムを理解するために重要です。また、特定の微小環境または治療に反応して腫瘍内で発生するクローン組成変化を理解することは、腫瘍細胞を根絶するために、より洗練され、効果的なアプローチの設計につながる可能性があります。しかし、腫瘍クローンのサブ集団を追跡することは、識別可能なマーカーの欠如に挑戦しています。この問題に対処するために、VDJ-seqのプロトコルは、VDJ組換えおよび体細胞超変異（SHM）、B細胞リンパ腫の2つのユニークな機能を利用することにより、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫（DLBCL）再発のクローン進化パターンを追跡するために作成されました。 このプロトコルでは、索引付けの可能性を秘めた次世代シーケンシング（NGS）ライブラリは、一次診断と再発DLBCL SAMPの組からの増幅された再配列免疫グロブリン重鎖（IgH遺伝子）VDJ地域から構築しましたレ。サンプルあたりの平均万人以上のVDJ配列は、VDJ再配列とSHM情報の両方が含まれているシーケンシング、後に得た上で。また、カスタマイズされたバイオインフォマティクスパイプラインは完全にこれらのサンプル内のIgH-VDJレパートリーの特徴付けのための配列情報を利用するために開発されました。また、パイプラインは、復興と診断腫瘍と診断し、再発腫瘍対間のクローン進化パターンの控除内クローン不均一性の検査を可能に個々の腫瘍のクローンアーキテクチャの比較を可能にします。いくつかの診断・再発のペアにこの分析を適用するとき、我々は、複数の特徴的な腫瘍の進化のパターンはDLBCLの再発につながることを重要な証拠を発見しました。さらに、このアプローチは、微小残存病変の同定、再発の進行および治療応答をモニターし、免疫repertoirの調査のような他の臨床面、に展開することができ非リンパ腫文脈におけるES。

DNAの抽出を含むVDJ配列決定（VDJ-SEQ）の全体的な手順は、ライブラリー構築の配列決定、VDJ領域の増幅および精製を再結合し、処理、および系統学的解析を読み出し、 図1に示されている。日常5-200μgのDNAをから検索することができます凍結固体組織切片またはホルマリン固定パラフィン包埋組織切片を0.5から20μgのDNAを。品質、再配置パターン、および個々のサンプルのSHMの程度に応じて、異なるサンプルからのVDJ PCR産物の多様を得ることができた（ 図2）、IGVHFR1（310から380塩基対）、FR2（250から295塩基対）を含みますFR3（70-120 bp）の。唯一FR3断片はVDJ PCRから入手することが可能なサンプルが起因下流のデータ分析の目的のために配列情報を十分に提供しない短い製品に残っている試験から除外しました。主要FR1またはFR2 PCR産物が目に可視化することができる唯一の​​サンプル電子アガロースゲルは、シークエンシングライブラリーを生成するために処理されます。ゲル精製後の主要なPCR産物の収率を合計で10〜50 ngの範囲...

このプロトコルは、リンパ腫の組み換え免疫グロブリン重鎖VDJ領域をディープシーケンシングによって調査し、VDJの再配列と体細胞の超突然変異の状態を取得して、個々の腫瘍のクローン構造を描写するアプローチを説明しています。ペアの診断サンプルと再発サンプル間でクローン構造を比較すると、リンパ腫の再発クローン進化モードが明らかになります。

VDJ-のSeq：B細胞リンパ腫のクローン進化のパターンを明らかに転位免疫グロブリン重鎖遺伝子のディープシーケンシング解析

Understanding tumor clonality is critical to understanding the mechanisms involved in tumorigenesis and disease progression. In addition, understanding ...

本手順の全体的な目的は、リンパ腫サンプルのクローン組成を特徴づけ、リンパ腫再発におけるクローン進化パターンの同定を行うことです。この手法は、再発腫瘍が元の腫瘍からどのように発生したかなど、リンパ腫領域における重要な課題の解決に寄与します。本プロトコルの主な利点は、最新の高スループットシーケンス技術を導入することで、リンパ腫の共通性をより包括的にマッピングできる点にあります。本プロトコルでは、凍結OCT埋込組織およびホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）の正常または悪性組織の薄切片からDNAを抽出します。まず、10～30枚の薄切片を、Proteinase Kおよび0.625% SDSを含む4 mLの核酸溶解バッファーに入れ、37 °Cの恒温水槽で一晩消化させます。翌日、消化混合液に飽和5 M 塩化ナトリウムを1 mL加え、15秒間激しく振盪した後、1,100 ×gで15分間遠心分離します。室温で、上清を新しい15 mL遠心チューブに移します。2倍量の100% ethanolを加え、チューブを6〜8回反転させて混ぜ合わせ、4°Cで5,000 ×gにて60分間遠心分離します。沈殿したDNAを回収するため、DNAペレットを70% ethanolで2回洗浄し、その都度5,000 ×gで15分間遠心分離します。ホルマリン固定パラフィン埋没組織の薄切片からDNAを抽出するため、ペレットを100から400 µLのTE緩衝液に溶解し、シェーカーを用いて室温で一晩静置します。まず、パラフィン切片を1 mLのキシレンに浸し、室温で10分間の処理を2回繰り返し、脱パラフィン化を行います。その後、室温で13,000 ×gにて5分間遠心分離し、組織切片を回収します。次に、切片を1 mLの100% Ethanolで室温にて10分間、2回インキュベートし、残留キシレンを除去します。13,000 ×gで5分間遠心分離し、組織切片を回収します。室温にて10〜15分間、切片を風乾させます。新しく調製したプロテアーゼK溶液を、最終容量が50〜100 µLとなるようにサンプルに添加し、37 °Cで一晩インキュベートします。翌日、サンプルを95 °Cで10分間加熱し、プロテアーゼを不活性化させます。前段で示した抽出によるDNA収量は、組織のサイズに応じて5〜200 µgとなります。次のステップは、PCRチューブミックスを用いて各DNAサンプルの品質を評価することです。市販のラダーキットのマスターミックス 45 µLに、TDNA polymerase 25 µLを分注します。PCRチューブにDNA 5 µLを加え、ピペッティングで少なくとも5回以上上下に混ぜ合わせます。プロトコルの本文に記載された条件に従ってDNAを増幅します。次に、PCR反応液20 µLに6xローディングダイ 4 µLを混ぜ合わせ、2%アガロースゲルにロードします。電気泳動の完了後、アガロースゲルを臭化エチジウムで染色し、PCR産物を検出します。ゲルイメージングシステムを用いて、100、200、300、400、および600 bpの5つのPCR産物が得られたサンプルを使用し、VDJアンプリコンのみを生成します。本ビデオでは、フレームワーク領域1（IGV HFR1）からの組み換えI-G-H-V-D-Jセグメントの増幅について解説します。フレームワーク領域2からの組み換えI-G-H-B-D-Jセグメントの増幅についても同様の手順で行い、その詳細はプロトコル本文のPCRチューブミックスの項に記載されています。市販のsomatic IGH HYPERMUTATIONアッセイゲル検出キットの「mix two」とラベルされたチューブからマスターミックスを45 µL分注し、Taq DNA polymeraseを0.25 µL、サンプルDNAを5 µL加えます。プロトコル本文に記載された条件に従ってDNAを増幅させます。 suboptimalなDNAを増幅させる場合は、アニーリング時間を延長するか、増幅サイクル数を増やすことでPCR条件を調整できます。PCR産物全体を2%アガロースゲル電気泳動により分離します。アガロースゲルを0.5 µg/mLのエチジウムブロミド溶液で染色し、PCR産物を検出します。ゲルイメージングシステムを用いて、310から380 base pairsのサイズ範囲のモノクローナルアンプリコンを確認します。モノクローナルアンプリコンを含むゲル部分を切り出します。その後、標準的なゲル抽出キットを用い、製造元のプロトコルに従って切り出したゲルからDNAを精製します。この手順を開始するには、精製したV-D-J-P-C-R産物をPCRチューブに移し、DNAサンプル調製キットのResusサスペンションバッファーを加えて、全量を60 microlitersに調整します。DNAサンプル調製キットのエンドリペアミックスを40 microliters加え、十分に混合した後、100 degrees Celsiusに予熱した蓋付きのサーモサイクラーを用いて、反応液を30 degrees Celsiusで30分間インキュベートします。次に、1.5 milliliterチューブ内で磁気ビーズ136 microlitersとPCRグレードの水24 microlitersを混合し、エンドリペア反応液全量をそのチューブに移して、ビーズ溶液と十分に混合します。チューブをマグネットスタンドに2分間置き、ビーズを溶液から分離させます。上清を吸引し、調製したばかりの80% ethanolでビーズを2回洗浄します。エタノール溶液を完全に吸引し、室温で15分間ビーズを風乾させます。15分後、チューブをマグネットスタンドから外し、17.5 µLのResus Suspension Bufferでビーズを再懸濁します。チューブを再びマグネットスタンドに2分間置き、ビーズをResus Suspension Bufferから分離させます。エンドリペア産物が含まれているResus Suspension Bufferを、清潔なPCRチューブに移します。次のステップは、末端修復産物にa-tailを付加することです。末端修復産物が含まれているPCRチューブにa-tailingミックスを12.5 µL加え、十分に混ぜ合わせます。蓋を100 °Cに予熱したサーマルサイクラーを用い、PCRチューブを37 °Cで30分間インキュベートします。アダプターライゲーションを行うには、a-tailing反応液にResusサスペンションバッファー2.5 µL、ライゲーションミックス2.5 µL、およびDNAアダプターインデックス2.5 µLを加えます。蓋を100 °Cに予熱したサーモサイクラーを用い、反応液を30 °Cで30分間インキュベートします。30分後、各反応液にストップライゲーションバッファー5 µLを加え、十分に混合します。十分に混合した磁性ビーズを各反応液に42.5 µL加え、前述のように80%エタノールで洗浄します。アダプターライゲーション産物を溶出させるため、Resus suspension bufferを50 µL加えます。十分に混合したampu XP beadsを50 µL用いて、アダプターライゲーション産物を再度精製し、産物を25 µLのResus Suspension Bufferで溶出させて、清潔なPCRチューブに回収します。VDJアンプリコンを増幅させるため、アダプターがライゲーションされた産物を含むPCRチューブに、5 µLのPCRプライマーカクテルと25 µLのPCRマスターミックスを加え、十分に混合します。プロトコル本文に記載された条件でサーモサイクラーを用いて増幅を行います。増幅完了後、十分に混合した50 µLの磁気ビーズを用いて反応液を精製し、最終産物を30 µLのResus Bufferで溶出させます。その後、VTJアンプリコンライブラリのバリデーション、プーリング、およびシーケンシングをプロトコル本文に従って行います。VVGシーケンシングライブラリの複雑性が低いため、正確なベースコーリングを可能にするために、承認済みのシーケンシングサンプルに20〜50%のスパイクインを加えることを推奨します。これらの代表的なゲル画像は、リンパ腫患者サンプルから抽出したDNA由来のV-D-J-P-C-Rアンプリコン産物を示しています。ライブラリ構築前後のV-D-J-P-C-Rアンプリコンの品質を、バイオアナライザーを用いて評価しました。334塩基対から459塩基対へのサイズのシフトは、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫の再発症例におけるクローン進化を追跡するためのアダプターが付加されたことを示しています。診断時サンプルと再発時サンプルの間における、主要な重鎖VDJ再構成の体細胞超変異（SHM）プロファイルの系統解析が行われました。後期の分岐的クローン進化様式が観察されました。クローン進化を可視化するための新しいグラフィカルな手法が開発されました。図示されているパターンは、後期の分岐的再発モデルと早期の分岐的再発モデルの多次元尺度構成法プロットです。各円の半径は、特定のSHMプロファイルに対応するサブクローンの数を示しています。青色は診断時のサンプルに、赤色は再発時のサンプルに対応しています。同様に、無向グラフは、後期分岐例におけるサブクローン数の分布が早期分岐例とは異なることを示しています。エッジは、文字列距離が1文字差である2つのSHMプロファイルに対応しており、カラースケールバーは、赤色の診断時サンプルまたは黄色の再発サンプルに対応する特定のSHMプロファイルにマッピングされる配列の割合を示しています。この手順を行う際は、サンプル間の相互汚染を避けることが重要です。このビデオを視聴することで、リンパ腫腫瘍サンプルの質を評価する方法について十分に理解できるはずです。この手法は、微小残存病変の追跡や、がんに対する免疫監視応答の調査にも利用可能です。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功を願っております。

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Research

JoVE Journal

Medicine

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VDJ-のSeq：B細胞リンパ腫のクローン進化のパターンを明らかに転位免疫グロブリン重鎖遺伝子のディープシーケンシング解析

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