ハイスループットマイクロプレート呼吸測定のためのマウスの骨格筋の最小量からミトコンドリアの単離

このビデオ記事の全体的な目標は、マイクロプレートベースのトリクスアッセイで使用するために、少量のマウス骨格筋から高品質のミトコンドリアを単離することです。この方法は、特定の薬物やタンパク質が骨格筋やミトコンドリアの酸素消費をどのように調節するかを説明するなど、生物医学研究における重要な質問に答えるのに役立つ可能性があります。この技術の主な利点は、これまでに報告されているよりも少量のマウス骨格筋から高品質のミトコンドリアを単離できることです。

施設のガイドラインに従ってマウスの安楽死を行います。次に、マウスを横向きに置き、先端の細いはさみを使用して皮膚を切開します。大腿骨の外側上顆を覆います。

マウスに向かって皮膚をはがし、大腿四頭筋の起点の上にある脂肪パッドを取り外します。次に、膝蓋骨に付着している大腿四頭筋腱を切断します。大腿動脈を避けながら、骨と大腿四頭筋の間のアポ神経症をゆっくりと切り取ります。

次に、大腿骨の起点で腱を切断して大腿四頭筋を解放し、大腿四頭筋を冷やしたPBSに配置します。はさみを使用して、大腿四頭筋の上にある目に見える脂肪組織をすべて取り除きます。きれいになったら、大腿四頭筋を裏返して、大腿骨を覆っていた筋肉の部分が上を向くようにします。

大腿四頭筋を鉗子で扇状に開きます。各葉から目に見える2つの赤い筋肉部分を取り除き、5ミリリットルの冷やしたミトコンドリアが入ったビーカーに入れます。分離バッファー。

次に、アキレス腱の上にある皮膚を先端の細いハサミで切り、マウスに向かって皮膚を剥がします。露出したアキレス腱を切断し、マウスの体に向かって筋肉をはがします。大腿骨の外側顆と内側顆の腱を切って腓腹筋を解放し、腓腹筋に付着した腓腹筋を冷やしたPBSで満たされた皿に入れます。

腓腹筋を裏返し、ヒラメ筋をはがします。ヒラメ筋を5ミリリットルの冷やしたミトコンドリアが入ったビーカーに入れます。分離バッファー。

次のファンが胃炎を開き、3つの視覚的な赤い筋肉の部分を取り除きました。2 つの外側部分と 1 つの内側表在性の赤い帯があります。分離したら、赤い筋肉を5ミリリットルの冷やしたミトコンドリアが入ったビーカーに移します。

分離バッファ 1。マウスのもう一方の脚からさらに75〜100ミリグラムの赤い筋肉を取り除きます。示したプロセスを繰り返します。

第2の脚から解剖した筋肉を、添付のテキストプロトコルに記載されているように調製したプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤カクテルおよび細胞溶解緩衝液を入れた1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに入れます。すぐにフラッシュし、2番目のサンプルを液体窒素で凍結して、ウェスタンブロッティングに使用します。大きなバケツの氷の上に、事前に修復された平らなプラスチックの表面を置きます。

次に、ミトコンドリア分離バッファー1をプラスチック表面に一滴注ぎ、ピンセットを使用して、切片化されたすべての赤い筋肉を分離液滴に入れます。バッファ。片刃のカミソリの刃を使用して筋肉組織を2分間ミンチし、40秒ごとに新しい鋭いカミソリに交換します。みじん切りにした組織を、5ミリリットルの新鮮なミトコンドリアが入った新しいビーカーに移します。

分離バッファ 1。次に、溶液を取り、50ミリリットルの円錐管に配置した100ミクロンのセルストレーナーに通します。繊細なタスクワイパーで組織を拭き取り、次に0.05%トリン溶液の5ミリリットルに移します。

ピンセットを使用して、タスクワイパーから残っている組織をすべて取り除き、トリプシンに追加します。氷上のトリプシン溶液で筋肉組織を30分間インキュベートします。次に、サンプルをGの200倍で摂氏4度で3分間遠心分離します。

遠心分離後、トリプシンスーミンを廃棄物容器に注ぎ、ペレットを3ミリリットルの氷冷ミトコンドリア分離バッファー1で再懸濁します。次に、組織を45ミリリットルのガラス製ホモジナイザーチューブに移します。15ミリリットルのコニカルチューブを別の1.5ミリリットルのミトコンドリア分離バッファー1ですすぎ、残りのサンプルを収集し、これをガラスホモジナイザーチューブに加えます。

次に、ガラスホモジナイザーチューブをビーカーまたは氷で半分満たされたプラスチック容器に入れます。そのため、ガラスホモジナイザーはビーカー内で最小限の動きをします。モーター駆動組織に付着したポリテトラフルオロエチレン乳棒でサンプルを均質化します。

80 RPMで10のホモジナイザー。各パスの底を約2秒間保持します。次に、組織ホモジネートを新しい15ミリリットルの円錐管に移します。

そして、ガラスホモジナイザーチューブを6.5ミリリットルのミトコンドリア分離バッファー1ですすいでください。残りの組織を含む15ミリリットルの円錐管に緩衝液を注ぎます。ホモジネート。サンプルをGの700倍で摂氏4度で10分間回転させた後、すくみ酸を高強度ガラス遠心チューブに静かに注ぎ、ペレットを廃棄します。

次に、スナットをGの8,000倍で摂氏4度で10分間回転させます。ミトコンドリアをペレット化するには、スナットを取り外し、500マイクロリットルのミトコンドリア分離バッファー2をゆっくりと加えてペレットを再懸濁し、ピペットチップの端を切り取り、混合および攪拌動作でバッファー内のペレットを穏やかに均質化します。次に、さらに4.5ミリリットルのミトコンドリア単離物を追加します。

混合物に2を緩衝するペレットが完全に懸濁された後、ホモジネートをGの8,000倍で4°Cで10分間回転させ、ミトコンドリアを再度ペレット化する。S上清を取り除き、25マイクロリットル刻みのミトコンドリア単離物を2つ追加して、ペレットを穏やかに、しかし完全に再懸濁します。緩衝液2は、そのポイントが切り取られたピペットチップを使用して、緩衝液の25マイクロリットルの各エディションの後にペレットを穏やかに攪拌し、混合します。

終了したら、このミトコンドリアストックを氷の上に置きます。ミトコンドリアストックを高純度の水で1〜20希釈するように2回に分けて作る。1つのサンプルにTriton 100 xの0.1%を加え、低い設定で10秒間超音波処理します。

もう一方の希釈液を氷上に残し、超音波処理したサンプルを氷に戻します。超音波処理後、次いで、標準的な技術を用いた測光アッセイを用いて、非超音波処理および超音波処理されたミトコンドリア希釈の両方を用いてクエン酸合成酵素アッセイを実施し、添付のテキストプロトコルで提供される式を用いて無傷のミトコンドリア膜の割合を決定する。ミトコンドリアをシンジケートすると、クエン酸シンターゼ活性が統計的に有意に増加します。

超音波処理されたサンプルと比較された非超音波処理されたミトコンドリアのサンプルのクエン酸シンターゼ活性は、ミトコンドリアの92.5%がgaの単離発現後に無傷であったことを示しています。 DHおよびCOX 4は、Cox 4の単離されたミトコンドリアの発現が観察される全組織溶解物で明らかです。GA DHのかすかなバンドのみが明らかですが、これらの知見は、分離手順中に非ミトコンドリア成分からの汚染がほとんどなく、良好なミトコンドリア分離を示しています。

この手順を試みるときは、ミトコンドリアストックを慎重に取り扱って、この手順に従ってミトコンドリアストックをボルテックスしたり激しく混合したりしないように注意することが重要です。反応性活性種の産生を測定するなどの他の方法を実行して、介入が単離されたミトコンドリアの活性酸素種の産生に影響を与えるかどうかなどの追加の質問に答えることができます。