微生物群集を学びます

本手順の全体的な目的は、個々の細菌と単一の真菌との間の相互作用を研究するためのモデルを構築することです。この手法は、クロストークや種間ダイアレクトに関与する要因など、病原体相互作用の分野における重要な疑問への回答に寄与します。本手法の主な利点は、このin vivoモデルから得られるデータが臨床的な関連性を有することです。

真菌を鼻腔内に接種するため、まず sterile PBS を用いて C.albicans を 2 × 10⁶ CFU/mL に希釈します。次に、成体低張性マウスの正立反射が消失したことを確認した後、200 µL ピペットで真菌懸濁液を 50 µL 以上吸引します。そして、片手でマウスを保持し、腹部が上を向くように動物を仰向けにします。

マウスを所定の位置に固定したら、マウスを保持している手の人差し指で頭部を支え、親指で顎を閉じた状態に保ち、ピペットチップを動物の鼻に近づけます。次に、50 µLの真菌液を鼻孔に慎重に滴下し、マウスの自然呼吸によって滴下液が吸入されるようにします。その後、完全に回復するまでマウスをケージに1匹で入れて管理します。

C.albicansの接種から4日後、安楽死させた動物の腹部を剃毛し、露出した皮膚をエタノールで滅菌します。次に、はさみを用いて胸骨から腹部中央にかけて皮膚を切開します。その後、正中線から肋骨に沿って切開線を広げ、胸部の両側の皮膚を折り返します。

肋骨が見えたら、胸部の両側から鎖骨に向かって垂直に切開し、胸骨を利用して前胸壁全体を後方に倒し、心臓と肺を可視化させます。次に、あらかじめヘパリン処理したシリンジを用いて、心室内動脈の隣から心臓を穿刺し、最低 500 µL の血液を採取します。採取した血液サンプルは氷上に置きます。

次に、頸部正中切開を行い、気管を露出させます。気管周囲の筋膜を慎重に剥離した後、気管の下に縫合糸を留置します。その後、20ゲージの改良ガバージュ針を用いて気管にカテーテルを挿入し、あらかじめ留置した縫合糸でカニューレを固定します。

気管支肺胞洗浄を行うには、氷冷したPBS 500 µLを肺内にゆっくりと注入します。次に、洗浄液を吸引し、氷上の2 mL遠心チューブに回収します。さらに500 µLのサンプルを2回分回収した後、胸部から肺を取り出し、肺の一部を1.5 mL遠心チューブに入れ、直ちに-80 °Cで保存します。

次に、あらかじめ重量を量っておいた、氷上のPBS入り溶血チューブに別の肺組織片を入れます。最後に、腹部の左側に切開を加え、脾臓を採取して1 mLのPBSが入った2本目の溶血チューブに入れ、チューブを氷上に置きます。

マウス1匹あたり5 × 10⁵ CFUのC.albicansを経鼻投与することで、4日間の持続性モデルを得ることができます。この4日間のうちに、マウスは体重が増加しますが、肺損傷は示しません。しかし、接種するCFUが増加すると、それに伴い肺損傷も悪化します。

最大レベルの肺損傷は、感染後24時間から36時間の間に観察されました。対照的に、細菌量（bacterial burden）は24時間ごとに1 log CFU/mL減少しますが、日を追うごとに累積的な細菌播種（bacterial dissemination）の増加が認められます。感染マウスから回収した気管支肺胞洗浄液（BALF）では、好中球が広範囲に動員されており、分画細胞数では、浸潤免疫細胞集団の90%が好中球、10%がマクロファージおよびリンパ球であることが示されました。

この手順に続き、気管支肺胞洗浄液の分析などの他の手法を実施することで、炎症反応の特性評価に関するさらなる疑問を解消することができます。このビデオを視聴することで、Pseudomonasの定着モデルの構築方法について十分に理解できたはずです。発光Candidaを用いる作業は極めて危険であるため、飛沫汚染を防ぐための保護具の着用などの予防措置を、本手順の実施中に常に講じることを忘れないでください。