Name: 血管細胞リモデリングの研究への応用生理学的および病理学的血流のインビトロモデル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-03T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 30 s
Description: 学ぶ血管内皮細胞における脈動性血流の影響を観察するインビトロモデル。ガラススライドの化学処理とタンパク質コーティングにより細胞接着を確保し、光学顕微鏡と免疫蛍光染色で形態変化とタンパク質発現を解析する。

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1.シラン化スライドの生体分子機能化やポリカーボネートメンブレン注：このプロトコル内化学物質やソリューションの多くは、高い蒸発速度（エタノール（エタノール）、アセトンなど ）を持っています。他のステップは、低蒸発速度のための長いインキュベーション時間を必要とします。パラフィンフィルムは、容器を密閉することをお勧めします。注意：（含む：硫酸、アセトン、（3-アミノプロピル）トリエトキシシラン、グルタルアルデヒド、エタノール）の化学物質の多くは、危険な、または揮発性と見なされます。使用前に適切な保管、取り扱い、および処分のための各材料の材料安全データシート（MSDS）を参照してください。 <ol><li>フルイマージョンを確保し、向きに関係なくきれいな、ガラススライド染色ディッシュ中に1ミリメートルによって50ミリメートルによって75ミリメートルを測定する新しいスライドガラスを配置します。ステップ1.1から1.12のコンテナを使用してください。 注：すべての後続のSTEために、50 mmの75 mmのサイズにカット0.4ミクロン孔サイズとの共培養のために、ポリカーボネートを含む（PC）膜PC官能とEC播種用のPS。 </li><li>硫酸（20％）、O / Nでスライドを浸します。 注意：使用前に硫酸のMSDSを参照してください。 </li><li> DIを毎回変更し、5分間、脱イオン水（DI）で3回浸漬することにより洗浄スライド。 </li><li> 30分間アセトン中でスライドを浸し。 注意：使用前にアセトンのMSDSを参照してください。 </li><li> 6％（3-アミノプロピル）トリエトキシシラン/アセトン溶液、O / Nでスライドを浸します。 注意：使用前に（3-アミノプロピル）トリエトキシシラン及びアセトンのMSDSを参照してください。 </li><li>アセトンを毎回変え、5分、3回、アセトンでスライドを浸します。 注意：使用前にアセトンのMSDSを参照してください。 </li><li> 、5分、3回のDIに浸漬するたびに、DIを変更することによって、スライドを洗浄します。 </li><li> 60分間1.5％グルタルアルデヒド/ DI溶液中でスライドを浸し。 注意：使用前にグルタルアルデヒドのMSDSを参照してください。 </li><li> 、5分、2回のDIに浸漬するたびに、DIを変更することによって、スライドを洗浄します。 </li><li>場所スライド無菌層流フード内で30分間、70％エタノール（EtOH）中に、S。 </li><li>エタノールを削除し、残った残留物が蒸発することができます。スライドを再水和するために、無菌DIとドレインでスライドを浸し。 注：スライドまたはPC膜をガラススライドホルダー中に密封し、一週間まで4℃で保存することができます。細胞培養に使用すると、繰り返しは1.10と1.11を繰り返します。 </li><li>スライドホルダーからスライドを削除し、層流フードでは100平方mmペトリ皿によって100ミリメートルにそれを置きます。 注：このコンテナには、残りのすべてのステップのために使用されます。 <ol><li>単一栽培実験のための内皮細胞播種のためのスライドまたはPCを準備します。 <ol><li>コー​​ト官能スライドやPC片側に1ミリリットルフィブロネクチン溶液（25μgの/ ml）で（ステップ1.11）、細胞培養室にさらされるおおよその領域をカバー。 </li><li> 1〜2時間、37℃に設定した滅菌インキュベーター内でスライドやPCをインキュベートします。 </li><li>インキュベーション後、GLAを使用して、残りの溶液を吸引真空に接続されたSSの吸引ピペット。 注：スライドは現在、将来の使用のために4℃でO / Nを格納することができます。 </li></ol></li><li>唯一のEC / SMC共培養を調製するための1.12.2の手順に従ってください。準備し、共培養実験のための平滑筋細胞（SMC）の培養を播種。 <ol><li> 50ミリメートル、外径を30mm、0.5mmの厚さ、およびフローチャンバーの真空に合わせ穿孔により50mmの内径75ミリの大きさで、スライド（ステップ1.11）の上にシリコンガスケットを置きます。 </li><li> 10％FBS / DMEM懸濁液中に1ミリリットルSMCを準備します。 7％NaHCO 3および7.4のpHを0.1 M NaOH溶液で2 mg / mlのコラーゲンI型の1 mlの溶液を中和し、そして2×10 6細胞/ mlの最終細胞密度SMCの懸濁液と混合します。 </li><li>ガスケット内SMC溶液を広げ、30分間、37℃、5％CO 2でスライドをインキュベートします。 </li><li>インキュベーション後、ダルベッコ改変で混合25 mlの0.1％ウシ胎児血清（FBS）でスライドをカバー72時間イーグル培地（DMEM）。 </li></ol></li></ol></li><li>スライドガラス/ポリカーボネート膜上で培養内皮細胞（EC）。 <ol><li>スライドガラスまたはポリカーボネート膜のフィブロネクチン表面上に6.0×10 5細胞/ mlの初期濃度と種子10％FBS / DMEM中の1ミリリットルのECを、。 </li><li> 37℃、5％CO 2インキュベーター中で細胞をインキュベートし、120分間、10％FBS。 </li><li> 37℃でインキュベーター中でさらに10％FBS / DMEMで細胞、および場所を含むカバースライド、5％CO 2、O ​​/ N、70％-80％コンフルエントになるまで。 </li></ol></li></ol>流体の粘度および体積流量の2決意注：回転粘度計は精密機器であり、粘度計のユーザマニュアルは、校正ゼロ、または測定を行う前に相談する必要があります。 <ol><li>実験の対象となる血管系の文献から所望の流体せん断（τ）を決定します。 </li><li> Measur回転式粘度計を使用して電子の1％FBS /（μ）DMEM粘度。 </li><li>ポアズイユの式から必要な体積流量（Q）を決定します。 <img alt="式（1）" src="/files/ftp_upload/53224/53224eq1.jpg" /> 、 ここで、τ=流体せん断、μ=粘度、Q =体積チャンバ幅W =流量、及びh =室の高さ）。 </li><li>設定ポンプステップ2.3で導出流量、およびそれ以降のすべてのステップのために使用します。 </li></ol>拍動指数の3決意注：システム内のすべての接続ポートは、適切なサイズのロック・リング・ツー・バーブ、または雌型ルアー・ツー・バーブ接続で接続する必要があります。接続PVCチューブは、その後、バーブ継手に接続することができ、回路を完成。 <ol><li>正しい流れ方向にチャンバー（ 図3）と超音波流量計を減衰して、 図2のように流れ回路を接続します。 注意：超音波流量計は、機器の敏感な部分である、とマニュアルには、使用前に相談する必要があります。 </li><li> （ポンプ）リザーバアウトレットチューブを確保することによって、DI水を用いて流れ回路とリザーバを充填リザーバ容積内に沈められます。流量計を用いた流量波形を視覚化します。 </li><li>流体/空気の体積比を変化させる減衰室に外気開放弁。閉じる異なる流体レベル間隔で大気開放弁と拍動指数（PI =（V マックス - V最小）/ V の平均）を計算流量波形のピーク（V max）を使用することにより、トラフ（V最小）、および（V 平均）を意味します。ノートブックのレコードのPI値。 </li><li>マークは、将来の使用のために傾けフェルト、永続的なインクのペンを使用して、減衰室の流体レベルとPIを生じました。病理文献11から目的のPIレベルを決定します。 </li><li>シリコンチューブFormation-オプション、拍動を制御する、より高度な方法<ol><li>異なる比（例えば、BASにシリコーンエラストマーベースと硬化剤を混合1〜36：10から電子への架橋剤の比率。1）に変化対象と弾性率のために、先に示したように2 </li><li>簡単に所定の塩基対架橋剤の比を有するシリコーンプレポリマー混合物中に鋼製カニューレ（14 G）を浸漬し、繰り返し浸漬硬化プロセスによってシリコンチューブを製造します。 </li><li> 4時間は、硬化プロセスの途中で方向を切り替える、カニューレ上のポリマーコーティングを硬化させるために60℃に設定したオーブン中に、プレポリマー被覆カニューレを配置します。 </li><li>同じシリコーンエラストマー混合物で浸漬法を繰り返し、〜厚さ0.3mmのチューブになり、さらに4時間、背面オーブン内に配置します。 </li><li>ステンレス鋼カニューレから極薄シリコンチューブを外します。 </li><li> 3.3のようにそれぞれのための代わり室を減衰させる回路、およびテストPIを流すチューブを接続します。 </li></ol></li></ol> 4.ポンプの滅菌<ol><li> 1フローチャンバー（ 図2）、PVCチューブ、及びガスケットを浸します0％の過酸化水素（H 2 O 2）。ステップ4の前に滅菌DIで洗います。 </li><li>予備のインキュベーターの棚の上の血液ポンプを配置します。 注：インキュベーターの棚はステンレス鋼であること、および全体の流れ回路の重量を支えることができるはずです。 </li><li> （ポンプ）リザーバアウトレットチューブを確実にすることによって、10％のH 2 O 2と流体回路とリザーバを充填リザーバ容積内に沈められます。上のUV光を層流フード中で20分間回路を介してポンピングすることによってH 2 O 2を循環させます 。 </li><li>すべて吸引チューブからH 2 O 2、およびフロー回路を通ってポンプで滅菌PBSで洗浄しました。 </li></ol> 5.フロー商工会議総会注：フローチャンバは、真空ポートと、入口および出口流れポート（ 図2を参照）、アクリル、特注のプレートから成ります。チャンバアセンブリは、培養スライドの上にフローチャンバーとガスケットを配置することで構成され、プロperly整列、および以下に記載されています。 <ol><li> 37℃の水浴中で1％FBS / DMEMをウォームアップし、フローチャンバーを準備します。 <ol><li> （ステップ1.13から）メディアのうち、ECスライドを取り、セル側を上にして上の場所ガスケット。 </li><li> （オプション）（ステップ1.13から）メディアのうち、PC膜を取り、セル側を上にして上の場所ガスケット。 PC膜の下にシードされたSMC（ステップ1.12.2）との共培養のスライドを置きます。 </li></ol></li><li>ガスケットの穴（ 図2）とフローチャンバーの真空チャネルを合わせます。 </li><li>真空へのメディアの漏れを確実にしない真空ポート（ 図2）に真空管を取り付けます。 </li><li>スプリングクランプ、フローチャンバーの各側に1つ（ 図2および図5）を用いてガラススライド及びクランプフローチャンバアセンブリの下に置きポリカーボネートシート。 </li><li>場所フロー37℃のインキュベーター内のシステムおよび5％CO 2、および低脈動で満たされた容器からポンプでメディアとの回路を埋めます。細胞をプレコンディショニングのために4時間のためにこの流れを維持します。 </li><li>所望の時間のためにマークPIレベル、および文化にダンピング室に流体音量を調整します。 </li></ol>

<ol><li>Scott-Drechsel, D., Su, Z., Hunter, K., Li, M., Shandas, R., Tan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+flow+co-culture+system+for+studying+mechanobiology+effects+of+pulse+flow+waves%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">A new flow co-culture system for studying mechanobiology effects of pulse flow waves.</a> Cytotechnology. 64 (6), 649-666 (2012).</li>
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</ol>

著者らは、開示することは何もありません。

このプロトコルは、in vitroでの拍動流を再生する方法を記載し、そして疾患の病理に流れ状態の寄与を決定するのに役立つ最初の工程であってもよいです。このプロトコルを使用して、以前の研究では、流れ状態は、血管炎症反応に寄与する発見した。さらに1、10、このプロトコルは、経験豊富な研究室のために意図されています。このように、いずれも深流体力学において、また生化学分析は、本明細書に記載されています。 。より高度な流体力学のために、1と高度な技術は、文献を参照してください長期間にわたって流体剪断下で細胞を培養することで2重要である：1）貯水池を除く、密閉された流回路を維持し、2）実験を通して汚染を防止します。流れ回路のシールは、所望のフローパラメータに影響を与える意図しない空気を導入して、メディアボリュームと正しいPIレベルを維持するために不可欠です。システムかもしれPにおける追加空気artially、ストリーム内の流れを妨げ、流路を妨害し、システム全体のコンプライアンスを高めます。体積流量が維持される一方で、局部的な速度で増加し、表面の不連...

心血管疾患の罹患率は、不健康な血管系に起因する多くは、アメリカで最大です。健康な動脈は、内皮細胞（EC）の単層でコーティングされたソフト腔表面に、弾性組織で構成されています。動脈流は、正の平均流量で振動波の関数としてモデル化することができます。拍動指数（PI）は振動の大きさの商と平均流（。。PI =（最大-最小）/平均値 ）で、1変数血管の弾力性とin vitroでモデル化された2動脈の弾力性は、フローのストレージ上で重要です。収縮期圧の下で拡張する心臓収縮のエネルギー、および血流PIの調節に重要な役割を果たしています。心臓が一貫、拍動、体積流量を維持するので、動脈の拡張は、流速、せん断応力、及びPIを減少させることにより流動性を高め、断面積を増大させます。弾力性に頻繁に、不健康な動脈存在変更またはコンプライアンス、血管リモデリングから補強、瘢痕組織または石灰化3、4が表示されます。加えて、新生内膜過形成（NIH）、5瘤および高血圧6および血管線維症4のような他の血管障害は、血管の直径を収縮することができます。しかし、現在の薬物治療、および血管疾患の治療装置は、多くの場合、多くの場合、血管の形態及び特性の変化によって複雑になる血管疾患における血管壁コンプライアンスまたは血流力学の重要性を無視します。どちらのバルーン血管形成術やステント留置術は、壁の弾力性7の合併症に答えます。したがって、血液の in vitroモデルは、動脈疾患と治療に起因する疾患の病理と治療の将来の有効性を検討する上で重要であるが流れます。本明細書において、我々はpathol血管疾患における細胞応答を決定するように設計生理学的および病理学的血流を複製する方法を記載オギース。流体の流れは、血管系内のすべてのセルに影響を与え、血管の健康に重要な機械的な信号である血管壁、でせん断応力が発生します。流体せん断のための血管内皮上のいくつかの機械式センサは内皮mechanosensing 8のための最近の研究で示さ一次繊毛を含む、同定されています。内皮細胞の活性及び形態は、流れの速度、方向、および脈動の影響を受けます。また、平滑筋細胞（SMC）移動は、間質液9を介して低速の流れのメカノ信号によって影響を受けることができ、また、流れおよびサイトカインを介して流量信号のメカノトランスダクションするためにそれらの応答を介して内皮細胞からのパラクリンシグナリングを通じてことができ10を解放します 。 「用量」の平均せん断、PIの依存性、およびパラクリンシグナル伝達はまた、相互に依存する場合があります。単層培養で変化 &quot;投与&quot;と流体せん断に対する血管細胞応答のこの目的のために、決意またはin vitroでの共培養は、血管リモデリングに機械的な洞察を提供し、病気や治療の予測を向上させることができます。この実験で使用されるフ​​ローシステムは、血液ポンプ、空気タンク、唯一実験中に使用される下流の流量計、下流の細胞培養、パラレルプレートフローチャンバー、およびメディアリザーバを減衰上流の流れから成ります。以下のような血流変数の制御は、流量平均、分当たりのビート、及びPIは、流量制御、パルス周波数、圧力減衰の導入によって達成され得ます。拍動血液ポンプは、体積流量、およびパルス周波数を意味するように直接関連して、制御されたストロークの周波数で、可変ストローク変位を用意しています。流れ回路内の空気タンクの導入は流れ振動の大きさを低減し、圧力減衰を可能にします。減衰チャンバ内の空気が流れ波から過剰な圧力があることをできるように、圧縮可能である一方でメディアは、非圧縮性流体であります空気圧縮により吸収されます。メディア比への空気は多くの減衰がどのように発生するかを制御することができます。幅50mmによって長さが75ミリメートルカスタム細胞培養フローチャンバーは、アクリルから作成されました。流れは、入口ポートを通って入り、入口マニホルドを通じて膨張し、フローチャンバーの全体一貫した流れを提供します。同様の流れと構造は、チャンバ出口に存在します。細胞は、官能化スライドガラス上に播種し、続いてフローチャンバーに取り付けられています。これは、簡単に研究した後に検索された大規模な集団を可能にします。共培養実験は、サイトカイン/フロー輸送を可能にしながら、培養の間、細胞間の接触を排除するために、多孔性ポリカーボネート膜を使用することができます。このシステムは、以前に病的に高いPI疾患に対する細胞応答を調査するため、10、高PIフローおよび内皮単層培養およびEC / SMC共培養1への影響をモデル化するために使用されてきました。これらのフローコンをモデル化するために使用するプロトコルを記述することによりditionsは、我々は、細胞応答への流れ信号の寄与を決定する際に他の人を支援したいと考えています。

<table><tbody><tr><td>アセトン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34850</td><td></td></tr><tr><td>硫酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320501</td><td></td></tr><tr><td>(3-アミノプロピル)トリエトキシシラン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>440140</td><td></td></tr>グル<tr><td>タルアルデヒド溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5882</td><td></td></tr>エ<tr><td>タノール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>459844</td><td></td></tr><tr><td>スライドガラス(70&#160;ミリメートルX 50&#160;mm)</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>CLS294775X50</td><td></td></tr><tr><td>ポリカーボネートメンブレン</td><td>ミリポア社</td><td></td><td></td>HTTP09030</tr><tr><td>シリコーンガスケット</td><td>Grace Bio-Labs</td><td>RD 475464</td><td></td></tr><tr><td>フィブロネクチン (25 &mu;g/ml)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>コラーゲンI型</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3867</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Fluka</td><td>36486</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5881</td><td></td></tr><tr><td>ダンピングチャンバー</td><td></td><td></td><td>このチャンバーはカスタムメイドで、Figure 3のエンジニアリング図面を使用してリクエストすることができます。</td></tr>ポリ<tr><td>炭酸ビニルの管</td><td></td>529552<td></td><td></td>の血液ポンプハーバードの器具 米国のプラスチック 65066、65063、65062 さまざまなサイズが必要な場合があります</tr><tr><td>ルアー接続</td><td>ノードソンメディカル</td><td>さまざまな</td><td>サイズが必要となり、交換用にいくつかの部品を購入する必要があります。</td></tr> <tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>カルチャーチャンバー</td> 自社<td>で機械加工された</td><td>カスタム</td><td>アクリルは、シート状に購入し、使用目的に合わせて機械加工することができます。Figure 2に示す設計図を使用して、このチャンバーを再現できます。</td></tr><tr><td>正方形のペトリ皿</td><td>コールパー</td><td>マーEW-14007-10</td><td></td></tr><tr><td>ガラススライドホルダー</td><td>キャピトルサイエンティフィック</td><td>WHE-900303</td><td></td></tr>胎児<tr><td>ウシ血清</td><td>Mediatech、Inc.</td><td>35-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコのモディファイドイーグル ミディア</td>ム<td>メディアテック株式会社</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>流量計</td><td>Sonotec、GmbH</td><td>Sonoflow co.55/060</td><td></td></tr><tr><td>Sylgardエラストマーキット</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>761036-5EA</td><td></td></tr><tr><td>14 G鋼カニューレ</td><td>一般研究所供給</td><td>S8365-1</td><td></td></tr></tbody></table>

血管細胞リモデリングの研究への応用生理学的および病理学的血流のインビトロモデル

In Vitro Model of Physiological and Pathological Blood Flow with Application to Investigations of Vascular Cell Remodeling

血管疾患は、米国内の死亡の一般的な原因です。ここで、我々は、血管疾患の病理に向けて流動力学の寄与を​​調べるための方法を提示します。壁の補強、瘢痕化、またはすべての流体の流量に影響を与える可能性があり、部分的狭窄、及び拍動流、または拍動指数の大きさにしばしば存在不健康な動脈。様々な流れ条件の複製は、血液ポンプの下流室を減衰流れ圧力を調整する結果です。閉じたフローシステム内の空気の導入は、ポンプからの脈動圧力を吸収する圧縮可能なメディアを可能にし、したがって、拍動指数を変化させます。本明細書に記載される方法は、単純に、高度に制御入力、および容易に測定結果を、再生されます。いくつかの制限は、システムで近似され、複雑な生理的なパルス波形のレクリエーションです。内皮細胞、平滑筋細胞、および線維芽細胞は、血流THRの影響を受けます動脈ウワーッ。血流の動的成分は、心拍出量および動脈壁のコンプライアンスによって決定されます。流動力学の血管細胞メカノトランスダクションは、サイトカイン放出および動脈内の細胞型の間のクロストークをトリガすることができます。血管細胞の共培養は、血管壁との機械的シグナルに対する血管応答における細胞間相互作用を反映して、より正確な画像です。流れの動的平均（または安定した）コンポーネントに対する細胞応答を含む流動力学の寄与は、したがって、疾患の病状および治療有効性を決定する上で重要な測定基準です。 in vitroでの共培養モデルを導入し、圧力がシミュレートされた心拍出量を生成する血液ポンプの下流に減衰を通して、種々の動脈疾患の病状を調査することができます。

流れ条件の維持は、フロー回路（ 図1）の正確な組立に依存しています。チューブの直径がより大きな直径を培養室の前後の流れ抵抗およびその後の圧力低下を低減することで、アセンブリ内の重要な選択です。意図された圧力と流速を確保するために、意図されたチューブを用いた実験の前に流量計を使用してシステムを組み立てます。培養チャンバの真空チャネルのアラインメント（ 図2）は 、シリコンガスケット（図示せず）で穿孔して、フロー回路内で密封保持します。シールを確実にするために、ばねクランプは、ガスケットに追加の圧力を適用するために使用することができます。ガラススライドは、チャンバ領域（ 図6）に合うようにカットし、ポリカーボネートシートで保護されるべきです。流速は、さらに、シールを維持するの合併症に寄与することができるので、メディアは、メディアの粘度を増加させるために、デキストランを添加することによって変えることができます。増加ヴィスコを通して性、流体剪断が低い速度に維持することができます。システムの応答性と整合性は、単に減衰室とリザーバ（ <strong...

このプロトコルは、疾患の病理における細胞応答を決定するのを助けるために、インビトロで生理学的または病理学的な血流を複製します。血液ポンプの下流ダンピング室の圧力を導入することにより、脈管構造を横切る血流が血管内皮または模倣共培養の単層上で要約し、課すことができます。

Vascular disease is a common cause of death within the United States. Herein, we present a method to examine the contribution of flow dynamics towards ...

本実験の全体的な目的は、さまざまな拍動流の病理学的状態が血管内皮細胞に及ぼす影響をin vitroで観察することです。まず、ガラススライドを化学的に処理し、タンパク質でコーティングすることで、血流にさらされている間も細胞が確実に付着するようにします。第2段階として、流れの拍動係数（pulsatility index）を決定し、in vitroでの流れを文献に記載されている値と比較できるようにします。次に、細胞を播種したスライドをフローシステムに接続し、流れの病理的状態に対する細胞応答を測定します。結果として、光学顕微鏡および免疫蛍光染色を用い、流れのプロファイルに基づいた形態およびタンパク質発現の変化が示されます。この手法のペリスタルティックポンプや拍動ポンプに対する主な利点は、フローの拍動性を調整して、疾患時の反応や健康時の反応を模倣できることです。これにより、動脈疾患分野における重要な疑問の解明に寄与します。まず、75 mm × 50 mm × 1 mm の新しいガラススライドを、清潔なガラススライド染色皿に入れます。次に、ガラススライドが完全に浸るまで20%硫酸溶液を加え、翌日まで一晩、酸溶液中でインキュベートします。スライドを新鮮な脱イオン水に5分間ずつ3回浸し、洗浄します。すすぎ後、スライドをアセトンに30分間浸し、その後、6% 3-アミノプロピルトリエトキシシランのアセトン溶液中で一晩浸漬させます。次に、純アセトンで5分間、アセトンを交換しながら3回スライドを洗浄します。続いて、脱イオン水で5分間、脱イオン水を交換しながら3回スライドを洗浄します。その後、スライドを1.5%グルタルアルデヒドに浸し、60分間そのままにします。架橋後、スライドを脱イオン水で2回洗浄し、洗浄ごとに脱イオン水を交換します。その後、スライドを70% ethanolに30分間浸し、滅菌します。ethanolを取り除き、スライドに残った残渣を蒸発させます。乾燥後、スライドを滅菌済みの脱イオン水に短時間浸して再水和させます。次に、スライドホルダーを取り出し、100 mm × 100 mmの正方形ペトリ皿に入れます。層流クリーンベンチ内で、細胞培養チャンバーに露出するおおよりの領域を覆うように、機能化スライドに25 µg/mLのフィブロネクチン溶液1 mLをコーティングします。その後、皿に蓋をし、スライドを37 °Cで1〜2時間インキュベートします。インキュベーション後、残った溶液を吸引し、10% FBS含有DMEM 1 mLに懸濁した600,000個の内皮細胞を、スライドのコーティング面に播種します。チャンバーに蓋をし、37 °C、5% CO2の条件下で120分間、細胞をインキュベートします。その後、細胞に培地を追加し、70〜80%コンフルエントになるまでインキュベートを継続します。付属のテキストプロトコルの記載およびここに示す通りにフロー回路を接続し、ダンピングチャンバーと超音波流量計が正しい流れの方向に配置されていることを確認してください。次に、フロー回路とリザーバーに脱イオン水を満たします。リザーバーの出口チューブがリザーバーの液中に浸かっていることを確認してください。その後、フローメーターを用いて血流波形を可視化します。ダンピングチャンバーの空気抜きバルブを開き、液体と空気の体積比を変更します。異なる液体レベルの間隔で空気抜きバルブを閉じ、拍動指数（pulsatility index）を算出します。指数の算出にあたっては、ピークをVM maxとして血流波形を評価してください。谷の部分は v min を表し、V mean は信号記録の平均値です。パルス指数（puls index）の値をノートに記録します。今後のために、結果として得られた液位と拍動指数（pulsatility index）を、フェルトペンなどの油性マジックでダンピングチャンバーに書き込んでおきます。フローチャンバーのウォームアップを準備しながら、付属のテキストプロトコルで参照されている病理学文献から、目的の拍動指数（pulsatility index）レベルを決定します。37 °Cのウォーターバス中で、1% FBSを添加したDMEMを使用します。細胞が70～80%コンフルエントになったら、培地から細胞コーティング済みのスライドを1枚取り出し、細胞が配置されている側にガスケットを載せます。次に、フローチャンバーの真空チャネルをガスケットの穴に合わせて配置します。その後、真空ポートに真空チューブを取り付け、培地が真空側へ漏れないようにします。ガラススライドの下にポリカーボネートシートを敷き、フローチャンバーアセンブリの短辺の両側に1つずつ、長辺に沿って2つのスプリングクランプで固定します。次に、フローチャンバー、入口および出口をフロー回路に接続します。フローシステムを37°C、5%二酸化炭素に設定したインキュベーター内に設置し、リザーバーに培地を満たして低拍動でポンプ注入し、回路内を予め温めておいた培地で満たします。この流れを4時間維持して、細胞をプレコンディショニングします。次に、ダンピングチャンバー内の液体量をあらかじめマークした拍動指数（pulsatility index）のレベルに調整し、細胞を所定の時間培養します。ここで示した血管内皮細胞は、無流、定常流、および拍動流の条件下で培養されました。高拍動流に24時間曝露した後、典型的な内皮細胞の形態から、より紡錘形に近い形態への変化が見られることがあります。一方で、静止状態および定常流では、形態にほとんど、あるいは全く差が見られません。また、ここではalpha smooth muscle actinおよびmyosin heavy chainのレベルが異なることで示されているように、高拍動流に曝露された内皮細胞との共培養は、平滑筋細胞にも影響を及ぼします。さまざまな流動条件下において、拍動流に曝露された細胞は、肥大と収縮能の指標となる両方のタンパク質を最も多く発現しました。この手順を行う際は、すべてのシールを維持し、手順後に液量が一定に保たれていることを確認することが重要です。細胞間相互作用などのさらなる疑問を解決するために、内皮細胞や血管細胞の共培養などの他の手法を実施することも可能です。このビデオを視聴することで、フロー回路の組み立て方法、インデックスの制御方法、および拍動流への血管内皮細胞の曝露方法について十分に理解することができます。

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

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