血管細胞リモデリングの研究への応用生理学的および病理学的血流のインビトロモデル

本実験の全体的な目的は、さまざまな拍動流の病理学的状態が血管内皮細胞に及ぼす影響をin vitroで観察することです。まず、ガラススライドを化学的に処理し、タンパク質でコーティングすることで、血流にさらされている間も細胞が確実に付着するようにします。

第2段階として、流れの拍動係数（pulsatility index）を決定し、in vitroでの流れを文献に記載されている値と比較できるようにします。次に、細胞を播種したスライドをフローシステムに接続し、流れの病理的状態に対する細胞応答を測定します。結果として、光学顕微鏡および免疫蛍光染色を用い、流れのプロファイルに基づいた形態およびタンパク質発現の変化が示されます。

この手法のペリスタルティックポンプや拍動ポンプに対する主な利点は、フローの拍動性を調整して、疾患時の反応や健康時の反応を模倣できることです。これにより、動脈疾患分野における重要な疑問の解明に寄与します。まず、75 mm × 50 mm × 1 mm の新しいガラススライドを、清潔なガラススライド染色皿に入れます。

次に、ガラススライドが完全に浸るまで20%硫酸溶液を加え、翌日まで一晩、酸溶液中でインキュベートします。スライドを新鮮な脱イオン水に5分間ずつ3回浸し、洗浄します。すすぎ後、スライドをアセトンに30分間浸し、その後、6% 3-アミノプロピルトリエトキシシランのアセトン溶液中で一晩浸漬させます。

次に、純アセトンで5分間、アセトンを交換しながら3回スライドを洗浄します。続いて、脱イオン水で5分間、脱イオン水を交換しながら3回スライドを洗浄します。その後、スライドを1.5%グルタルアルデヒドに浸し、60分間そのままにします。

架橋後、スライドを脱イオン水で2回洗浄し、洗浄ごとに脱イオン水を交換します。その後、スライドを70% ethanolに30分間浸し、滅菌します。ethanolを取り除き、スライドに残った残渣を蒸発させます。乾燥後、スライドを滅菌済みの脱イオン水に短時間浸して再水和させます。

次に、スライドホルダーを取り出し、100 mm × 100 mmの正方形ペトリ皿に入れます。層流クリーンベンチ内で、細胞培養チャンバーに露出するおおよりの領域を覆うように、機能化スライドに25 µg/mLのフィブロネクチン溶液1 mLをコーティングします。その後、皿に蓋をし、スライドを37 °Cで1〜2時間インキュベートします。インキュベーション後、残った溶液を吸引し、10% FBS含有DMEM 1 mLに懸濁した600,000個の内皮細胞を、スライドのコーティング面に播種します。

チャンバーに蓋をし、37 °C、5% CO2の条件下で120分間、細胞をインキュベートします。その後、細胞に培地を追加し、70〜80%コンフルエントになるまでインキュベートを継続します。付属のテキストプロトコルの記載およびここに示す通りにフロー回路を接続し、ダンピングチャンバーと超音波流量計が正しい流れの方向に配置されていることを確認してください。

次に、フロー回路とリザーバーに脱イオン水を満たします。リザーバーの出口チューブがリザーバーの液中に浸かっていることを確認してください。その後、フローメーターを用いて血流波形を可視化します。

ダンピングチャンバーの空気抜きバルブを開き、液体と空気の体積比を変更します。異なる液体レベルの間隔で空気抜きバルブを閉じ、拍動指数（pulsatility index）を算出します。指数の算出にあたっては、ピークをVM maxとして血流波形を評価してください。

谷の部分は v min を表し、V mean は信号記録の平均値です。パルス指数（puls index）の値をノートに記録します。今後のために、結果として得られた液位と拍動指数（pulsatility index）を、フェルトペンなどの油性マジックでダンピングチャンバーに書き込んでおきます。

フローチャンバーのウォームアップを準備しながら、付属のテキストプロトコルで参照されている病理学文献から、目的の拍動指数（pulsatility index）レベルを決定します。37 °Cのウォーターバス中で、1% FBSを添加したDMEMを使用します。細胞が70～80%コンフルエントになったら、培地から細胞コーティング済みのスライドを1枚取り出し、細胞が配置されている側にガスケットを載せます。

次に、フローチャンバーの真空チャネルをガスケットの穴に合わせて配置します。その後、真空ポートに真空チューブを取り付け、培地が真空側へ漏れないようにします。ガラススライドの下にポリカーボネートシートを敷き、フローチャンバーアセンブリの短辺の両側に1つずつ、長辺に沿って2つのスプリングクランプで固定します。

次に、フローチャンバー、入口および出口をフロー回路に接続します。フローシステムを37°C、5%二酸化炭素に設定したインキュベーター内に設置し、リザーバーに培地を満たして低拍動でポンプ注入し、回路内を予め温めておいた培地で満たします。この流れを4時間維持して、細胞をプレコンディショニングします。

次に、ダンピングチャンバー内の液体量をあらかじめマークした拍動指数（pulsatility index）のレベルに調整し、細胞を所定の時間培養します。ここで示した血管内皮細胞は、無流、定常流、および拍動流の条件下で培養されました。

高拍動流に24時間曝露した後、典型的な内皮細胞の形態から、より紡錘形に近い形態への変化が見られることがあります。一方で、静止状態および定常流では、形態にほとんど、あるいは全く差が見られません。また、ここではalpha smooth muscle actinおよびmyosin heavy chainのレベルが異なることで示されているように、高拍動流に曝露された内皮細胞との共培養は、平滑筋細胞にも影響を及ぼします。

さまざまな流動条件下において、拍動流に曝露された細胞は、肥大と収縮能の指標となる両方のタンパク質を最も多く発現しました。この手順を行う際は、すべてのシールを維持し、手順後に液量が一定に保たれていることを確認することが重要です。細胞間相互作用などのさらなる疑問を解決するために、内皮細胞や血管細胞の共培養などの他の手法を実施することも可能です。

このビデオを視聴することで、フロー回路の組み立て方法、インデックスの制御方法、および拍動流への血管内皮細胞の曝露方法について十分に理解することができます。