Name: 摘出葉のアッセイで双子葉雑草除草剤代謝の速度を測定します (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: 学ぼう、双子葉雑草の除草剤代謝速度を摘出葉アッセイで測定する方法。HPLC分析により正確な代謝率を定量化し、除草剤耐性メカニズムの解明に役立てます。

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私たちは、植物の成長と抽出の支援をしてくださったWendy Zhangさん、Austin Tomさん、Jacquie Janneyさん、Erin Lemleyさん、Brittany Janneyさん、クロマトグラフィー分析の支援をいただいたAnatoli Lygin博士、そして資金提供いただいたSyngenta Crop Protectionに感謝します。

1.植物材料、成長条件、および栄養クローニング注意：三waterhemp集団は、本研究で調査した。MCR（アダムス郡、イリノイ州から）、ACR、およびWCS（マクリーン郡、イリノイ州）から（ 表1）（ウェイン郡、イリノイ州から）。 <ol><li> 0.1グラムのL -1の寒天でwaterhempの種子を収集し、一時停止：発芽を強化するために、少なくとも30日間4℃の水溶液を。注：一部のwaterhemp集団が休止しているが、このステップは休眠を克服し、種子がより均一に発芽するために役立ちます。 </li><li>温室内のポッティング培地を含む12×12センチメートルトレイに（ 表1のように）各waterhemp集団の種子を発芽。 <ol><li> 16/8時間の光周期12内に 22分の28℃の昼/夜の温度で温室条件を維持します。 </li><li> 500マイクロモルmの最小値を提供するためにハロゲン化水銀ランプからの光が温室内で自然光を補足-2 </SUP&gt; 秒 -1プラントキャノピーレベルでの光子束。 </li></ol></li><li>彼らは温室では80 cm 3のポットに2センチメートル背が高いときには、移植苗を浮上しました。 </li><li> 1：1：ポッティングミックスの1：1混合土：ピート：砂の苗を4センチある950センチメートル3を含む3ポットに移植苗。各ポットに徐放性肥料顆粒5gのを追加し、この土壌の混合物と混合。 </li><li>頂芽優勢を排除は7センチの植物からの3つの最も若い葉を含む茎頂分裂組織をカットし、削除します。 注：この手順は、各植物がクローンするのに十分な3センチメートル腋窩の芽を育てることが保証されます。 </li><li>消費税5腋窩の芽（長さ3センチ）苗は、（ 表1のように）各waterhemp集団から約14センチです。さらに取り扱い時に水分の損失を低減するために、これらの腋窩の芽の葉の大部分を削除したが、移植時にさらなる成長を可能にするために2つの最も若い葉を保持しています。 <br/&gt;注：慎重に処理し、葉を削除するときに芽を損傷しないようにしてください。出資して各工場にラベルを付けます。 </li><li>移植腋窩は、発芽のために使用されるのと同じ媒体であるポッティング媒体に80センチメートル3ポット（1ポット当たり1苗）に撮影します。ポッティング媒体は、最初に飽和成長チャンバ内の根が形成されるまで、その根を確立するために、7日間成長チャンバー内の一定の水分と場所ポットを維持する必要があります。 注意：植物はこの時点で非常に敏感であり、強調されるべきではありません。 <ol><li> 16/8時間の光周期12内に 22分の28℃の昼/夜の温度で成長チャンバ条件を維持します。 </li><li>白熱灯や蛍光灯の組み合わせは、成長チャンバ内の光を提供するために使用することができ、少なくとも550マイクロモルのM -2プラントキャノピーレベル12で秒 -1光子束を実現する必要があります。 </li></ol></li><li> 950センチメートル3ポット（1ポット当たり1苗）のCに再び移植1：1：ポッティングミックスの1：1混合土：ピート：3 ontainingクローン化された植物を4センチあるときに砂を戻し、温室に移し、（また、5グラムの徐放性肥料顆粒を含みます）。 </li><li> （ すなわち、1.5から1.8までの手順を繰り返し、その後、2.1に進み）上記と同様の方法を用いて植物をもう一度複製します。典型的な時間経過の研究のために、各waterhemp集団から少なくとも6つの独立した植物からクローンを作製し、ラインMCR 1-6、1-6 ACRおよびWCS 1-6としてそれらを記録します。 <ol><li>実験を繰り返し、十分に各waterhemp集団内の遺伝的多様性を表現するために、少なくとも6つの異なる「親」クローン株を確立します。 </li><li>分析されますどのように多くの時間のポイントに応じて、経時的研究を行うために、各「親」クローン株から十分なサブクローンを生成します。 </li></ol></li></ol> 2.摘出Waterhemで代謝研究を実施p個の葉<ol><li>クローン化されたwaterhempの植物は除草剤の代謝及びDT 50分析のための背の高い10〜12センチメートルである場合には、サード最も若い葉（添付葉柄の0.5cmに含まれる長さ2〜3センチ）を切り出します。 </li><li>水の下で（葉柄0.3 CMが残っていることを保証する）は、第2回ずつwaterhemp植物から葉の葉柄をカットし、これらのカットは1.5ミリリットルにプラスチックバイアル（1バイアルあたり1枚の葉）15を終了置きます。 注意：水中で二時間をカットすると、形成し、木部血管を塞ぐから気泡を防ぐことができます。 <ol><li>まず、部分的に1時間、0.1MのTris-HCl（pHが6）のプレインキュベーション緩衝液（200μL）にカット葉柄で切除した葉を浸します。 </li><li>第二に、0.1 Mトリス塩酸（pHが6）に加えて、150μM[URL-14 C]除草剤のインキュベーション緩衝液（200μl）を含む新しい1.5ミリリットルバイアルに各リーフを移動し、1時間に28℃でインキュベート葉への除草剤の吸収を可能にします。 注：両方の14 C-メソトリオンと<s&gt; 14 C-プリミスルフロンメチル、最大約20 mCiのミリモルの具体的な活動に私たちの研究に使用した-1。拡散と木部蒸散ストリームを介して取り込みの両方が葉ごとに取り上げ除草剤の量に寄与する。 注：除草剤代謝に対する代謝阻害剤の効果は、ステップ2.2.1および2.2.2上記を変更することによって決定することができます。プレインキュベーション緩衝液に阻害剤の、100μMを添加し、2時間インキュベートさせ、その後、除草剤とのインキュベーションバッファに転送して、再度、100μMの阻害剤を追加します。例えば、マラチオンとtetcyclacisは、植物15-17で特定のシトクロムP450活性を阻害します。 </li><li>脱イオン水で切除された葉の浸漬部分を洗浄し、四分の一強ムラシゲ・スクーグ（MS）塩溶液（500μl）をそれぞれ0時間、5時間、11時間、23時間、または35時間、のために切除した葉を転送し、時間経過代謝研究のための成長室インチ</li></ol></li><li>休暇を除去することにより、収穫手動で適切な時点で、インキュベーション溶液からのSとは、ポリプロピレンチューブ（15 mL）およびガラス乳棒を用いて液体窒素中で各葉組織を挽きます。 </li><li>上記と同じポリプロピレンチューブ中の実験室の組織ホモジナイザーで90％のアセトンの7ミリリットルを各葉から放射性標識された除草剤とその代謝物を抽出します。 90％のアセトンをさらに7 mlの組織ホモジナイザーをすすぎ、そして組織が完全に粉砕されるまで均質化を続ける（通常約2分）。注：90％アセトンは、植物組織から、ほとんどの除草剤の抽出のために使用することができます。この方法は、吸収された放射性標識化合物の90％以上を取り出すことができない場合には、その後、90％メタノール、または90％のアセトニトリルを抽出溶媒として置換することができます。 </li><li>発生する追加の抽出を可能にするために、16時間で-4℃のラベル90％のアセトン（合計14ミリリットル）を抽出して保存します。 注：処理された葉のこの抽出後、抽出RADの量ioactivityは、処理した葉に吸収さ放射性標識化合物の少なくとも98％、典型的です。切除した葉の非抽出放射能（バインドされた残基）は、私たちの以前の研究12で全ての時点全体のわずか0.3％で平均が、この量を調べ使用除草剤および時刻に応じて変化することができます。 </li><li>遠心分離は10分間5000×gで試料を0.5 mlの最終容積が得られるまで、ロータリーエバポレーターを用いて40℃、上清を濃縮します。 2.0ミリリットルのプラスチックチューブにこのボリュームを転送します。 </li><li>植物の最終容量が1.25ミリリットルに抽出調整し、再遠心10,000×gで10分間、任意の微粒子を除去するために：（体積で1、1）水：アセトニトリルを追加します。 </li><li> （DPMμL-1）、液体シンチレーション分光法（LSS）12によって、各サンプルから採取したアリコート中の総放射能を測定し、量を正規化する（例えば、HPLC分析のために注入された化合物、10,00 [14 C標識]結果をグラフ時0総DPM /サンプル/ラン）ので、y軸は、サンプル間で均一になります。 </li></ol>切除した葉における除草剤代謝の3 HPLC分析注：以下のRP-HPLC条件12を使用して親除草剤や除草剤の代謝物に総抽出放射能を解決します。 <ol><li> 1ミリリットル分の流速で、C 18カラム （4.6×250ミリメートル、分析用HPLCのための5μmの粒子サイズ）で、RP-HPLCを行い-1ほとんどの非極性除草剤のために。 注：C 4またはC 12 RP-HPLCカラムは、その代謝物から親除草剤の分離を最適化するために使用することができます。プレカラムフィルターおよび/またはガードカラムも保護し、RPカラムの寿命を延ばすために使用されてもよいです。 <ol><li>溶離液A、水中0.1％ギ酸（v / v）であり、溶離液B 100％HPLCグレードのアセトニトリル：RP-HPLCは、以下の移動相を使用してください。 注：HPLCグレードのメタノールはエルとして使用することができuentのより極性の化合物および代謝産物を解決するためのBが、保持時間も変更される可能性があることに注意してください。 注：私たちの研究12での極性代謝物からメソトリオンまたはプリミスルフロンメチルを解決するために使用される溶出プロファイルは、次のとおりです。ステップ1、A：B（4：1、V / V）に：B（3：2、V / V ）の直線勾配（12分）で、ステップ2、A：B（3：2、v / v）にする：B（3：7、v / v）の直線勾配（5分）で、ステップ3、A：B（3：7、v / v）での：B（1：9、v / v）の（19分の合計を含む）、2分間の線形勾配。 注：勾配とアイソクラチックステップは、解像度を最適化するために、母材の物理的特性に基づいて調整する必要があります。 </li><li> B（1：9、v / v）での：直線勾配（3分）であり、A：B（1、V / V 4）：B（4：1、vで上記の線形勾配の手順に従ってください/ v）を少なくとも2分間のイソクラティック段階（）次のエキス12を注入する前にRPカラムを再平衡化します。 </li></ol></li><li>フローシンチで放射性標識化合物を検出し、視覚化しますllationアナライザ。時間経過中に各waterhemp集団における除草剤の代謝の速度を決定するために、（製造業者の説明書に従って、フローシンチレーションアナライザによって検出および定量）各試料中の全放射能の割合として各サンプルに残っている親除草剤の量を記録します。 </li></ol> 4.統計処理<ol><li>完全にランダム化された設計（または統計分析のための他の適切な配置）で治療を配置します。 </li><li>各実験のための3つの生物学的複製物から成る各処置、2つの独立した実験を行います。 2つの独立した実験では、合計で6生物学的複製が含まれています。実験の効果は有意でない（α= 0.05）である場合、それぞれの独立した実験からのデータを組み合わせて解析します。実験の効果が顕著である場合には、個別の実験を分析します。 注：私は最初の3つの生物学的複製物を含みますnは実験1と実験2の次の3つの生物学的複製物はそれぞれの生物学的複製は（MCR 1-6、ACR 1-6、およびWCS 1-6）各集団由来クローン株となるよう明確な「親」を表し、各タイムコー​​スの分析は、遺伝的に同一の植物を利用しています。 2つの独立した実験では、各waterhemp人口の中央値DT 50の遺伝的変異性と決意を十分に表現することが可能合計6生物学的複製が含まれます。 </li><li>非線形最小二乗回帰分析を用いてデータを分析し、DT 50を推定するために、単純な一次曲線でそれらをフィット。以下の式は、モデルについて説明します。 <img alt="式（1）" src="/files/ftp_upload/53236/53236eq1.jpg" /></li><li>このモデル yに時刻 tの残りの親除草剤の割合を表し、μiがそれぞれのために、DT 50ですwaterhempの人口は、I、およびパラメータC 0は、T = 0〜12で、親除草剤存在の推定量です。 </li></ol>

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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

本明細書中に記載の切除した葉の方法は、トウモロコシが15を残すにプリミスルフロン代謝の研究で以前に使用されてきたが、我々の結果は、このプロトコルはまた、双子葉雑草種12に除草剤の代謝を測定するための、効果的かつ正確で再現性があることを示しています。全植物の研究と比較して、切除した葉の技術の主な利点は、切除された葉が発芽後の全植物転パターン、全身の除草剤または植物または集団間の除草剤の取り込みの違いとは無関係であることです。切除した葉のアッセイは、温室条件下で成長させた植物全体を研究と比較して、試験管に入れ、単一の葉に、成長チャンバー内で実施されるのでさらに、環境変動が低減されます。栄養クローニング戦略も内の遺伝的分散の大きな度合いを最小限にし、なるようにMCR 12にメソトリオン耐性メカニズムを研究するための私達の方法に含まれていましたトゥイーンアマランサス集団 9。雑草アマランサス集団内の遺伝的多様性は、発芽後除草剤18のいくつかの家族に、全プラントの応答に記載さ変動の量によって示されていま...

雑草除草剤抵抗性は食料や繊維1,2のグローバル生産に深刻な脅威を提示します。現在、世界中で百以上の雑草種から耐性個体群と生物型の何千もの文書化され、3を検討されています。植物に除草剤耐性を付与する主要なメカニズムは、ターゲットサイトの遺伝子2の除草剤-タンパク質結合動態または増幅に影響を与える遺伝子変異を含む除草剤の標的部位の遺伝子やタンパク質の変化です。シトクロムP450モノオキシゲナーゼ（P450）またはグルタチオン Sトランスフェラーゼ（GST）酵素の上昇活動を介した代謝解毒は、ターゲット・サイトベースのメカニズム2からいくつかの点で異なっているれ、雑草に除草剤耐性を付与する別のメカニズムです。代謝系の抵抗は（フィットネス罰則別名 ）植物の適応度コストは除草剤耐性mechanisから生じ得るかどうかに大きな影響を持っていますメートルだけでなく、雑草集団1,2,4におけるクロスまたは複数の除草剤耐性を付与するための単一の解毒メカニズムの可能性について。一般に、植物における除草剤の代謝は、3つの異なるフェーズ5に分割することができます。増加の極性と部分除草剤解毒5,6につながる、またはO-脱アルキル化反応-第I相は、芳香環またはアルキル基のP450媒介ヒドロキシル化、 または Nなどによる除草剤の変換や活性化を含みます。フェーズで新たに導入された官能基私のGSTによって還元型グルタチオンとの結合のための結合部位を提供することができますまたはフェーズII 5,7にUDP依存の糖転移酵素によってグルコースに。例えば、トウモロコシにおけるプリミスルフロンメチルの主要な初期の代謝物は、さらにヒドロキシプリミスルフロングルコシドする（フェーズII）を代謝して、長期保存またはさらなる代謝のための液胞に輸送することができるヒドロキシプリミスルフロンメチル8であり、プロcessing 5,6（フェーズIII）。 Waterhemp（ アマランサスのtuberculatus）は、米国で（ チョウ目害虫抵抗性ワタ ）難コントロールトウモロコシの生産（ トウモロコシ）を妨げ、双子葉植物の年間雑草種、大豆（ ダイズ ）、綿です。 waterhempの遺伝的多様性の高度は、雌雄異株の生物学と長距離風受粉によって促進され、1つの女性waterhemp工場は百万種子9まで生成することができます。これらの種子は、自然に効果的な分散機構をwaterhempを付与する、小型で容易に広がります。 Waterhempは生育期9を通して連続発芽が表示され、その種子は休眠の数年後に発芽することができます。 Waterhempは耕地作付体系10の中で最も広葉雑草よりも高い成長率を有しているC 4植物です。加えて、多数のwaterhemp集団は、複数のFAMに耐性であります除草剤3のilies。 イリノイ州からwaterhemp（MCR指定）の人口は、4-ヒドロキシフェニルピルジオキシゲナーゼ（HPPD）などメソトリオンなど-inhibiting除草剤11、だけでなく、アトラジン及びアセト乳酸合成酵素（ALS）に、除草剤を-inhibitingプリミスルフロンメチルを含むことに耐性があります、非標的サイトベースのメカニズム12,13に起因します。アトラジン耐性が、メソトリオンに敏感であり、プリミスルフロンメチルをに敏感である、WCS 14指定waterhemp人口（によるALS遺伝子の変異に）プリミスルフロンメチル抵抗性があるACR 14指定waterhempの異なる人口、メソトリオン、及びアトラジンは、事前の研究12と現在の実験におけるMCRとの比較に使用した（ 表1に要約 ）。初期の研究は、MCRに、HPPD遺伝子配列または発現レベル、または減少しメソトリオンの取り込みの変化を検出しませんでしたメソトリオンに敏感な集団12と比較して人口。しかし、植物全体での代謝試験は、11,12メソトリオンするために、前の表現型応答と相関ACRおよびWCS、と比較してMCRの親メソトリオンの除草剤の有意に低いレベルを示しました。 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Waterhemp人口 </td><td> 略語 </td><td> メソトリオンの表現型 </td><td> メソトリオン耐性機構 </td><td> プリミスルフロンの表現型 </td><td> プリミスルフロン抵抗性機構 </td></tr><tr><td>マクリーン郡耐性</td><td> MCR </td><td>耐性</td><td>代謝* </td><td>耐性</td><td>代謝作用</td></tr><tr><td>アダムズ郡耐性</td><td> ACR </td><td> Sensitアイブ</td><td> - </td><td>耐性</td><td> ALS 14における標的部位の突然変異</td></tr><tr><td>ウェイン郡感受性</td><td> WCS </td><td>敏感</td><td> - </td><td>敏感</td><td> - </td></tr></tbody></table> *強化代謝以外の非標的部位の耐性機構は、また、MCR集団12メソトリオン耐性を付与することができます。 表1：本研究で用いたイリノイ州からwaterhemp集団の説明。 そのままwaterhemp苗に除草剤の代謝の速度を決定することに加えて、別の実験的なアプローチを切除waterhemp葉アッセイ12だけでなく、様々なP450 阻害剤（例えば、tetcyclacisとマラチオン）を使用して代謝を調査するために私たちのこれまでの研究で開発し、採用しました。この方法は、previからwaterhempのために特別に適応されました切除した葉のアッセイは、まだ双子葉植物に除草剤の代謝研究を行うために報告されていなかったため、切除したトウモロコシにおけるプリミスルフロンメチル代謝のOUの調査は、15を残します。 organophophosate殺虫剤マラチオンはしばしばP450の関与16を示すために 、インビボおよびインビトロ除草剤代謝研究に使用されてきました。例えば、トウモロコシにおける寛容とメソトリオンの急速な代謝がマラチオンがメソトリオン17にトウモロコシの感度を増加させた際に確認されたP450-触媒リングヒドロキシル化、によるものです。同様に、マラチオンは15を残し切除したトウモロコシにALS阻害プリミスルフロンメチルの代謝を阻害しました。切除した葉の技術の主な利点は、生成されたデータは、植物における全身、発芽後除草剤の代謝を評価する際に考慮すべき重要な要因全植物転パターンとは無関係であるということです。したがって、この方法は、定量可能と定性的な代謝は、単一の処理した葉12に注力して分析します。 栄養クローニング戦略は、切除された葉のプロトコルと組み合わせて、以前に代謝試験12を実施する waterhemp利用しました。他殖のwaterhemp（男女別の植物）の性質、および雌雄異株アマランサスの種内の遺伝的多様性の大幅9に、このプロトコルは、遺伝的に同一waterhempの苗は、時間経過実験内で分析されたことを確実にしました。この記事では、双子葉雑草（waterhemp）で除草剤代謝の速度を測定するための切除した葉の方法の有用性を示します。親の除草剤の量は、（吸収された除草剤の50％が分解する時間を推定するために、単純な一次曲線でフィッティングし、非線形最小二乗回帰分析によって、各時点（ 図1）で決定し、そして残りましたDT 50）。代表的な逆相高速液体クロマトグラフィー（RP-HPLC）のクロマトグラムは、親の除草剤及び経時試験中の極性代謝物（単数または複数）の同時形成（ 図の消失を示すALS耐性および感受性waterhemp集団のために表示されています2）。私たちの記事の焦点は中に均一にリング標識（URL-14 C）除草剤を使用し、説明し、双子葉植物における除草剤の代謝の正確で再現率を決定するための栄養クローニング法との組み合わせで切除された葉のアッセイの有用性を実証することです彼らの全体のプラントHPPD-への対応と、ALS阻害除草剤（ 表1）が異なる3 waterhemp集団。

<table><tbody><tr><td>寒天</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1296</td><td>種子の発芽前用</td></tr><tr><td>ポッティング メディウム</td><td>サン グロ 園芸</td><td>49040233</td><td>植物成長用</td></tr><tr><td>ニュートリコート</td><td>アグリバート&nbsp;</td><td>TOTAL BLEND 13-13-13 T100</td><td>徐放性肥料</td></tr><tr><td>成長チャンバー E15</td><td>制御環境限定</td><td>20207</td><td>植物培養</td></tr><tr><td>トリスベース</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP152-500</td><td>切除葉用バッファー</td></tr><tr><td>HCl (濃縮)</td><td>フィッシャーサイエンティ</td>フィック <td>A144500</td><td>バッファーのpHを調整します</td></tr><tr><td>村重とスクーグ (MS) 塩&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0404</td><td>切除された葉のインキュベーション</td></tr><tr><td>メタノール</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>A452-4</td><td>葉はインキュベーション後に洗浄されます</td></tr><tr><td>アセトン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>179124 植物抽出</td></tr><tr><td>アセトニトリル (HPLC グレード)</td><td>マクロン ファイン ケミカルズ</td><td>MKH07610</td><td>HPLC 移動相</td></tr><tr><td>ギ酸&nbsp;</td><td>マリンクロット分析</td><td>MK259205</td><td>移動相pHを酸性化する</td></tr><tr><td>マイクロ遠心分離機</td><td>エッペンドルフ</td><td>5417R</td><td>1.5または2.0mlチューブ</td></tr><tr><td>遠心分離機(温度制御)</td><td>エッペンドルフ</td><td>5810R</td><td>15または50mlチューブ</td></tr><tr><td>ポリプロピレン遠心分離チューブ</td><td>コーニング株式会社</td><td>430790</td><td>15 ml、滅菌</td></tr><tr><td>ロータリーエバポレーターB</td><td>&Uuml;CHI</td><td>R200</td><td>濃縮植物サンプル</td></tr><tr><td>液体シンチレーション分光法(LSS)</td><td>Packard Instruments</td><td>104470</td><td>定量化 14C</td></tr><tr><td>高速液体クロマトグラフィー</td><td>パーキン・エルマー</td><td>除</td><td>草剤代謝物N2910401分解</td></tr><tr><td>フローシンチレーションアナライザー&nbsp;</td><td></td><td>14C</td><td></td></tr> <tr><td>Hypersil Gold C18</td>カラムのHPLC分析用LabLogicシステム1103303<td>サーモサイエンティフィック</td><td>03-050-522&nbsp;</td><td>逆位相</td></tr><tr><td>Ultima-Flo M カクテル</td><td>Perkin Elmer</td><td>6013579</td><td>フローシンチレーションアナライザー</td></tr>用 <tr><td>シンチレーションカクテル (ScintiVerse BD)</td><td>Fisher Scientific</td><td>SX18</td><td>for LSS; 生分解性</td></tr><tr><td>ラボ用ホモジナイザー</td><td>キネマティカ</td><td>CH-6010&nbsp;</td><td>葉のサンプルを均質化</td></tr></tbody></table>

摘出葉のアッセイで双子葉雑草除草剤代謝の速度を測定します

Measuring Rates of Herbicide Metabolism in Dicot Weeds with an Excised Leaf Assay

偏交配双子葉植物の雑草、ウォーターヘンプ(Amaranthus tuberculatus)の除草剤代謝速度を分離し、正確に決定するために、除草剤の取り込みを正常化し、除草剤耐性(R)および感受性(S)ウォーターヘンプ集団の寄与因子としての転座を除去するための栄養クローニング戦略と組み合わせた切除葉アッセイを開発しました。 植物中の有機農薬のバイオキネティック解析には、通常、取り込み、転座(標的部位への送達)、代謝運命、および標的部位との相互作用の決定が含まれます。 除草剤の代謝は、除草剤抵抗性雑草や除草剤耐性作物で測定する重要なパラメータであり、通常、放射性標識除草剤を使用した全植物試験で達成されます。 しかし、全植物法に由来するバイオキネティックパラメータの解釈における1つの困難は、極性代謝産物は通常、除草剤の解毒反応後に植物内で移動しないため、転座は除草剤代謝の速度によってしばしば影響を受けることです。この原稿に記載されているプロトコルの利点には、RおよびS集団における除草剤分解速度の再現性、正確、迅速な決定、消費される放射性標識除草剤の量の大幅な減少、さらなる取り扱いと廃棄を必要とする放射性標識植物材料の大幅な減少、および温室の代わりに実験室または成長チャンバーで放射性標識除草剤実験を行う能力が含まれます。 除草剤耐性が世界中の双子葉雑草集団で発生し広がり続けるにつれて、本明細書で開発および記載されている切除葉アッセイ法は、除草剤の代謝および解毒の高められた速度による非標的部位ベースの耐性を調査するための非常に貴重な技術を提供するであろう。

メソトリオン代謝率の大きな違いは、WCSまたはACRとMCR（図1）のいずれかとの間で検出されました。各時点で、MCRはより迅速に、以前の全植物の表現型応答11と相関する2メソトリオンに敏感な集団、WCSおよびACR、よりメソトリオンを代謝していました。各集団からの単一の親植物から十分な植物をクローニングすることによって、除草剤代謝の経時的分析は、原因で、各時間コース12内の遺伝的多様性の欠如に均一で再現可能です。例えば、クローン株5 12でメソトリオン代謝の時間経過を図1に表示されます。6異なるクローン株の合計を、6つの個別の親植物由来、各集団（ 表1）から分析した全体の中央値DTを決定するために、 MCRにそのメソトリオン代謝を示した50値は、大幅に高速化しました（ <eすなわち、mは&gt;、ACRまたはWCS 12よりも短く、DT 50値）を有していました。また、切除した葉を持つ我々の以前の研究では...

この原稿は、除草剤の代謝率が双子葉植物の雑草から切り出された葉で効果的に定量化され、それによって変動性を減らし、全植物アッセイで一般的に観察される除草剤の取り込みまたは転座の可能性のある交絡効果を取り除く方法を説明しています。

In order to isolate and accurately determine rates of herbicide metabolism in an obligate-outcrossing dicot weed, waterhemp (Amaranthus tuberculatus), we ...

この手順の全体的な目的は、切り離し葉アッセイを用いて、アマガヤモ（dichot weed）における除草剤代謝を測定することです。まず、温室および育成チャンバーでアマガヤモの個体群を播種し、クローンを作成します。次に、切り離したアマガヤモの葉を放射標識除草剤とともにインキュベートし、タイムコース研究を行います。次に、インキュベートした葉から除草剤とその代謝物を抽出します。最終ステップは、逆相高速液体クロマトグラフィーによる除草剤およびその代謝物の分析です。最終的に、この切り出した葉を用いたアッセイは、異なる雑草集団または種における除草剤代謝の正確な速度を決定するために使用されます。この手法、あるいは葉や個体全体に放射標識した除草剤を滴下するなどの既存の手法の主な利点は、遺伝的に同一または均一な苗を用いて、独立した解析または個体全体の転流解析が行える点にあります。この手法は、雑草における除草剤耐性メカニズムや作物における除草剤耐容メカニズムの解明など、植物生化学分野における重要な課題の解決に寄与します。本ビデオでは、HPRCの手順について実演します。当研究室の大学院生であるSkeletonが準備を行い、アマランサスの種子を回収し、水性オーガー培地に懸濁させました。その後、種子の休眠を打破して発芽率を向上させるため、種子を同培地中で4 °Cで30日間以上保存しました。準備が整った種子を、日長16時間、昼間温度28 °C、夜間温度22 °Cの温室内で発芽させました。12 by 12 centimeterのトレイに入れた種子に、水銀合金ランプを用いて500 micromoles per square meter per secondの光子束で補光を行います。実験的なばらつきを排除するため、キャノピーレベルで各個体群から6株の苗をクローンとして選抜します。苗が2 centimetersの高さに達した時点で、80 CCポットに移植します。苗が4 cmの高さになったら、培養土、ピート、砂を3:1:1の割合で混合した土を用意します。この混合土を950 ccのポットに入れ、各ポットに5 gの緩効性肥料粒剤を加えます。その後、苗を1ポットにつき1本ずつ移植します。植物の高さが7 cmに達したら、頂端優勢を排除し、クローニングに必要な腋芽を十分に確保するため、最も若い3枚の葉を含む茎頂部を切り取って除去します。その後、植物が14 cmに達したら、本研究に使用する各アシタベ（water hemp）集団から、長さ3 cmの腋芽を5本ずつ切り出します。水分損失を最小限に抑えるため、移植後のさらなる成長を可能にするために最も若い2枚の葉だけを残し、採取したシュートからほとんどの葉を取り除いてください。次に、各シュートを、発芽に使用したものと同じ培養土を入れたA D CCCポットに移植します

measuring-rates-herbicide-metabolism-dicot-weeds-with-an-excised-leaf

Research

JoVE Journal

Environment

環境

我々は、葉の通水コンダクタンスの同時測定のための比較的急速（30分間）と現実的な方法を説明する（...

蒸発フラックス法（EFM）を使用した照度と脱水に葉の通水コンダクタンスと気孔コンダクタンスとその応答の測定

このビデオでは、線虫に対する低分子殺線虫剤の有効性を特定するためのスクリーニングアッセイを実演します。殺線虫剤は、ばく露後に試料中の移動性線虫の数を減少させる場合に有効であると考えられています。...

低分子殺線虫剤スクリーニングアッセイ:Ditylenchus dipsaciに対する潜在的な殺線虫剤をスクリーニングするための中スループット法

雑草集団における除草剤耐性を確認するための堅牢で柔軟なアプローチが提示されます。このプロトコルにより、除草剤耐性レベルを推測し、わずかな適応で幅広い雑草種や除草剤に適用することができます。...

別の雑草種の堅牢な除草剤抵抗性試験のためのプロトコル

病原体の成長の定量化は、様々なシロイヌナズナ(以下:シロイヌナズナ)の免疫応答を特徴づける強力なツールです。ここで説明する方法は、Pseudomonas syringae...

使用した植物防御応答のファインキャラクタリゼーションのための細菌の葉浸潤アッセイ<em&gt;シロイヌナズナシュードモナスシリン</em&gt; Pathosystem

リーフ スプレー質量分析: 植物組織由来の代謝産物を直接評価するの急速な周囲のイオン化法

提示された方法は、ジャガイモの剥離葉にマンドゥカセクスタ幼虫の適用を通じて自然な手持ちの損傷植物組織を作成します。植物組織は、昆虫のハーブに対する早期応答に関与する6つの転写因子ホモロの発現のためにアッセイされる。...

噛む昆虫マンドゥカセクスタによる侵入時のジャガイモの遺伝子発現研究を簡素化する剥離葉アッセイ

本研究では、殺虫剤などの植物全体が取り込むことができる外部化合物の代謝を調べることができる茶(カメリア・シネンシスL.)葉に由来する細胞懸濁培養を確立するためのプロトコルを提示する。...

茶由来の新たに確立された細胞懸濁液培養における6種の全身殺虫剤の代謝に関する研究(カメリアシネンシスL.葉

本プロトコルは、植物中の2,4−ジブロモフェノール代謝産物を同定するための簡単で効率的な方法を記載する。...

植物における2,4-ジブロモフェノールの代謝を解明

このプロトコルは、植物中のトリアゾール系農薬の代謝産物の総合的な細胞毒性を評価する新しい方法を説明しています。...

植物における典型的なトリアゾール系農薬の代謝産物の細胞毒性の評価

このプロトコルは、同じサンプル内で植物イオン漏れ、ペルオキシダーゼ活性、カロース生成を評価するためのハイスループットアプローチを記述しています。...

高スループット形式を用いた微生物二次代謝物に対する葉の応答評価

学ぼう、双子葉雑草の除草剤代謝速度を摘出葉アッセイで測定する方法。HPLC分析により正確な代謝率を定量化し、除草剤耐性メカニズムの解明に役立てます。

摘出葉のアッセイで双子葉雑草除草剤代謝の速度を測定します

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