エンジニアクォーラム焼入れラクトナーゼを使用して、病原性バイオフィルムの抗病原性破壊

この実験の全体的な目標は、細菌のバイオフィルム破壊におけるクォーラムクエンチング酵素の有効性を実証することです。この方法は、抗菌治療薬の分野における重要な質問に答えるのに役立ち、バイオフィルム環境内の病原菌に対するクォーラムクエンチングラクトナーゼの効果を理解するのに役立ちます。この手法の主な利点は、クォーラムクエンチングラクトナーゼをin vitro環境で直接添加できることです。

したがって、バイオフィルムの破壊に対するその影響は容易に定量化されます。この手順を実演しているのは、私たちの研究室の技術者であるTerrence Tayです。まず、A.baumannii S1の5ミリリットル培養物をLBのLBで摂氏30度で16時間培養します。

カルチャを OD 600 0.8 に調整します。次に、精製されたGKL酵素のミリリットルあたり4ミリグラムを含む新鮮なLBを使用して、培養物を100に希釈します。そして、96ウェルプレートのウェルに100マイクロリットルを追加します。

蓋でプレートを覆い、10リットルのプラスチック容器に入れます。容器を密封し、30°Cで3時間インキュベートしてから、培地を静かに取り出します。さらに100マイクロリットルの新鮮なLB培地をウェルに加え、プレートを摂氏30度で21時間インキュベートします。

培地をやさしく取り除いた後、200マイクロリットルの滅菌水を使用して、プランクトン性細菌細胞をやさしく洗います。ピペットチップをウェルの底に置き、液体媒体を慎重に取り出して、空気と液体の界面の間のバイオフィルムの異物への摂動を最小限に抑えます。次に、100マイクロリットルの1%クリスタルバイオレット溶液を各ウェルに加え、室温で15分間インキュベー

200マイクロリットルの滅菌水を使用してウェルを3回洗浄することにより、クリスタルバイオレット溶液を取り出します。各ウェルに100マイクロリットルの33%酢酸を加え、15分間穏やかに振とうしてインキュベートして色素を溶解します。600ナノメートルのクリスタルバイオレットの吸光度を測定することにより、バイオフィルムの量を定量します。

クリスタルバイオレットの量は、形成されるバイオフィルムの量に比例します。A.baumannii S1バイオフィルムの共焦点レーザー走査型顕微鏡(CLSM)を実施するには、A.baumannii S1の5ミリリットル培養物をLBで摂氏30度、振とうインキュベーターで16時間培養します。A.baumannii S1 のカルチャを OD 600 0.8 に調整します。

次に、精製GKL酵素の1マイルあたり1.2ミリグラムを含む新鮮なLBを使用して、培養物を1〜100に希釈し、35ミリリットルのガラス底マイクロディッシュに1ミリリットルを加えます。マイクロディッシュに蓋をして10リットルのプラスチック容器に入れ、密封してから、ディッシュを摂氏30度で3時間インキュベートします。培地を静かに取り除いた後、30マイクロリットルの精製GKL酵素を含む新鮮な培地1ミリルターを加え、摂氏30度でさらに21時間インキュベートします。

もう一度培地を静かに取り出し、新鮮な培地で別の1ミリリットルのGKL酵素と交換します。摂氏30度で24時間インキュベートします。インキュベーション後、培地を静かに取り出し、HBSSに溶解したAlexa Fluor 488共役小麦胚芽凝集素を5ミリリットルあたり500マイクロリットル加えます。

マイクロディッシュを摂氏37度で30分間インキュベートし、バイオフィルムを染色します。バイオフィルムを固定するには、HBSSに溶解した3.7%ホルムアルデヒドを500マイクロリットル加え、摂氏37度で30分間インキュベートします。2ミリリットルのHBSSを使用してマイクロディッシュを一度洗浄し、溶液を完全に取り除きます。

CLSMイメージングの前に、皿を摂氏4度の暗所で保管してください。CLSMのイメージングと解析では、63倍の対物レンズを使用して、スタックあたり0.21ミクロンの間隔で画像あたり97スタックを生成します。クリスタルバイオレット定量実験では、野生型GKLと改良型GKL二重変異クォーラムクエンチング酵素を用いて、A.baumaniiが使用する主要なクォーラム分子である3つのヒドロキシデカノイルlホモセリンラクトンまたは3OHC10HSLに対するラクトナーゼ活性を行いました。S1.As、両酵素は前処理した野生型A.baumanii S1のバイオフィルム形成を大幅に低減することができました。両酵素によるバイオフィルムの破壊の程度は、3OHC10HSLに対するそれらの有効性に比例しません。

この表に見られるように、変異型GKLのターンオーバー率は、3OHC10HSLに対して野生型GKLの6倍速いです。しかし、酵素間のバイオフィルムの破壊の程度の違いは2つしかありません。この実験では、改良されたGKL変異酵素とそのカテカシス不活性酵素を比較に使用しました。

このDIC画像は、改良されたGKL変異酵素による処理により、不活性酵素と比較してバイオフィルムサイズが減少したことを示しています。蛍光画像の解析により、改良されたGKL変異酵素で処理すると、バイオフィルムの表面積、バイオマス、および平均厚さが減少することも明らかになりました。一度習得すると、この技術は適切に実行されれば、インキュベーション時間を除いて3〜4時間で行うことができます。

この手順を試みる際には、洗浄ステップ中のバイオフィルムの除去と破壊を最小限に抑えることを覚えておくことが重要です。この手順に続いて、細胞計数や酵素安定性アッセイなどの他の方法を実行できます。これにより、バイオフィルム内の細胞集団に対するクォーラムクエンチングラクトナーゼの影響や、その作用持続時間などの追加の質問に答えることができます。

この技術の開発後、この技術は、感染症治療の分野の研究者が、病原菌によって生成されるバイオフィルム中の潜在的なクォーラムクエンチングラクトナーゼの影響を調査する道を開きました。このビデオを見れば、クリスタルバイオレット染色によるバイオフィルムの乱れの定量化方法と、共焦点イメージングによるバイオフィルムの形態学的変化の評価方法について十分に理解できるはずです。病原性物質の取り扱いは非常に危険であることを忘れないでください。

この手順を実行する際には、適切な生物学的リスク封じ込め施設の使用などの予防措置を常に講じる必要があります。