自動化されたモジュラーハイスループットエキソポリサッカライドスクリーニングプラットフォームは、高感度炭水化物フィンガープリント分析と相まって

このアプローチの全体的な目標は、微生物のエキソ多糖類生産者の迅速かつ信頼性の高いスクリーニングと、その炭水化物フィンガープリントの同定です。これは、エキソ多糖類の未踏の多様性を活用するために不可欠なステップです。私たちの方法は、微生物エクソ多糖類の分野におけるポリマー研究をスピードアップするのに役立ちます。

これにより、特定のアプリケーション向けに異なる特性を持つ新しい多糖類の変異を迅速に同定できます。この技術の主な利点は、モジュール式で完全に自動化されたスクリーニングコンセプトで、さまざまなエキソ多糖検出システムの組み合わせです。これにより、非常に高速で信頼性があります。

この技術は、自動化プラットフォームが利用できないラボでも手動で実行できるため、その使用は非常に柔軟で、さまざまなスクリーニングニーズに合わせて調整できます。このエキソ多糖(EPS)スクリーニングプラットフォームは、モジュール式のセットアップを備えているため、プロトコールを自動スクリーニングと炭水化物フィンガープリントの2つの主要な部分に分離できます。最初のタスクは、スクリーニング用の菌株を培養し、遠心分離によって細胞を除去することです。

菌株は、30°Cおよび1,000 RPMのマイクロ力価プレートシェーカー上の通気性シーリングフィルムで覆われた96ウェルプレートで、炭素源としてグルコースで培養されます。スクリーンの日には、プロトコルテキストに記載されているように、ロボットの作業台と収納カルーセルを準備します。プレートから通気性のあるシーリングフィルムをはがし、カルーセル位置1-1から1-4に主要な培養物を割り当てます。

自動化されたロボットプログラムを起動します。培養後に細胞を除去するには、メインの培養ディープウェルプレートをカルーセルから遠心分離機に移し、4、300 x g、摂氏20度で30分間遠心分離します。ろ過前の沈殿のために、マイクロ力価プレートとpH指示マイクロ力価プレートをカルーセルから作業台に移動します。

また、すべての細菌細胞を完全に除去するろ過プレートを、コレクタープレートと一緒に作業台の位置に移します。遠心分離後、180マイクロリットルの主培養上清をろ過プレートに移します。主培養上清から150マイクロリットルを吸引し、50マイクロリットルをマイクロ力価プレートに分注して沈殿させてからろ過し、100マイクロリットルをpH指示プレートに分注します。

EPS産生を評価するために、2-プロパノールによる上清の沈殿が行われます。12.5ミリリットルのマルチステップピペットを使用して、各ウェルに150マイクロリットルの2-プロパノールを手動で追加します。マイクロ力価プレートを室温で900RPMで10分間振とうした後、EPSの生成を示す繊維またはフレークの形成を視覚的に観察します。

メインの培養プレートをカルーセルに戻した後、遠心分離後の沈降が減少するはずの発酵ブロスを調べます。粘度の増加は、EPS生産のもう一つの指標です。2番目のタスクは、96ウェルろ過を介して粘性発酵ブロスから細胞を完全に除去することです。

ろ過プレートを3, 000 x g、摂氏20度で10分間遠心分離します。次に、プレートをカルーセルのホームポジションに戻し、プロトコールテキストに記載されているようにゲルろ過の平衡化を行います。次に、濾液35マイクロリットルを平衡ゲルろ過プレートの中心にピペットで、沈殿に用いるマイクロタイタープレートに50マイクロリットルをピペットで移す。

ゲルろ過プレートを遠心分離機に移動し、他のすべてのプレートを作業台からカルーセルのホームポジションに戻します。すべてのプレートをカルーセルに戻した後、フィルタープレートの残留物で示される高粘性の上清に注意してください。濾液が不足していると、以下の分析モジュールで偽陰性の結果につながる可能性があります。

自動スクリーニングの3つ目のタスクは、96ウェルゲルろ過により、増殖培地から残りの単量体糖を除去することです。ゲルろ過プレートを1, 000 x g、摂氏20度で2分間遠心分離します。ロボットマニピュレーターで作業台を準備し、ゲル濾液を処理します。

ゲル濾過後の残りのグルコースを検出するために、50マイクロリットルのチップを使用して、25マイクロリットルの二重蒸留水を新鮮なマイクロタイタープレートに移します。20マイクロリットルの二重蒸留水、5マイクロリットルの空気、5マイクロリットルのゲル濾液を吸引し、同じプレートに分注します。200マイクロリットルのチップを取り、作業台の位置1-2から50マイクロリットルのグルコースアッセイ試薬ミックスを吸引して、最初のアッセイを開始します。

マイクロ力価プレートをインキュベーターに移動します。30分間のインキュベーション後、プレートをインキュベーターからマイクロ力価リーダーに移し、418ナノメートルと480ナノメートルで吸光度を記録します。フェノール - 硫酸法による総炭水化物含有量を決定するには、20マイクロリットルのゲル濾液をマイクロ力価プレートにピペットで移します。

プレートをカルーセルから手動で取り外し、リキッドハンドリングステーションに置きます。20マイクロリットルの異なるグルコース濃度を三重にしたキャリブレーションプレートを含めます。廃棄物容器を位置1に、300マイクロリットルのチップボックスを位置2に、250ミリリットルのトラフに110ミリリットルの新しく調製したフェノール硫酸を位置3に置きます。

8マイクロリットルの先端を備えた300チャンネルピペットを使用して、180マイクロリットルのフェノール硫酸をすべてのプレートの各列に移します。すべてのマイクロ力価プレートを蓋で覆い、室温で900RPMで5分間振とうして混合します。色反応のためにオーブンで摂氏80度で35分間インキュベートします。

ドラフトの下でプレートを冷却した後、480ナノメートルで消光を測定します。自動スクリーニングで得られた菌株は、以下の3つの基準のうち少なくとも2つを満たす場合にEPS陽性と指定されます。粘度制御、ポリマーの検出、および計算されたグルコース当量。

グルコース当量は、この式を使用して計算されます。スクリーニングプラットフォームのCarbohydrate Fingerprintには、手動で実行される最後の3つのタスクが含まれています。タスク 2 からのポジティブ ヒットの残りの濾液は、タスク 5 のゲル濾液の基礎を提供します。

課題6は、ゲル濾液の96ウェルマイクロ水分解です。これを達成するには、まず12チャンネル50マイクロリットルピペットを使用して、20マイクロリットルのゲル濾液を新しいPCRプレートに移します。次に、1.25ミリリットルのマルチステップピペットを使用して、20マイクロリットルの4モルトリフルオロ酢酸を各ウェルに加えます。

PCRプレートを熱可塑性エラストマーキャップマットで覆い、PCRプレートを特別なクランプ装置に置きます。クランプ装置を10回反転させて溶液を混合します。PCRプレートを遠心分離し、クランプ装置に固定した後、固定したクランプ装置を予熱した砂浴に入れ、摂氏121度で90分間インキュベートします。

12チャンネルの200マイクロリットルピペットを使用して、3.2%アンモニア溶液を追加し、pHを約8に調整します。PCRプレートを熱可塑性エラストマーキャップマットで覆い、クランプ装置を使用して手動で振とうします。最後のタスクは、ハイスループット-1-フェニル-3-メチル-5-ピラゾロン(HTPMP)法による炭水化物フィンガープリントの分析です。

この手順を開始するには、12チャンネル50マイクロリットルのピペットを使用して、中和された加水分解物の25マイクロリットルを新しいPCRプレートに移します。誘導体化試薬の75マイクロリットルを追加し、混合物を熱可塑性エラストマーキャップマットでプレートを覆います。PCRプレートを摂氏70度のPCRサイクラーに100分間置き、その後摂氏20度まで冷却します。

20マイクロリットルのアリコートを新しいマイクロ力価プレートに移し、次に12チャンネルの200マイクロリットルピペットを使用して、130マイクロリットルの19.23ミリモル酢酸を各ラインに追加します。吸引と分注で少なくとも6回直接混合し、すべての液体をマイクロ力価コレクタープレートを備えた0.2マイクロメートルのフィルタープレートに移します。プレートを1, 000 x gで5分間遠心分離し、フィルタープレートを取り外し、マイクロタイターコレクタープレートをシリコンキャップマットで密封します。

マイクロ力価プレートをUHPLC-UV-ESI-MSにセットして、炭水化物フィンガープリントを測定します。この表は、このスクリーニングプラットフォームで成功裏に同定された3つの例示的な新規株の結果を示しています。表の左側には、詳細なCarbohydrate Fingerprint分析の評価パラメータとして使用された、粘度形成、ポリマー産生、および全加水分解によるグルコース当量に関する自動スクリーニングモジュールの結果が表示されています。

目盛り付き糖だけでなく、未知の糖、二量体、置換基に基づく炭水化物フィンガープリントは、表の右側に記載されています。この情報を使用することにより、モノマー組成物を計算し、すでに知られているポリマー構造と比較することができる。さらに、興味深いモノマー組成物および希少な炭水化物の標的スクリーニングを実施することができる。

このテクニックを習得すると、わずか5時間で386系統のトレーニングを行うことができます。この手順に続いて、すでに存在するピルビン酸のような追加のアッセイ、または酢酸塩、またはリン酸塩のさらなるアッセイを、エキソ多糖類宣言の追加の質問に答えるために含めることができます。開発後、この技術は、その高い感度により、遺伝子工学による微生物のエクソ多糖類生産者の分野での研究への道を開き、エキソ多糖の生合成経路の変化が常在する化学構造に及ぼす影響を探求する

このビデオを見れば、新規のエクソ多糖類生産者を非常に迅速かつ信頼性の高い方法で特定する方法を十分に理解できるはずです。