Name: 自動化されたモジュラーハイスループットエキソポリサッカライドスクリーニングプラットフォームは、高感度炭水化物フィンガープリント分析と相まって (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 2 s
Description: 学ぶ自動化モジュール型ハイスループットスクリーニング法で細菌性エキソポリサッカライド産生株を迅速に同定し、炭水化物フィンガープリント解析により新規多糖類の探索を加速する効率的な研究手法です。

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私たちは、リキッドハンドリングシステムのプログラミングと技術サポートを提供してくださったThomas Howe氏とJörg Carsten氏に心から感謝します。

<ol><li>Milani, J., Maleki, G. Ch. 2, Hydrocolloids in Food Industry. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMilani%2C+J+%22Food+Industrial+Processes+-+Methods+and+Equipment%22">Food Industrial Processes - Methods and Equipment</a>. Valdez, B. 2, InTech. (2012).</li>
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開示するものは何もありません。

フェノール-硫酸酸法による多糖類の検出は：別の単糖類は、この方法9の使用により異なる吸収極大とモル吸光係数を示しています。これは、異なる量のいくつかの糖を含むポリマーの異なる吸収極大をもたらします。 16種類の市販のポリマーの吸収極大の異なる波長を、 表5に示されている。ポリマーは、（1 G / L）に溶解したのddH 2 Oに、（150 rpm）で一晩撹拌し、フェノール-硫酸酸法を用いて測定します。 Diutanガムは484 nmで最高470 nmで最低の吸収極大とスクレとヒアルロン酸を示しました。これらの結果に基づいて、480 nmでは、このスクリーニングプラットフォームのために選択しました。ポリマーの相対的な吸光度（100％に設定）を1g / Lのグルコースを用いて得られた吸光度に基づいて計算しました。最低の結果は、両方の92％で、スクレログルカンおよびサクシノで得られました。これはEXPましたスクレログルカンは、グルコースのみが含まれており、サクが7の割合でグルコースとガラクトースが含まれているためected：1。両方の商業ポリマーは、乾燥と異なる灰分の異なる損失を持っている、これは〜110％の理論値に達しなかった理由です。キシランは311パーセントと最も高い相対吸光度を示しました。このための理由は、より支配的なフラノース形にキシロースか​​ら達成高いモル吸光係数です。 0.1グラム/ Lのグルコースのレベルでは定量限界に達しただけでなく、濃度&lt;0.05グラム/ Lの検出限界。しかし、スクリーニングで陽性株の検出限界は、0.7より高いG / Lであり、従って、アッセイは、良好な性能を示しました。信頼できる結果を得るために、ゲル濾過後の残りのグルコースは、グルコースアッセイを用いて測定し、この値は、フェノール - 硫酸酸法からの値から差し引きました。 自動化されたグルコースアッセイ希釈：パフォーマンス培養後のグルコース決意（希釈1：100）を調査しました。このために、10μlの上清を吸引し、この希釈液の180μLを分注10倍を経由してディープウェルプレートでのddH 2 Oの990μlに移して混合しました。第二の重要なステップは、ゲルろ過後のグルコースアッセイからの1:10希釈のための唯一の5μlアリコートの正しいピペッティングしました。 ddH 2 Oの希釈25μLを生成するために最初の50μlのチップで転送された、のddH 2 Oおよび5μlのゲル濾過液のその後20μlを一緒に吸引しました。これは、チップのうち5μlアリコートの優れた除去を保証します。両方の希釈ステップは、グルコースアッセイを介して各種グルコース規格に確認しました。 2つの典型的な濃度についての結果は表6に示されている1：100希釈のグルコース含量を決意するための培養は、CV＆＃との両方の規格のための高精度を示した後に60; 1.2％。同時に、より高規格の精度は11.6（％の誤差）まででした。グルコース決意を培養した後にのみ、残りのグルコース含量を示し、従って、ポリマーの検出のために重要ではないしかし、これは無視できます。ゲルろ過した後、残りのグルコースのための1:10希釈は、CV &lt;1.4％と精度&lt;2.1％の誤差で非常に信頼性の高い結果を示しました。 蒸発を考慮することは：スクリーニングは最初のグルコースアッセイするための最初のステップから3.5時間を必要とします。この時間枠は、キャップされていないMTPストレージに影響を与えるかどうかを調べるために、グルコースアッセイの較正標準の50μlを用いて、ロボットカルーセルで3.5時間、カバーなしで保存しました。校正範囲（45から4.5ミリグラム/ L）において、試料濃度はほとんど増加しません。増加 - 蒸発による - は2.1％を下回ると、2つだけの最低濃度（1.8および0.9 mg / Lで）それが12.4％にまで達した（のためでした<strオング&gt;表7）。 ゲル濾過：非代謝グルコースの量が多いと加水分解されたポリマーからのグルコースの定量的検出を妨害します。したがって、ゲル濾過工程は、培養後に残っているグルコースを除去するために必要でした。さらに、ゲル濾過は、モノマー分析における分析のバックグラウンドを最小にするために、グルコースより他、塩及び炭水化物のモノマー化合物からの上清を含有するポリマーを精製します。ゲル濾過工程でろ液の35μlをウェルの中心に置きました。自動化システムでのゲル濾過のロバスト性の検証のために、0.045からの8つの校正標準は9までのG / Lのグルコースを濾過した（n = 8）。すべての濃度のグルコースは、常に初期値（ 表8）の95％以上減少しました。そうすることで、ゲル濾過、グルコース、種々の濃度のために、非常に良好な結果を示しました。さらに、残りのグルコースゲル-Fの後iltrationは、グルコースアッセイを用いて測定し、加水分解されたポリマーのためのグルコース当量の正確な量を受信するために、フェノール - 硫酸酸決意から差し引きました。 ピルベートアッセイ：まず第一に、それは、加水分解工程から中和し、希釈した（1:10）TFAマトリックスは酵素反応を妨害するかどうかを調べました。したがって、完全なアッセイを用いて、二回一回実行し、マトリックスなし一度と信頼性の高い結果を示しました。最後に、16市販のポリマーのピルビン酸含有量が正常測定し、 図3に示されている。一般的には、これらの16のポリマーからのみサクシノグリカン及びキサンタン天然ピルビン酸を含有することが知られています。我々のピルビン酸アッセイを用いてこれらのポリマーの両方を正確に同定しました。スクレでは、ウエランガムおよびキシランピルビン酸はまた、有意な量で検出されました。全体的に、アプローチの能力が検証され、ピルビン酸アッセイsであっ高いパフォーマンスをhowed。これは、加水分解後に異なるポリマーでピルビン酸を検出することであることが判明しました。 炭水化物指紋：自動スクリーニングのすべての分析モジュールを実行した後、潜在的なEPSの生産は、炭水化物指紋分析のために選択しました。このため、いくつかの基準を適用した：粘度1）陽性所見を遠心分離した後、および/または濾過の後。濾過前と後の2）降水。観測された繊維およびフレークを陽性と評価しました。フェノール - 硫酸酸法から3）グルコース換算値。 &gt; 700 mg / Lで値が正と評価されたと300および700 mg / Lでの間の値が推定されるEPSの生産者と評価されました。二、三の基準は陽性と評価されたときに、株はさらに、炭水化物、指紋分析のために選択しました。基準は、EPSのスクリーニング（ 例えば、低粘度EPS）の個々の目的に向けてカスタマイズすることができます。我々のアプローチはefficiを見つけることを目的としましたENTは、生産をEPS。唯一のグルコース同等の評価限界をEPSの少量を生産する菌株を検索するときに低減されるべきです。 技術的な利益と将来のアプリケーション：このプロトコルの一つの興味深い特徴は、手順と異なる分析モジュールのモジュラー文字です。これらは、個々の要件に適合、様々な方法で組み合わせることができ、新規のモジュールを容易に実現することができます。また、分析モジュールは、別々に使用することができ、 例えば、HT-PMP-誘導体化モジュールと組み合わせた加水分解モジュールは、96ウェルフォーマットで、異なるポリマー溶液（1 G / L）からの単量体組成分析を行うことができます。完全なスクリーニングはピペット操作スキームを変更することなく手作業で処理することができる液体ハンドリングシステムへのアクセス権を持つことなく、研究室のため。 screeneただし、液体ハンドリングシステムを使用して、最大768株（代わりに192株にスループットを増加させます手動で）一日あたりのdは。ここに記載されているプロトコルは、異なる属のスクリーニングが可能であるので、新規なEPS生産を識別し、一つのアプローチ（ 図4）に、それらの炭水化物フィンガープリントを分析するための大ひずみコレクションのスクリーニング。また、フコースなどの希少糖、ウロン酸、あるいは未知の糖を含む多糖のための標的スクリーニングは、詳細な単糖分析を介して行うことができます。また、定義された比率で異なる糖の組み合わせを検出することができます。これは、すでに知られているEPS又は新規EPSの構造的に関連する変異体の簡単な同定を可能にします。

微生物エキソポリサッカライド（EPS）は、様々な生物学的機能を果たすポリマーの構造的に非常に多様なグループです。これらは、通常単量体（糖、糖誘導体、糖酸）異なる種類の、これらのモノマー及びそれらの置換基との間の結合によって区別される複雑な反復単位、から構築されます。微生物多糖類の構造的多様性は、食品1、化粧品2,3、建築化学4または水処理5のようなさまざまな分野での応用を可能にするこの分子クラスのメンバーにかなり異なる特性を付与します。さらに、これらのバイオベースと、このような持続可能なポリマーの適用分野を拡張するには、新規の天然の微生物多糖類の識別だけでなく、構造変異体の工学は有望なアプローチを表します。どちらにしても、高速スクリーニング方法は、迅速にtheiのための微生物株の膨大な数をスキャンするために必要とされますRポリサッカライドの形成、およびその製品を分析します。したがって、我々は最近、単量体組成物6の識別を含む天然の単離または操作された株の変異体からの微生物多糖類生産の分析のため、96ウェルHT-スクリーニングプラットフォームを開発しました。 500天然の単離は、私たちはEPSを（データは示していない）を生成することができるように単離された株の約10〜20％を同定することができ〜の最初のスクリーニングラウンドのためにこのプラットフォームを適用します。これは、分析した株の80〜90％が適用された条件下で、EPSを産生しなかったので、詳細な炭水化物フィンガープリントのさらなる解析が必要ではなかったことを意味します。単量体組成物のこの高度な識別は、特に、データ分析のために、EPSの製造における陽性株を同定するための迅速前スクリーニング方法時間のかかるプロセスであるため、大幅に効率を向上させるであろう。また、試薬、UHPLC-UV-ESI-MSでの消耗品、測定時間を短縮することになります。さらに、異なる分析モジュール、一方で、この方法は、信頼性の高いする平行でつ以上の96ウェルプレートの手動操作を複雑一方であり、そのようにする方法の完全な可能性を制限しています。これらの理由から、我々は、自動化スクリーニングプラットフォームを開発することを決定しました。したがって、我々は、吸光度測定に基づいて、総糖含量の完全に自動化された高速検出方法で既存の炭水化物フィンガープリント技術のモジュラー形式を組み合わせます。 フェノール-硫酸酸方法は依然として細菌および植物多糖類7,8の合計炭水化物含量の高速決意のための選択の方法を表します。この方法は、最初の96ウェルプレート10,11に。デュボアら 9、異なるアプリケーションおよびサンプルサイズのために適合され、小さなスケールのためにしました。 PheのNOL - 硫酸酸方法は、全てのモノマー、オリゴマーおよびサンプルのポリマー炭水化物をsummating、一つの値による総炭水化物含有量を測定します。 アカウントにこれらの側面を取って、適当な培養培地の選択は、この方法を適用することが不可欠です。オリゴマーまたは酵母エキスなどの高分子炭水化物化合物を含む複合メディアが変更されたポリマー含有量につながる可能性があるため、厳密に避けるべきです。また、糖の多量の株の培養のための炭素源として使用されます。培養プロセスからの残りの炭水化物、高レベルの負のEPS量の測定を妨害する可能性があります。 したがって、定義されており、純粋な糖の使用が推奨されます。我々の実験では、細胞の培養にグルコースを使用していました。培養後の残りのグルコースをゲル濾過によって還元し、グルコースアッセイによって測定しました。最後に、グルコース当量多糖類のSは、フェノール - 硫酸酸法を用いて検出された総炭水化物含量のゲル濾過後に残っているグルコースを差し引くことにより計算しました。フェノール - 硫酸酸法と組み合わせたゲル濾過およびグルコースアッセイは、信頼性の高い結果を保証し、私たちの最初の、完全に自動化された検出システムであることが可能です。 沈殿および粘度上昇の観察：二つの新しい分析モジュールは、EPS-検出系からの情報の量を増加させるための自​​動化スクリーニングプラットフォームに含まれていました。 多くの異なるEPS - 例えばサク、キサンタンおよび結腸酸12 -砂糖位置C4とC6上の非炭水化物ピルビン酸ケタールで修飾することが報告されています。 （ちょうどスクシニル半エステル、ウロン酸など）これらのピルビン酸ケタールは、物理プロペに、したがって、ポリアニオン性質に寄与し、二価陽イオンブリッジ13を介して相互作用することによってポリマーのrties。これらの特定のポリマーを同定するためにピルビン酸の決意は、もう1つの追加の分析モジュールとして設立されました。これは、多糖類の置換基およびそれらの潜在的な巨視的な性質についての情報を増大させます。 すべてのモジュールを組み合わせることにより、異なるEPSの識別だけでなく、EPSの生産者の迅速かつ効率的な決意を可能にします。このアプローチによりスクリーニングプラットフォームは、2つの主要部分（ 図1）に分けることができました。すぐに株を生産EPSを事前に選択するための自動化スクリーニング（パートI）ワークフローは完全に自動化が起こる（ 表1）内。炭水化物フィンガープリント分析（パートII）が定量的に事前に選択された株によって産生さEPSの単量体組成を決定します。これにより、データ分析は、大ひずみコレクションのスクリーニングを最適化するために最小化されました。この一つの自動スクリーニングの実行で一日あたり768株の一日あたりの可能な2ランで384株を分析する可能性を提供しています。さらに、炭水化物フィンガープリント分析は、すべての識別されたEPSの、さらに詳細な概要を説明します。これは、有向分析とEPSの既に記載された化学構造に比べてほんのわずかに異なるEPSの変異体または完全に新しいものの同定を可能にします。

<table><tbody><tr><td>96ウェルディープウェルプレート2.0 ml(DWP)</td><td>Greiner Bio-One</td><td>780271</td><td>Main-culture(CP 1-1〜1-4)、ゲルろ過用平衡プレート(CP 1-6、1-7、2-6、2-7)、990を含むグルコースアッセイ(CP 4-1〜4-4)の1:100希釈。&マイクロ;l of ddH2O</td></tr><tr><td>通気性シーリングフィルム</td><td>Axygen</td><td>BF-400-S</td><td>前培養およびメイン培養用インキュベーションフィルム DWP</td></tr><tr><td>アルミニウムシーリングフィルム</td><td>Axygen</td><td>PCR-AS-200-80</td> <td>&deg;グリセロールストックプレート用C保存フィルム</td></tr><tr><td>MCA96ネスト使い捨てチップ200&micro;l</td><td>TECAN</td><td>30038619</td><td>作業台位置 (WTP 2-1 から 2-4)</td></tr><tr><td>A/B ガラスフィルタープレート 1&nbsp;&マイクロ;m</td><td>Pall Corporation</td><td>PN 8031</td><td>コレクタープレート (CP 2-1 から 2-4)</td></tr><tr><td>96 ウェルマイクロ力価プレート V-Bottom</td><td>Greiner Bio-One</td><td>651201</td><td>ろ過プレート用コレクタープレート (CP 2-1 から 2-4)</td></tr><tr><td>96 ウェル SpinColumn G-25</td><td>ハーバード装置</td><td>74-5612</td><td>DWP (CP 1-6、1-7、2-6、2-7)</td></tr> <tr><td>96ウェルマイクロ力価プレート V-Bottom</td><td>Nunc</td><td>249944</td><td>ゲルろ過プレート用コレクタープレート(CP 3-1〜3-4)</td></tr><tr><td>ネストされた使い捨てチップSBS 50 & マイクロ;l チップ</td><td>TECAN</td><td>30038609</td><td>カルーセル位置 (CP 4-6, 4-7 および 5-1 から 5-6)</td></tr> <tr><td>トラフ 250 ml</td><td>Axygen</td><td>Res-SW96-HP</td><td>水 WTP 1-1, グルコースアッセイ試薬ミックス WPT 1-2, 酢酸アンモニウム緩衝液 pH 5.6 (CP 5-7)</td></tr> <tr><td>96 ウェルマイクロ力価プレート F-Bottom (MTP)</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655101</td><td>沈殿1(CP 6-1〜6-4)、pH値(CP 7-1〜7-4)、沈殿2(CP 8-1〜8-4)、フェノール硫酸法(CP 8-5〜8-8)、グルコースアッセイ(CP 9-1〜9-9)、ダミープレート(WTP 3-1、3-2)</td></tr><tr><td>96ウェルシリコンキャップマット&nbsp;</td><td>Whatmann</td><td>7704-0105</td><td>MTP</td></tr><tr><td>200 & マイクロ用カバーマット。l ピペットチップ</td><td>Sarstedt</td><td>70.760.002</td><td></td></tr><tr><td>1,000 & マイクロを手動で処理するため;l ピペットチップ</td><td>Sarstedt</td><td>70.762</td><td></td></tr><tr><td>96ウェルPCRマイクロ力価プレートの手動取り扱い用&nbsp;</td><td>ブランド</td><td>781350</td><td>加水分解、PMP誘導体化</td></tr><tr><td>TPE(熱可塑性エラストマー)キャップマット&nbsp;</td><td>ブランド</td><td>781405</td><td>加水分解、PMP誘導体化</td></tr><tr><td>フィルタープレート0.2&nbsp;&マイクロ;m Supor</td><td>Pall Corporation</td><td>PN 8019</td><td>MTPコレクタープレートによるUHPLC-ESI-MS分析用サンプルのろ過</td></tr><tr><td>ピペットチップ LHS 5-300&nbsp;&マイクロ;l</td><td>ブランド</td><td>732150</td><td>ブランドLHSシステム</td></tr><tr><td>グルコースオキシダーゼ&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2133</td><td>グルコースアッセイ</td></tr><tr><td>西洋ワサビペルオキシダーゼ&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6782</td><td>Glucose-assay, pyruvat-assay</td></tr><tr><td>DA-64 (N-(カルボキシメチルアミノカルボニル)-4.4'-ビス(ジメチルアミノ)-ジフェニルアミンナトリウム塩)</td><td>Wako Chemicals GmbH</td><td>043-22351</td><td>Pyruvat-assay</td></tr><tr><td>ピルビン酸オキシダーゼ&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4591</td><td>ピルバットアッセイ</td></tr><tr><td>リン酸カリウム二塩基性</td><td>カールロス</td><td>P749.3</td><td>ピルバットおよびグルコースアッセイ</td></tr><tr><td>リン酸カリウム一塩基性</td><td>カールロス</td><td>3904.3</td><td>ピルバットおよびグルコースアッセイ</td></tr><tr><td>チアミンピロリン酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8754</td><td>ピルバットアッセイ</td></tr><tr><td>塩化マグネシウム六水和物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31413</td><td>Pyruvat-assay</td></tr><tr><td>2-Propanol</td><td>VWR</td><td>20922.466</td><td>沈殿物</td></tr><tr><td>Phenol</td><td>VWR</td><td>20599.231</td><td>フェノール-硫酸法</td></tr><tr><td>Sulic acid</td><td>Carl-Roth</td><td>4623.4</td><td>Phenol-硫酸法</td></tr><tr><td>Trifluoroacetic 酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6508</td><td>加水分解</td></tr><tr><td>アンモニウム溶液</td><td>Carl-Roth</td><td>P093.1</td><td>加水分解、PMP誘導体化</td></tr><tr><td>エタノール絶対</td><td>VWR</td><td>20821.321</td><td>加水分解、PMP誘導体化</td></tr><tr><td>フェノールレッド&nbsp;</td><td>Alfa Aesar</td><td>B21710</td><td>加水分解、PMP 誘導体化</td></tr><tr><td>1-フェニル-3-メチル-5-ピラゾロン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M70800</td><td>PMP 誘導体化</td></tr><tr><td>メタノール LC-MS</td><td>VWR</td><td>83638.320</td><td>PMP 誘導体化</td></tr><tr><td>アセトニトリル LC-MS</td><td>VWR</td><td>83040.320</td><td>PMP 誘導体化</td></tr><tr><td>酢酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>338826</td><td>PMP 誘導体化</td></tr><tr><td>エタノール絶対</td><td>VWR</td><td>20821.321</td><td>PMP誘導体化</td></tr><tr><td>メチルレッド</td><td>アルファAesar</td><td>36667</td><td>pH値</td></tr><tr><td>ロボット液体処理システム&nbsp;</td>の<td>Tecan</td><td>Freedom EVO</td><td>作業台のセットアップ図2</td></tr><tr><td>LiquidハンドリングステーションLHS</td><td>ブランド</td><td>709400</td><td>Figure 2</td></tr><tr><td>Tip-Adapter</td><td>ブランドの</td><td></td><td>作業台のセットアップ709434Figure 2</strong</td></tr><tr><td>>Liquid Ends MC 20-300&nbsp;&マイクロ;l</td><td>ブランド</td><td>709416</td><td>Figure 2</strong</td></tr><tr><td>>Adapter 60 mm</td><td>の <</td><td></td><td>strong>Figure 2</td></tr></tbody></table>

自動化されたモジュラーハイスループットエキソポリサッカライドスクリーニングプラットフォームは、高感度炭水化物フィンガープリント分析と相まって

Automated Modular High Throughput Exopolysaccharide Screening Platform Coupled with Highly Sensitive Carbohydrate Fingerprint Analysis

多くの微生物は、医療分野、食品用途または石油ベースの化学物質の代わりに重要な意味を持っている（EPS）、エキソポリサッカライドを生成し、分泌することができます。私たちは、種類や微生物によって産生されるEPSの量の高速で信頼性の高い分析を可能にする液体ハンドリングシステムで自動化する分析プラットフォームを記述する。それは、新規な天然の微生物エキソ多糖の生産を識別するために、高スループット（HT）で1日以内に、対応するポリマーの炭水化物フィンガープリントを分析することを可能にします。このプラットフォームを使用して、工学的手法で得られるかもしれない株コレクションならびに株変異体のライブラリーをスクリーニングすることができます。プラットフォームは、2つの主要な部分にプロトコルの分離を可能にするモジュール式のセットアップを有します。 viscositの半定量的分析：まず、異なる多糖類検出モジュールを組み合わせた自動スクリーニングシステムは、あります遠心分離工程、アルコール沈殿、フェノール - 硫酸酸変換を介して、総炭水化物含量の決意を介してポリマー形成の分析を介してY形成。ここでは、1回あたり384株をスクリーニングすることが可能です。紫外線及びエレクトロスプレーイオン化イオントラップ検出（と結合された超高性能液体クロマトグラフィーを介して完全な単量体組成物の分析：第二の部分は、2つの重要なモジュールを組み合わせることにより、第1の部分で識別された選択されたすべてのEPSの生産のための詳細な単糖分析を提供しますUHPLC-UV-ESI-MS）と発色に結合されている酵素的酸化を介して、ポリマーの置換（ピルビン酸ケタールの存在）などのピルビン酸の決意。このスクリーニングプラットフォームのすべての分析モジュールは、様々な方法で組み合わされ、個々の要件に合わせることができます。さらに、それらはすべて手動で処理または液体ハンドリングシステムを用いて行うことができます。これにより、スクリーニングナンプラーTFORMは、様々なEPSを識別するために巨大な柔軟性を可能にします。

私たちは、微生物のエクソ多糖類の同定と特性評価のための自動化されたモジュール式のハイスループット法を提示します。この方法は、分泌された多糖類の総量を分析するための迅速な事前選択と詳細な炭水化物フィンガープリントを組み合わせて、新たに分離された細菌株または全株コレクションの迅速なスクリーニングを可能にします。

Many microorganisms are capable of producing and secreting exopolysaccharides (EPS), which have important implications in medical fields, food ...

このアプローチの全体的な目標は、微生物のエキソ多糖類生産者の迅速かつ信頼性の高いスクリーニングと、その炭水化物フィンガープリントの同定です。これは、エキソ多糖類の未踏の多様性を活用するために不可欠なステップです。私たちの方法は、微生物エクソ多糖類の分野におけるポリマー研究をスピードアップするのに役立ちます。これにより、特定のアプリケーション向けに異なる特性を持つ新しい多糖類の変異を迅速に同定できます。この技術の主な利点は、モジュール式で完全に自動化されたスクリーニングコンセプトで、さまざまなエキソ多糖検出システムの組み合わせです。これにより、非常に高速で信頼性があります。この技術は、自動化プラットフォームが利用できないラボでも手動で実行できるため、その使用は非常に柔軟で、さまざまなスクリーニングニーズに合わせて調整できます。このエキソ多糖(EPS)スクリーニングプラットフォームは、モジュール式のセットアップを備えているため、プロトコールを自動スクリーニングと炭水化物フィンガープリントの2つの主要な部分に分離できます。最初のタスクは、スクリーニング用の菌株を培養し、遠心分離によって細胞を除去することです。菌株は、30°Cおよび1,000 RPMのマイクロ力価プレートシェーカー上の通気性シーリングフィルムで覆われた96ウェルプレートで、炭素源としてグルコースで培養されます。スクリーンの日には、プロトコルテキストに記載されているように、ロボットの作業台と収納カルーセルを準備します。プレートから通気性のあるシーリングフィルムをはがし、カルーセル位置1-1から1-4に主要な培養物を割り当てます。自動化されたロボットプログラムを起動します。培養後に細胞を除去するには、メインの培養ディープウェルプレートをカルーセルから遠心分離機に移し、4、300 x g、摂氏20度で30分間遠心分離します。ろ過前の沈殿のために、マイクロ力価プレートとpH指示マイクロ力価プレートをカルーセルから作業台に移動します。また、すべての細菌細胞を完全に除去するろ過プレートを、コレクタープレートと一緒に作業台の位置に移します。遠心分離後、180マイクロリットルの主培養上清をろ過プレートに移します。主培養上清から150マイクロリットルを吸引し、50マイクロリットルをマイクロ力価プレートに分注して沈殿させてからろ過し、100マイクロリットルをpH指示プレートに分注します。EPS産生を評価するために、2-プロパノールによる上清の沈殿が行われます。12.5ミリリットルのマルチステップピペットを使用して、各ウェルに150マイクロリットルの2-プロパノールを手動で追加します。マイクロ力価プレートを室温で900RPMで10分間振とうした後、EPSの生成を示す繊維またはフレークの形成を視覚的に観察します。メインの培養プレートをカルーセルに戻した後、遠心分離後の沈降が減少するはずの発酵ブロスを調べます。粘度の増加は、EPS生産のもう一つの指標です。2番目のタスクは、96ウェルろ過を介して粘性発酵ブロスから細胞を完全に除去することです。ろ過プレートを3, 000 x g、摂氏20度で10分間遠心分離します。次に、プレートをカルーセルのホームポジションに戻し、プロトコールテキストに記載されているようにゲルろ過の平衡化を行います。次に、濾液35マイクロリットルを平衡ゲルろ過プレートの中心にピペットで、沈殿に用いるマイクロタイタープレートに50マイクロリットルをピペットで移す。ゲルろ過プレートを遠心分離機に移動し、他のすべてのプレートを作業台からカルーセルのホームポジションに戻します。すべてのプレートをカルーセルに戻した後、フィルタープレートの残留物で示される高粘性の上清に注意してください。濾液が不足していると、以下の分析モジュールで偽陰性の結果につながる可能性があります。自動スクリーニングの3つ目のタスクは、96ウェルゲルろ過により、増殖培地から残りの単量体糖を除去することです。ゲルろ過プレートを1, 000 x g、摂氏20度で2分間遠心分離します。ロボットマニピュレーターで作業台を準備し、ゲル濾液を処理します。ゲル濾過後の残りのグルコースを検出するために、50マイクロリットルのチップを使用して、25マイクロリットルの二重蒸留水を新鮮なマイクロタイタープレートに移します。20マイクロリットルの二重蒸留水、5マイクロリットルの空気、5マイクロリットルのゲル濾液を吸引し、同じプレートに分注します。200マイクロリットルのチップを取り、作業台の位置1-2から50マイクロリットルのグルコースアッセイ試薬ミックスを吸引して、最初のアッセイを開始します。マイクロ力価プレートをインキュベーターに移動します。30分間のインキュベーション後、プレートをインキュベーターからマイクロ力価リーダーに移し、418ナノメートルと480ナノメートルで吸光度を記録します。フェノール - 硫酸法による総炭水化物含有量を決定するには、20マイクロリットルのゲル濾液をマイクロ力価プレートにピペットで移します。プレートをカルーセルから手動で取り外し、リキッドハンドリングステーションに置きます。20マイクロリットルの異なるグルコース濃度を三重にしたキャリブレーションプレートを含めます。廃棄物容器を位置1に、300マイクロリットルのチップボックスを位置2に、250ミリリットルのトラフに110ミリリットルの新しく調製したフェノール硫酸を位置3に置きます。8マイクロリットルの先端を備えた300チャンネルピペットを使用して、180マイクロリットルのフェノール硫酸をすべてのプレートの各列に移します。すべてのマイクロ力価プレートを蓋で覆い、室温で900RPMで5分間振とうして混合します。色反応のためにオーブンで摂氏80度で35分間インキュベートします。ドラフトの下でプレートを冷却した後、480ナノメートルで消光を測定します。自動スクリーニングで得られた菌株は、以下の3つの基準のうち少なくとも2つを満たす場合にEPS陽性と指定されます。粘度制御、ポリマーの検出、および計算されたグルコース当量。グルコース当量は、この式を使用して計算されます。スクリーニングプラットフォームのCarbohydrate Fingerprintには、手動で実行される最後の3つのタスクが含まれています。タスク 2 からのポジティブ ヒットの残りの濾液は、タスク 5 のゲル濾液の基礎を提供します。課題6は、ゲル濾液の96ウェルマイクロ水分解です。これを達成するには、まず12チャンネル50マイクロリットルピペットを使用して、20マイクロリットルのゲル濾液を新しいPCRプレートに移します。次に、1.25ミリリットルのマルチステップピペットを使用して、20マイクロリットルの4モルトリフルオロ酢酸を各ウェルに加えます。PCRプレートを熱可塑性エラストマーキャップマットで覆い、PCRプレートを特別なクランプ装置に置きます。クランプ装置を10回反転させて溶液を混合します。PCRプレートを遠心分離し、クランプ装置に固定した後、固定したクランプ装置を予熱した砂浴に入れ、摂氏121度で90分間インキュベートします。12チャンネルの200マイクロリットルピペットを使用して、3.2%アンモニア溶液を追加し、pHを約8に調整します。PCRプレートを熱可塑性エラストマーキャップマットで覆い、クランプ装置を使用して手動で振とうします。最後のタスクは、ハイスループット-1-フェニル-3-メチル-5-ピラゾロン(HTPMP)法による炭水化物フィンガープリントの分析です。この手順を開始するには、12チャンネル50マイクロリットルのピペットを使用して、中和された加水分解物の25マイクロリットルを新しいPCRプレートに移します。誘導体化試薬の75マイクロリットルを追加し、混合物を熱可塑性エラストマーキャップマットでプレートを覆います。PCRプレートを摂氏70度のPCRサイクラーに100分間置き、その後摂氏20度まで冷却します。20マイクロリットルのアリコートを新しいマイクロ力価プレートに移し、次に12チャンネルの200マイクロリットルピペットを使用して、130マイクロリットルの19.23ミリモル酢酸を各ラインに追加します。吸引と分注で少なくとも6回直接混合し、すべての液体をマイクロ力価コレクタープレートを備えた0.2マイクロメートルのフィルタープレートに移します。プレートを1, 000 x gで5分間遠心分離し、フィルタープレートを取り外し、マイクロタイターコレクタープレートをシリコンキャップマットで密封します。マイクロ力価プレートをUHPLC-UV-ESI-MSにセットして、炭水化物フィンガープリントを測定します。この表は、このスクリーニングプラットフォームで成功裏に同定された3つの例示的な新規株の結果を示しています。表の左側には、詳細なCarbohydrate Fingerprint分析の評価パラメータとして使用された、粘度形成、ポリマー産生、および全加水分解によるグルコース当量に関する自動スクリーニングモジュールの結果が表示されています。目盛り付き糖だけでなく、未知の糖、二量体、置換基に基づく炭水化物フィンガープリントは、表の右側に記載されています。この情報を使用することにより、モノマー組成物を計算し、すでに知られているポリマー構造と比較することができる。さらに、興味深いモノマー組成物および希少な炭水化物の標的スクリーニングを実施することができる。このテクニックを習得すると、わずか5時間で386系統のトレーニングを行うことができます。この手順に続いて、すでに存在するピルビン酸のような追加のアッセイ、または酢酸塩、またはリン酸塩のさらなるアッセイを、エキソ多糖類宣言の追加の質問に答えるために含めることができます。開発後、この技術は、その高い感度により、遺伝子工学による微生物のエクソ多糖類生産者の分野での研究への道を開き、エキソ多糖の生合成経路の変化が常在する化学構造に及ぼす影響を探求する道を開きました。このビデオを見れば、新規のエクソ多糖類生産者を非常に迅速かつ信頼性の高い方法で特定する方法を十分に理解できるはずです。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

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マイクロアレイポリマープロファイリング(MAPP)は、生体サンプル中の糖鎖の組成分析のためのハイスループット技術です。...

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タンパク質上の糖鎖を自動的かつ迅速に分析するためのシステムは、以前に開発されました。本稿では、バイオ医薬品やその他の複合糖質材料の糖鎖構造解析に従事するユーザーなど、幅広いユーザー向けに最適化された「糖質定性分析」のプロトコールを紹介します。...

全自動システムを用いた組換えタンパク質の迅速な糖質定性評価

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自動液滴マイクロ流体プラットフォームを用いたL-乳酸高産生 バチルス凝固変 異体の高スループットスクリーニング

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自動化されたモジュラーハイスループットエキソポリサッカライドスクリーニングプラットフォームは、高感度炭水化物フィンガープリント分析と相まって

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