Name: ex vivoで腸嚢は、胃腸疾患のモデルに粘膜透過性を評価するために (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 4 s
Description: 学ぶ ex vivo腸嚢法を用いた消化器疾患モデルにおける粘膜透過性評価手法。上皮バリアと粘液ゲル層の両方の機能を局所的に測定し、胃腸疾患の病態理解と治療開発に貢献する実験モデルを確立します。

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この作業は、National Health and Medical Research Project Grant APP1021582とSparke Helmore/NBN Triathlonおよび故Leslie Kenneth McFarlaneの遺産が後援するHunter Medical Research Instituteの助成金によって資金提供されました。

このプロトコルのすべての動物の作業はニューカッスル大学の動物倫理委員会に厳密に準拠して行われている手順を承認しました。 楽器、文化メディアと皿の作製<ol><li>プリ暖かいメディア199（TC199）またはダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）メディア37へ °C。 95％O 2/5％CO 2でバブリングすることにより事前含酸素媒体。媒体は7.3の最終pHを持っていることを確認してください。 </li><li>各嚢のための2つの5cmのセクションを切断して縫合糸を準備します。ループ閉じられていない結び目に縫合糸。 </li></ol> 2.解剖および消化管の調製<ol><li>安楽死の前に固形食12時間を撤回。必要であれば、この時間の間に栄養ゲルサプリメントに動物を配置します。 </li><li>施設内倫理プロトに従って頸椎脱臼に続いてペントバルビタールナトリウムの過剰摂取（[200ミリグラム/キログラム]、腹腔内注射）によりマウスを安楽死させますCOLSは、腹部と胸部の上に70％エタノールをスプレーし。 </li><li>はさみを使用して、腹部の真ん中に横切開を行い、腹膜を露出させます。 </li><li>分離し、幽門括約筋で胃から小腸上部を切断し、肛門縁で大腸を切断することにより、消化管を除去するために進んでください。優しく腸間膜を削除するために鉗子を使用します。予め温め、酸素媒体中で腸管を置きます。 </li><li> （ 図1）の透過性について評価する腸の部分を特定し、腸管の残りの部分から自由にこのセクションをカット。 <ol><li>動物間の一貫性を維持する胃十二指腸および空腸の相対的なセクションを測定し、盲腸を結腸及び回腸の相対的なセクションを測定するために。 </li><li>組織セグメントを選択する場合、そのようなパイエル板などの粘膜関連リンパ組織の存在に注意してください。これらは小さなうなずきとして同定することができますルーメンの漿膜側のジュール。 </li><li> 1ミリリットルの注射器を使用して、静かに予熱したPBS（37°C）でペトリ皿に腸セグメントの管腔内容をフラッシュします。これらの糞便内容は-80で廃棄または保存することができます 所望のように将来の分析のためにCを°。 </li></ol></li></ol>腸嚢の調製<ol><li>試験化合物または分子の300μlの容量で1ミリリットル注射器を準備します。粘膜の完全性、FITCデキストランM.Wt.の1mg / ml溶液のための4,400を使用してもよいです。 4,400-70,000ダの大きさの範囲のプローブは、増加した感受性のために使用することができます。安全注射器の上に小さな動物の血管カテーテルにフィット。 </li><li>メジャー5腸セグメントの開口部からセンチ、セグメントをネクタイはしっかりとこの時点で、縫合糸ループで閉じます。静かに腸の開口部の周囲に予め結んだ縫合糸ループを配置し、鈍化カテーテルを挿入します。腸のセグメントを確保するために、閉じた縄を引いてそして、すべての溶液が注入されることを確認して、腸にシリンジから300μlのボリュームをリリース。 </li><li>同時に腸嚢の閉鎖を確保​​するために、縫合糸縄を引きながらゆっくりカテーテルを削除します。腸からの緩い腸嚢をカットし、37に予熱酸素培地20mlを充填した50mlコニカルチューブの中に置きます °C。 </li></ol>透水4.測定<ol><li> 37に設定された加熱水浴中で腸の嚢を含む場所コニカルチューブ °C。 0、30、60、90および120分の時点で、各インスタンスで新鮮な培地100μlでボリュームを交換し、円錐管および転送から96ウェルプレートに100μlのサンプルを取ります。 </li><li>最終的なサンプルが採取された後、粘膜表面を露出させ、縫合糸の時点で、セグメントの長さに沿って開いた嚢をカット。 </li><li>各腸のセグメントの長さと幅を測定します。指名打者の場合赤、スナップ-80セグメントと店を凍結 タンパク質または生化学的解析、あるいは、分子アッセイのためのRNA安定化溶液中の店のためのC°。 </li><li> 1から1×10 -6の範囲内のFITCタグ化分子に対する対数希釈の標準曲線を構築します。 </li><li>蛍光プレートリーダー上のFITC用の測定試料および標準、FITCの励起/発光：/ 519 nmの495 nmの。 </li></ol>各個別の腸サックのための見かけ透水5.計算<ol><li>時間単位は秒に変換します。 </li><li>各時点について、累積濃度、Qを計算します Q tの=（C トンの * Vrを）+（Q tの和 * V s）は 、ここで： 時刻tでのQ トン =累積濃度 CのT =時間tにおける濃度 受信機側でのV R =巻 以前のすべてのQ tのQ tの和 =合計 V S =ボリュームをサンプリング </li><li>プロット対時間Q（T）と傾きを計算：δQ/ΔT </li><li>見かけの透過性を計算する（P アプリ ） P アプリ =（δQ/ΔT）/（*株）、場所： 組織のA =エリア C 0 =初期濃度</li></ol>

<ol><li>Goggins, B. J., Chaney, C., Radford-Smith, G. L., Horvat, J. C., Keely, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+and+Integrin-Mediated+Epithelial+Restitution+during+Mucosal+Inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+immunology%22%5BJournal%5D)">Hypoxia and Integrin-Mediated Epithelial Restitution during Mucosal Inflammation.</a> Frontiers in immunology. 4, 272(2013).</li>
<li>Otte, J. M., Kiehne, K., Herzig, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+peptides+in+innate+immunity+of+the+human+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial peptides in innate immunity of the human intestine.</a> Journal of gastroenterology. 38, 717-726 (2003).</li>
<li>Robinson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucosal+protection+by+hypoxia-inducible+factor+prolyl+hydroxylase+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Mucosal protection by hypoxia-inducible factor prolyl hydroxylase inhibition.</a> Gastroenterology. 134, 145-155 (2008).</li>
<li>Feighery, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+intestinal+permeability+in+rats+subjected+to+traumatic+frontal+lobe+percussion+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+trauma%22%5BJournal%5D)">Increased intestinal permeability in rats subjected to traumatic frontal lobe percussion brain injury.</a> The Journal of trauma. 64, 131-137 (2008).</li>
<li>Keely, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chloride-led+disruption+of+the+intestinal+mucous+layer+impedes+Salmonella+invasion%3A+evidence+for+an+%27enteric+tear%27+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+physiology+and+biochemistry+%3A+international+journal+of+experimental+cellular+physiology%2C+biochemistry%2C+and+pharmacology%22%5BJournal%5D)">Chloride-led disruption of the intestinal mucous layer impedes Salmonella invasion: evidence for an 'enteric tear' mechanism.</a> Cellular physiology and biochemistry : international journal of experimental cellular physiology, biochemistry, and pharmacology. 28, 743-752 (2011).</li>
<li>Keely, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+epithelial+innate+immunity+to+systemic+protection+afforded+by+prolyl+hydroxylase+inhibition+in+murine+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+immunology%22%5BJournal%5D)">Contribution of epithelial innate immunity to systemic protection afforded by prolyl hydroxylase inhibition in murine colitis.</a> Mucosal immunology. 7, 114-123 (2014).</li>
<li>Sourisseau, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+PCNA+and+cyclin+D1+expression+and+epithelial+morphogenesis+by+the+ZO-1-regulated+transcription+factor+ZONAB%2FDbpA%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation of PCNA and cyclin D1 expression and epithelial morphogenesis by the ZO-1-regulated transcription factor ZONAB/DbpA.</a> Mol Cell Biol. 26, 2387-2398 (2006).</li>
<li>Ruehl-Fehlert, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revised+guides+for+organ+sampling+and+trimming+in+rats+and+mice--part+1%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Toxicol+Pathol%22%5BJournal%5D)">Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice--part 1.</a> Exp Toxicol Pathol. 55, 91-106 (2003).</li>
<li>Barthe, L., Woodley, J. F., Kenworthy, S., Houin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+everted+gut+sac+as+a+simple+and+accurate+technique+to+measure+paracellular+transport+across+the+small+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22European+journal+of+drug+metabolism+and+pharmacokinetics%22%5BJournal%5D)">An improved everted gut sac as a simple and accurate technique to measure paracellular transport across the small intestine.</a> European journal of drug metabolism and pharmacokinetics. 23, 313-323 (1998).</li>
<li>Marks, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+Delivery+of+Prolyl+Hydroxylase+Inhibitor%3A+AKB-4924+Promotes+Localized+Mucosal+Healing+in+a+Mouse+Model+of+Colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammatory+bowel+diseases%22%5BJournal%5D)">Oral Delivery of Prolyl Hydroxylase Inhibitor: AKB-4924 Promotes Localized Mucosal Healing in a Mouse Model of Colitis.</a> Inflammatory bowel diseases. 21, 267-275 (2015).</li>
<li>Keely, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia-inducible+factor-dependent+regulation+of+platelet-activating+factor+receptor+as+a+route+for+gram-positive+bacterial+translocation+across+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Hypoxia-inducible factor-dependent regulation of platelet-activating factor receptor as a route for gram-positive bacterial translocation across epithelia.</a> Mol Biol Cell. 21, 538-546 (2010).</li>
<li>Brayden, D. J., Bzik, V. A., Lewis, A. L., Illum, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CriticalSorb+promotes+permeation+of+flux+markers+across+isolated+rat+intestinal+mucosae+and+Caco-2+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+research%22%5BJournal%5D)">CriticalSorb promotes permeation of flux markers across isolated rat intestinal mucosae and Caco-2 monolayers.</a> Pharmaceutical research. 29, 2543-2554 (2012).</li>
<li>Hubbard, D., Ghandehari, H., Brayden, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transepithelial+transport+of+PAMAM+dendrimers+across+isolated+rat+jejunal+mucosae+in+ussing+chambers%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Transepithelial transport of PAMAM dendrimers across isolated rat jejunal mucosae in ussing chambers.</a> Biomacromolecules. 15, 2889-2895 (2014).</li>
<li>Keely, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+ex+vivo+intestinal+tissue+models+to+measure+mucoadhesion+of+poly+%28methacrylate%29+and+N-trimethylated+chitosan+polymers%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+research%22%5BJournal%5D)">In vitro and ex vivo intestinal tissue models to measure mucoadhesion of poly (methacrylate) and N-trimethylated chitosan polymers.</a> Pharmaceutical research. 22, 38-49 (2005).</li>
<li>Maher, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+intestinal+absorption+enhancement+and+local+mucosal+toxicity+of+two+promoters.+I.+Studies+in+isolated+rat+and+human+colonic+mucosae%5BTitle%5D)+AND+%22European+journal+of+pharmaceutical+sciences+%3A+official+journal+of+the+European+Federation+for+Pharmaceutical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Evaluation of intestinal absorption enhancement and local mucosal toxicity of two promoters. I. Studies in isolated rat and human colonic mucosae.</a> European journal of pharmaceutical sciences : official journal of the European Federation for Pharmaceutical Sciences. 38, 291-300 (2009).</li>
<li>Balda, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+dissociation+of+paracellular+permeability+and+transepithelial+electrical+resistance+and+disruption+of+the+apical-basolateral+intramembrane+diffusion+barrier+by+expression+of+a+mutant+tight+junction+membrane+protein%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Functional dissociation of paracellular permeability and transepithelial electrical resistance and disruption of the apical-basolateral intramembrane diffusion barrier by expression of a mutant tight junction membrane protein.</a> The Journal of cell biology. 134, 1031-1049 (1996).</li>
<li>Behrens, I., Stenberg, P., Artursson, P., Kissel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transport+of+lipophilic+drug+molecules+in+a+new+mucus-secreting+cell+culture+model+based+on+HT29-MTX+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+research%22%5BJournal%5D)">Transport of lipophilic drug molecules in a new mucus-secreting cell culture model based on HT29-MTX cells.</a> Pharmaceutical research. 18, 1138-1145 (2001).</li>
<li>Stefka, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Commensal+bacteria+protect+against+food+allergen+sensitization%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Commensal bacteria protect against food allergen sensitization.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 13145-13150 (2014).</li>
<li>Keely, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activated+fluid+transport+regulates+bacterial-epithelial+interactions+and+significantly+shifts+the+murine+colonic+microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22Gut+microbes%22%5BJournal%5D)">Activated fluid transport regulates bacterial-epithelial interactions and significantly shifts the murine colonic microbiome.</a> Gut microbes. 3, 250-260 (2012).</li>
<li>Barrett, K. E., Keely, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chloride+secretion+by+the+intestinal+epithelium%3A+molecular+basis+and+regulatory+aspects%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+physiology%22%5BJournal%5D)">Chloride secretion by the intestinal epithelium: molecular basis and regulatory aspects.</a> Annual review of physiology. 62, 535-572 (2000).</li>
<li>Soni, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rat%2C+ovine+and+bovine+Peyer%27s+patches+mounted+in+horizontal+diffusion+chambers+display+sampling+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+controlled+release+%3A+official+journal+of+the+Controlled+Release+Society%22%5BJournal%5D)">Rat, ovine and bovine Peyer's patches mounted in horizontal diffusion chambers display sampling function.</a> Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 115, 68-77 (2006).</li>
<li>Justino, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+role+of+Lactobacillus+acidophilus+on+inflammation+and+gastric+dysmotility+in+intestinal+mucositis+induced+by+5-fluorouracil+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+chemotherapy+and+pharmacology%22%5BJournal%5D)">Regulatory role of Lactobacillus acidophilus on inflammation and gastric dysmotility in intestinal mucositis induced by 5-fluorouracil in mice.</a> Cancer chemotherapy and pharmacology. , (2015).</li>
<li>Tran, C. D., Sundar, S., Howarth, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dietary+zinc+supplementation+and+methotrexate-induced+small+intestinal+mucositis+in+metallothionein-knockout+and+wild-type+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+biology+%26+therapy%22%5BJournal%5D)">Dietary zinc supplementation and methotrexate-induced small intestinal mucositis in metallothionein-knockout and wild-type mice.</a> Cancer biology & therapy. 8, 1662-1667 (2009).</li>
<li>Musch, M. W., Wang, Y., Claud, E. C., Chang, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lubiprostone+decreases+mouse+colonic+inner+mucus+layer+thickness+and+alters+intestinal+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Digestive+diseases+and+sciences%22%5BJournal%5D)">Lubiprostone decreases mouse colonic inner mucus layer thickness and alters intestinal microbiota.</a> Digestive diseases and sciences. 58, 668-677 (2013).</li>
</ol>

著者は、彼らが競合する金融利害関係を持たないことを宣言します。

ここでは、粘膜バリア機能のex vivoで評価するために分離および腸嚢の調製を詳述しています。腸の嚢の調製物は、主に腸を横断候補薬物の吸収を調べ、薬学研究に利用されています。しかし、このアッセイは、腸疾患の研究のためにも同様に適しています。領域と透過性の部位特異的な評価によって大きく異なる場合があります腸の透過性は、消化器疾患における粘膜の整合性の地域の重要性をよりよく理解することができます。アッセイは堅牢であり、適切な生理学的条件の下で、孤立した組織は、最大6時間の死後のための実行可能なままです。安楽死に続いて、組織標本の速度が重要であり、腸は、その内容をフラッシュし、できるだけ迅速に含酸素媒体に転写されるべきです。動物間の一貫性を確保するためには、適切な腸の領域がidentifiであることが不可欠ですED（ 図1）。十二指腸と空腸のセグメントは胃から測定されながら、結腸と回腸セグメントは、盲腸から測定されることをお勧めします。異なる株、モデルやトランスジェニック動物が大きくなる可能性があるため、より長いGITSを持っている、それは透過性アッセイに従事する前に、モデル内の平均長または...

消化管の腸上皮障壁はヒト成人で400メートル2で推定粘膜表面積です。したがって、常に微生物、摂取薬、栄養素や細菌毒素から挑戦にさらされています。ホストが許容共生細菌と潜在的な病原体を区別しなければならないだけでなく、同​​時に、栄養素の吸収を可能にしながら、上皮関門を通過するから、これらの種とそれらの分泌分子を防止しなければなりません。このように、腸上皮の役割は、管腔の内容物1に対する選択的障壁として作用することです。これは部分的に、構成的および誘導機構2からなる反応性生物系を介して作用する粘膜における先天上皮防御システムによって、達成されます。 上皮バリア機能の喪失は、胃腸疾患の多数の特徴的な病理である。 インビボでの上皮のバリア機能の検査は、トレーサー分子およびその後の血清の分析3の強制経口投与を介して評価することができます。しかし、この技術は、バリア機能障害のサイトへなどの兆候を提供していません。 vitroおよびトランスウェルシステム3を使用し、それぞれのチャンバ4,5をアッシング経上皮抵抗のex vivoでの評価では、一般的に上皮のバリア機能の代理マーカーとして使用するが、動物モデル6の貢献疾患の生理機能を欠いています。このプロトコルでは、レベルの数で粘膜バリア機能を評価するために使用され得る腸の完全性との直接及び局所的な評価を可能にするエクスビボ組織標本のモデルが記載されています。重要なことに、この手法は、疾患の動物モデルに適用することができる、または薬理学的に粘膜障壁機能障害の深さ質問に可能にするように操作することができます。

<table><tbody><tr><td>デカンテル&nbsp;非吸収性シルク縫合糸</td><td>Braintree Scientific</td><td>SUT-S 116</td><td></td></tr><tr><td>Media 199 (TC199)&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>11043-023</td><td>蛍光を阻害するため、フェノールレッドはありません</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Life Technologies</td><td>21063-045</td><td>これは蛍光を妨害するため、フェノールレッドはありません</td></tr><tr><td>N-アセチルシステイン</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>メディアで10 mMで使用</td></tr><tr><td>小動物血管キャサテル: Physiocath</td><td>Data Sciences International</td><td>277-1-002</td><td></td></tr><tr><td>FITC-デキストラン 4,400 MW</td><td>Sigma アルドリッチ</td><td>FD-4</td><td></td></tr><tr><td>FITC-デキストラン 20,000 MW</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>FD-20</td><td></td></tr><tr><td>FITC-デキストラン 70,000 MW</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>FD-70</td><td></td></tr></tbody></table>

ex vivoで腸嚢は、胃腸疾患のモデルに粘膜透過性を評価するために

Ex Vivo Intestinal Sacs to Assess Mucosal Permeability in Models of Gastrointestinal Disease

上皮バリアは、胃腸管の最初の先天的防御であり、選択的基盤となる組織区画に内腔からの輸送を調節し、上皮を通過する小さな分子の輸送を制限し、ほぼ完全に上皮高分子輸送を禁止します。この選択性は、親油性分子との両方の頂端受容体および上皮のタイトジャンクションタンパク質複合体の輸送を制限する粘液ゲル層によって決定される。上皮のin vitro細胞培養モデルは便利であるが、モデルとして、それらが欠け微生物、粘液ゲル、上皮および免疫系の間の相互作用の複雑さ。一方、腸管吸収または浸透性のインビボ評価を行うことができるが、これらのアッセイは、部位特異性の兆候と、全体的な消化管吸収を測定する。「腸の嚢」を用いてエクスビボ透過性アッセイ;腸の部位特異性の付加的な利点と、特定の分子の全体的な腸の整合性や比較のトランスポートのいずれかを測定するの迅速かつ高感度な方法です。ここでは、透過性の研究と見かけの透過性（P アプリ ）の計算のための腸嚢の調製を記載 腸管バリアを通過する分子の。この技術は、薬物吸収を評価する方法として使用することができる、または胃腸疾患の動物モデルにおける地域上皮バリア機能障害を検討します。

このプロトコルは、胃腸疾患の動物モデルにおいて腸のバリア機能の地域の変化を調べるために使用することができます。胃腸管7の変化領域に粘膜表面を横切って傍細胞プローブの流量を測定することにより、上皮のタイトジャンクションの完全性を評価することができます。また、大きさ（ 図2）または疎水性（ 図3）、上皮摂動の程度、または粘液ゲル層の完全性を傍プローブの性質を変化させることによっても測定することができます。より大きな分子量マーカーを用いることが、このような経上皮電気抵抗（TEER）などの電気生理学的測定によって明らかではないかもしれない控えめな変化を、検出、粘膜の傍細胞透過性のより敏感な尋問は可能ですが、その傍細胞輸送を可能にするのに十分である（ 図2）。ムコサル炎症は杯細胞と正常に重なり、上皮インターフェースを保護する保護粘液ゲルの減少の損失につながる可能性があります。疎水性のプローブを用いて、腸の粘液ゲル層の完全性は、（ 図3）</st...

このプロトコルは、腸バリア機能のex vivoモデルとして、切除された腸組織製剤または「腸嚢」の使用について説明しています。このモデルは、消化器疾患の動物モデルにおいて、特定の腸部位における上皮バリアと粘液ゲル層の両方の完全性を評価するために使用できます。

The epithelial barrier is the first innate defense of the gastrointestinal tract and selectively regulates transport from the lumen to the underlying ...

この手順の全体的な目的は、胃腸疾患の動物モデルにおいて局所的な腸管整合性を評価することです。この方法は、疾患中に粘膜の整合性が失われているか、あるいは特定の分子や細菌の取り込みが増加しているかなど、胃腸疾患に関する重要な疑問への回答に役立ちます。この手法の主な利点は、胃腸管内の特定の領域を評価できることです。胃腸管を準備するには、まずマウスの腹部と胸部を70%エタノールで噴霧し、はさみを用いて腹部の中央に水平に切開を入れて腹膜を露出させます。次に、幽門括約筋で胃から上部小腸を切り離し、肛門縁で大腸を切り離します。その後、ピンセットを用いて腸間膜を慎重に除去し、あらかじめ加温し酸素飽和させた培地に腸管を置きます。透過性を評価する領域を特定し、実験動物間で一貫性を維持するため、十二指腸と空腸の区画は胃からの相対的な位置で、結腸と回腸の区画は盲腸からの相対的な位置で測定します。管腔の漿膜側に小さな結節として確認できるパイエル板などの粘膜関連リンパ組織の存在に注意してください。その後、選択した区画を切除し、1 mlシリンジを用いて、そのセグメントの管腔内容物を37°Cのシャーレの中に慎重に洗浄して排出させます。

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Medicine

医学

炎症性腸疾患（IBD）の現在の治療は、疾患の症状の緩和を目指すが、重篤な副作用を引き起こす可能性があります。したがって、代替戦略は、動物大腸炎モデルにおいて研究されています。ここでは、臨床的なIBDの兆候にダイエットサプリメントの有益な効果は、このような大腸炎モデルで分析されている方法について説明します。...

実験的大腸炎の間、腸上皮バリア機能に栄養補助食品の有益な効果を分析

2 つのメソッドは、腸管のバリア機能を決定するここで掲載されています。上皮メーター (ボルト/オーム) は、組織培養の井戸に直接培養上皮細胞の上皮電気抵抗の測定に使用されます。マウスで FITC...

腸管上皮細胞の透磁率を決定する体外と体内アプローチ

栄養素、微生物叢代謝および循環に医薬品へのアクセスは、腸・血液関門 (GBB) によって制御されます。直接 GBB...

腸血液関門と微生物叢製品の肝代謝を評価するためのIn Vivo法

ここでは、小腸オルガノイドのバリア完全性を定量化する手法について説明する。この方法が生きているオルガノイドに基づいているという事実は、時間分解された方法で物質またはその組み合わせを調節する異なるバリア完全性の逐次的な調査を可能にする。...

生きているオルガノイドにおける腸のバリア破壊の調査

生体内顕微鏡を利用して、ここで提示される方法は、生きている動物の腸上皮細胞脱落のリアルタイム視覚化を可能にする。従って、麻酔化マウスの局所染色された腸粘膜(アクリフラビン及びローダミンB-デキストラン)は、共焦点顕微鏡を用いて単細胞分解能まで画像化される。...

腸透過性と上皮細胞流れ性能を評価する生体内顕微鏡ベースのアプローチ

調節不整合な腸上皮バリア機能および免疫応答は、生理学的モデルの欠如のために十分に調査されていない炎症性腸疾患の特徴である。ここでは、生体内での粘膜透過性および白血球の採用を研究するために、十分に血管化され、外装された腸セグメントを採用したマウス腸管ループモデルについて述べている。...

標準化腸ループモデルを用いたマウスにおける腸透過性と好中球経上皮移動の機能評価

本プロトコルは、腸透過性を決定するために頂端外腸介様モデルにおいてルシファーイエローを利用する方法を概説する。この方法は、壊死性腸炎などの炎症性腸疾患をモデル化するエンテロイドにおける傍細胞透過性を決定するために使用することができる。...

根尖腸管モデルにおけるルシファーイエローを用いた腸透過性の決定

ここでは、基本的な3次元(3D)腸細胞株モデルシステムの構築と、固定された腸当等物の光学顕微鏡的評価のためのパラフィン包埋プロトコルについて説明します。選択したタンパク質を染色することで、1回の実験で複数の視覚的パラメータを解析し、前臨床薬物スクリーニング研究に活用することができます。...

免疫成分を用いた基本的な3次元(3D)腸管モデルシステム

本プロトコルは、新たに分離された豚の頬上皮組織粘膜を用いてペプチド浸透を評価するスクリーニングプラットフォームを説明しています。この手法は、溶液、ヒルトップチャンバー、フィルムの浸透強化剤をフランツ拡散セルおよび3DプリントインサートのもとでGLP-1RAの浸透を統合し、組織学的粘膜評価を伴います。...

ペプチドフラックス評価のための標準化された エクスビブ 豚口毛モデル

アン<em生体内で&gt;</em血管透過性をテストする&gt;アッセイ

学ぶ ex vivo腸嚢法を用いた消化器疾患モデルにおける粘膜透過性評価手法。上皮バリアと粘液ゲル層の両方の機能を局所的に測定し、胃腸疾患の病態理解と治療開発に貢献する実験モデルを確立します。

ex vivoで腸嚢は、胃腸疾患のモデルに粘膜透過性を評価するために

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