Name: 対称性の破れ、偏光と創発集団行動を表示、マウス胚性幹細胞の凝集物の生成インビトロ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 37 s
Description: 学ぶマウス胚性幹細胞凝集物の作製法。ES.Lift培地で培養し、非接着性プレートで凝集させ、軸方向の伸長と自己組織化を観察する。発生生物学における組織相互作用と細胞分化の理解に有用なモデルです。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

この作品は、AMA、PB-Jとエラスムス、ステフティングのDRにEPSRCの学生の身分にウェルカム・トラストからプロジェクト無償の貢献でAMAにERC高度な研究者賞（DAT、TB）によって運営されています。ヘンドリックミュラーのVaderlandschフォンとFundatieバン・デ・VrijvrouweバンRenswoude TEの-Gravenhage SCvdBします。我々は彼らの実験室のプロトコルを共有するためのJ・ブリスコー、S・ムニョス・デスカルツォ、C.シュレーター、およびT.ロドリゲス、議論や建設的な批判のために、ホアキン・デNavascués封入プロトコルおよびAK HadjantonakisとC Budjan両方に感謝したいと思いますホールマウント胚の染色に関連します。この記事の以前のバージョンは、以前bioRxivプレプリントサーバ29上で利用できるようになりました。

1.培養条件の集約に先立ち<ol><li>加湿37℃のインキュベータ、5％CO 2 21-25でゼラチンコーティングした25cm 2の組織培養処理フラスコに（製剤のための具体的な材料・機器の表を参照）ESLIF媒体でたmESCを維持します。 </li><li>このプロトコルで使用する前に解凍を投稿少なくとも2継代の細胞を増殖させます。下の通路にある細胞は、実験の反復を通じて再現可能な特性を生成することを一般的に、より成功していない（ すなわち 、文化には​​15以上の継代）、異なるES細胞株の間がわずかな変化が予想される（試験した細胞株については、表2を参照してください ）。 </li><li> 40〜60％の集密度に細胞を増殖させます。集計にオーバーコンフルエント細胞を使用しないでください。 </li></ol>骨材の2世代<ol><li>前の暖かいPBS（+ の Ca 2+、Mg 2+を+）、ESLIF、N2B27 26,27 </su37℃の水浴中でP&gt;とトリプシン-EDTA。 </li><li>組織培養フラスコから吸引し培地（ステップ1.3）。二回、5ミリリットルのPBSで穏やかにフラスコをすすぎます。 PBSを吸引除去し、細胞を解離させるために1予め温めておいたトリプシン-EDTA（0.25％）mlの2を追加します。 <ol><li> &lt;5分間または細胞が完全にフラスコの表面から脱着するまでインキュベーターにフラスコを置きます。 1ミリリットルピペットで上下にピペット正確なカウントで均一な凝集体サイズの形成のための単一細胞懸濁液を生成します。 </li></ol></li><li> 5〜10ミリリットルESLIFでトリプシンを中和します。 50 mlの遠心チューブに細胞を回収し、転送を最大にするために、成長表面を洗い流し。遠心管から1ml量を削除し、血球計数器で細胞をカウントします。 </li><li> （全体の96ウェルプレートは、5ミリリットル懸濁液中に5×10 4個の細胞を必要とする）10細胞に/μLを与えるために必要な懸濁液の容量を決定します。大deviatとして、正確に細胞を数えます述べた細胞数のイオンが悪影響刺激に対する凝集体の応答に影響を与えることができます。 </li><li> 5分間〜170×gで新鮮な50mlの遠心分離管とスピンに予め温めておいたPBS 5 mlに5×10 4細胞を追加します。 </li><li>慎重にPBSを吸引し、5ミリリットルを追加し、PBSを静かに予め温めておきました。チューブの底にペレットを乱さありません。 5分間〜170×gで遠心分離します。 </li><li>慎重に二度目のPBSを吸引除去します。 PBSのキャリーオーバーとしてペレットを乱すことなく、できるだけ多くのPBSを削除悪影響集計に影響を与えることができます。 （mlをサスペンション5×10 4 mlを加え4セル/ 5、例えば ）必要なボリュームにN2B27のさらなる添加に続いて、均質な細胞懸濁液を生成するために、1ミリリットルで、まずP1000ピペットで暖かいN2B27をペレットを再懸濁。 </li><li>無菌の容器に細胞懸濁液を移し、非組織培養は、治療の各ウェルの底部に40μlの滴をピペットで、「U &#39;底96ワットマルチチャンネルピペットを使用して、エルプレート。それに対応する蓋付き96ウェルプレートを覆い、反転卓上顕微鏡（ 図1B）を有する細胞の存在を確認します。 注：これらのプレートは、接着細胞の可能性を制限するために使用されることが必須です。ないコートにゼラチン、フィブロネクチンまたは細胞接着を促進する任意の他のコーティングと、96ウェルプレートの底を行います。 </li><li>集計のために、CO 2を 37℃の加湿インキュベーター中で48時間、細胞をインキュベートし、5％。 </li></ol> 3.刺激を適用し、培地を交換<ol><li> 48時間のインキュベーション期間に続いて、成功した凝集（ 図1E）を確認するために、96ウェルプレートの各ウェル内たmESCの外観を観察します。注意：凝集体は本質的に球状で直径が約150〜200ミクロンに表示されます。問題は（ 表1）発生した場合、トラブルシューティングのセクションを参照してください。 </li><li>0;（N2B27 19に3μMChi99021（カイ）; DMSO中10mMで調製株）を150μlの新鮮な二次媒体を追加し、各ウェルマルチチャンネルピ ​​ペットを使用します。ウェルの底に付着し始めている可能性のある骨材を除去するのに十分な力でピペット。 37℃、5％CO 2（ 図1A）の加湿インキュベーター中で24時間二次媒体中で凝集物を培養します。 注：再現性の細長い偏凝集体は、この第二の媒体を使用して生成されます。他の二次媒体の組成物も必要と例は、図3に示す実験条件に応じて使用することができます。 </li><li>その後の培地交換のために、静かに、各ウェルの側から二次媒体の150μlのを除去するために、角度（約30°）で開催されたマルチチャンネルピペットを使用しています。その後、十分な力で各ウェルにピペット150μlの新鮮なN2B27スタートを持っている可能性のある骨材を除去しますedはウェルの底に付着します。 </li><li>時間経過するまで24時間毎に繰り返しポイント3. 3が完了した（集計培養実験の典型的な長さは120時間です）。 注意：凝集体が自由に各96ウェルプレート内との間の再現性と一貫性を確保するために、以下の培地の変更を移動していることを確認します。中には、集計期間後、毎日変更する必要があります。 </li></ol>共焦点顕微鏡による免疫染色と分析のための骨材の4準備<ol><li>固定および一次抗体インキュベーション 注意：AK Hadjantonakis 28で説明されたプロトコルは、MESCの免疫染色集約に合わせて変更されました。私たちの研究とそれらの希釈で使用される典型的な抗体は、以前に発表された作品19,21,24,25,29 および表3を参照してください。 <ol><li>そっと側Oから150μlの培地を除去するために、角度（約30°）で開催されたマルチチャンネルピペットを使用してください96ウェルプレートの各ウェルF。各ウェルに150μlのPBSをピペットで二回洗浄します。凝集体が落ち着くことができるように、各洗浄の間に数分を残します。 </li><li> 、200μlのを分与対応するピペットチップを取り付け、滅菌ハサミで先端の端から約3mmを遮断するP1000ピペットを設定します。先端に96ウェルプレートの各ウェル内の短い方法をPBSの一部を描画し、集計を攪拌するためにそれを追放します。 </li><li>ウェル小（直径30mm）ガラスショウジョウバエの解剖に集約し、ピペットを含む内のボリューム全体を描画するために、同じチップを使用してください。よく同じガラス解剖に同一の免疫染色体制を受ける96ウェルプレートからすべての集計を転送します。 注：集計を転送する際に凝集体のキャリーオーバーを防止するために、異なる実験条件から新しいカットピペットチップを使用してください。 </li><li> aggregatが含まれているガラスウェルを配置解剖顕微鏡上にES。ガラスパスツールピペットでウェルの一方の側から中心部と吸引PBSに凝集体を強制することは、十分にガラスを渦巻。凝集体は吸引されないように、顕微鏡を使用してください。乾燥からそれらを防ぐために凝集体を覆うように、ガラスウェル内少量のPBSを残します。 </li><li> 1ミリリットル新たに調製し、ホルムアルデヒド（4％）をPBSに溶解し、低速に設定オービタルシェーカーで4℃で2時間インキュベートを追加します。注意：パラホルムアルデヒドは、アレルギー性​​の発癌性および毒性であることが知られています。取り扱いながら、適切な保護具を着用します。 </li><li>項4. 1. 4で説明したように固定後、同様にホルムアルデヒド溶液を吸引し、低速に設定オービタルシェーカー上で、各洗浄のために、1 mlのPBSで3回10分間の凝集体を洗浄します。 </li><li>項4. 1. 4で説明したようにPBSを吸引し、さらに3を実行し、10％ウシ胎児血清および0.2％トリを含むPBSで10分間洗浄トンX-100（PBSFT）。低速に設定オービタルシェーカー上で10分の洗浄を行います。 注：特に牛乳を使用した場合のプロトコル中に失われることになる凝集体の数を減少させる、透明な洗浄緩衝液中でウシ胎児血清（FBS）の結果を使用します。それは、次の固定、免疫組織化学的手順は、以下に詳述するもの以外の様々な方法で行うことができ、研究者によって決定され、最適化されるべきであることに留意することが重要です。 </li><li>低速に設定オービタルロッカー上PBSFTで4℃で1時間凝集体をブロックします。プロトコルはこの時点で一時停止し、凝集体は、4℃で水平旋回ロッカー上で一定に撹拌しながら、O / Nをブロックすることができます。 </li><li>前述したようにPBSFTを吸引（セクション4. 1. 4を参照）、低速に設定オービタルシェーカーで4℃でPBSFT O / N中で希釈し、必要な一次抗体を500μlとの凝集体をインキュベートします。蒸発を防ぐためにパラフィンフィルムで覆います。 </li></ol></li><li>二次抗体インキュベーション<ol><li>一次抗体溶液を吸引し、以下のようにして（4℃）を1ml PBSFT洗浄：二回5分間。三回15分間;そして、1時間4〜7倍。 4℃で低速に設定オービタルロッカーの各洗浄ステップを実行します。注意：チルが使用するメディアの前洗浄。これはフラグメントに凝集体を引き起こす可能性があるとして、氷上での洗浄を行わないでください。 </li><li>最終洗浄媒体を吸引除去し、水平旋回ロッカーで、暗所で4℃で500μlのPBSFTのO / Nで、必要な二次抗体との凝集体をインキュベートします。必要であれば、このようなヘキスト核染色を追加します。 </li></ol></li><li>共焦点縮小コピーによってマウントとイメージング<ol><li>第4節1. 4で説明したように、4℃PBSFTで凝集体を洗ってください。最終洗浄後、1 mlのPBSは、以下のように0.2％FBSおよびTriton X-100（PBT）を含有する凝集物をすすぎ：二回5分間。 15分間の三回。洗浄液を実行します室温でオービタルロッカーに光から保護。 </li><li>グリセロールの1溶液：PBT（1ミリリットル）7と第30分間のインキュベーションに続いて：の3溶液1で暗所に30分間前述したように培地を吸引除去（セクション4. 1. 4）とインキュベートグリセロール：PBT（1 ml）を。 注：ローテーターを用いて4℃でグリセロールおよびPBTの溶液を混合。 </li><li>最終的なグリセロールを吸引：PBT溶液及び媒体 24 を装着する 1ミリリットルと交換してください。 （一時停止し、パラフィンフィルムでウェルを密閉し、4℃で染色井戸を保存する場合）プロトコルは、取り付ける前に、この時点で一時停止することができます。 </li><li>カットP20チップ（ 図2）と17μlの液滴でそれらをピペットで顕微鏡スライド上の集計をマウントします。スペーサーを生成し、スライドの各端に取り付けられるように戻って、それ自体に4回を両面テープを折ります。 （ 図2）、これらのスペーサ時にトップカバースリップ（22ミリメートル×60 mm）を配置します。 注：それはカットチップがあることが不可欠です試料を損傷しないように、この段階で使用されます。スペーサは、凝集体を破砕カバースリップを防ぎます。 </li><li>凝集体が装着されると、プロトコルを使用して共焦点顕微鏡を用いた画像のサンプルは、以前に説明19,21,24,25。一度顕微鏡上に置かれ、凝集体が取り付け媒体内に解決できるようにするために数分間のステージに邪魔されずにスライドを残します。 </li></ol></li></ol>

<ol><li>Kaufman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+in+culture+of+pluripotential+cells+from+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos.</a> Nature. 292 (5819), 154-156 (1981).</li>
<li>Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+pluripotent+cell+line+from+early+mouse+embryos+cultured+in+medium+conditioned+by+teratocarcinoma+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells.</a> Proc. Natl Acad. Sci. 78 (12), 7634-7638 (1981).</li>
<li>Ramkumar, N., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SnapShot%3A+mouse+primitive+streak%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SnapShot: mouse primitive streak.</a> Cell. 146 (3), 488-488.e2 (2011).</li>
<li>Solnica-Krezel, L., Sepich, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastrulation%3A+making+and+shaping+germ+layers%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev.+Cell+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Gastrulation: making and shaping germ layers.</a> Annu Rev. Cell Dev. Biol. 28, 687-717 (2012).</li>
<li>Tam, P. P. L., Gad, J. M. Chapter 16: Gastrulation in the Mouse Embryo. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTam%2C+PPL+%22Gastrulation%3A+From+Cells+to+Embryo%22">Gastrulation: From Cells to Embryo</a>. Stern, C. D. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. New York. 233-262 (2004).</li>
<li>Sajini, A. A., Greder, L. V., Dutton, J. R., Slack, J. M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+Oct4+expression+during+the+development+of+murine+embryoid+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Loss of Oct4 expression during the development of murine embryoid bodies.</a> Dev. Biol. 371 (2), 170-179 (2012).</li>
<li>ten Berge, D., Koole, W., Fuerer, C., Fish, M., Eroglu, E., Nusse, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+Signaling+Mediates+Self-Organization+and+Axis+Formation+in+Embryoid+Bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Wnt Signaling Mediates Self-Organization and Axis Formation in Embryoid Bodies.</a> Cell Stem Cell. 3 (5), 508-518 (2008).</li>
<li>Nostro, M. C., Cheng, X., Keller, G. M., Gadue, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt%2C+Activin%2C+and+BMP+Signaling+Regulate+Distinct+Stages+in+the+Developmental+Pathway+from+Embryonic+Stem+Cells+to+Blood%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Wnt, Activin, and BMP Signaling Regulate Distinct Stages in the Developmental Pathway from Embryonic Stem Cells to Blood.</a> Cell Stem Cell. 2 (1), 60-71 (2008).</li>
<li>Irie, N., Weinberger, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SOX17+Is+a+Critical+Specifier+of+Human+Primordial+Germ+Cell+Fate%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SOX17 Is a Critical Specifier of Human Primordial Germ Cell Fate.</a> Cell. 160, 1-16 (2015).</li>
<li>Leahy, A., Xiong, J. W., Kuhnert, F., Stuhlmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+developmental+marker+genes+to+define+temporal+and+spatial+patterns+of+differentiation+during+embryoid+body+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Zool%22%5BJournal%5D)">Use of developmental marker genes to define temporal and spatial patterns of differentiation during embryoid body formation.</a> J. Exp. Zool. 284 (1), 67-81 (1999).</li>
<li>Eiraku, M., Takata, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organizing+optic-cup+morphogenesis+in+three-dimensional+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture.</a> Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).</li>
<li>Koehler, K. R., Hashino, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+mouse+embryonic+stem+cell+culture+for+generating+inner+ear+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">3D mouse embryonic stem cell culture for generating inner ear organoids.</a> Nat. Protoc. 9 (6), 1229-1244 (2014).</li>
<li>Lancaster, M. A., Renner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+organoids+model+human+brain+development+and+microcephaly%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cerebral organoids model human brain development and microcephaly.</a> Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).</li>
<li>Marikawa, Y., Tamashiro, D. A. A., Fujita, T. C., Alarcon, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aggregated+P19+mouse+embryonal+carcinoma+cells+as+a+simple+in+vitro+model+to+study+the+molecular+regulations+of+mesoderm+formation+and+axial+elongation+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Aggregated P19 mouse embryonal carcinoma cells as a simple in vitro model to study the molecular regulations of mesoderm formation and axial elongation morphogenesis.</a> Genesis. 47 (2), New York, N.Y. 93-106 (2000).</li>
<li>Keller, R., Danilchik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regional+expression%2C+pattern+and+timing+of+convergence+and+extension+during+gastrulation+of+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Regional expression, pattern and timing of convergence and extension during gastrulation of Xenopus laevis.</a> Development. 103 (1), 193-209 (1988).</li>
<li>Ishihara, K., Tonegawa, Y., Suyemitsu, T., Kubo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+blastocoelic+fluid+of+sea+urchin+embryo+induces+exogastrulation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Zool%22%5BJournal%5D)">The blastocoelic fluid of sea urchin embryo induces exogastrulation.</a> J. Exp. Zool. 220 (2), 227-233 (1982).</li>
<li>Horstadius, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Mechanisms+of+Sea+Urchin+Development%2C+Studied+by+Operative+Methods%5BTitle%5D)+AND+%22Bio.+Rev%22%5BJournal%5D)">The Mechanisms of Sea Urchin Development, Studied by Operative Methods.</a> Bio. Rev. 14 (2), 132-179 (1939).</li>
<li>Holtfreter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Die+totale+Exogastrulation%2C+eine+Selbstabl%C3%B6sung+des+Ektoderms+vom+Entomesoderm%5BTitle%5D)+AND+%22Wilhelm+Roux%27Archiv+f%C3%BCr+Entwicklungsmechanik+der+Organismen%22%5BJournal%5D)">Die totale Exogastrulation, eine Selbstablösung des Ektoderms vom Entomesoderm.</a> Wilhelm Roux'Archiv für Entwicklungsmechanik der Organismen. 129 (4), 669-793 (1933).</li>
<li>van den Brink, S. C., Baillie-Johnson, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Symmetry+breaking%2C+germ+layer+specification+and+axial+organization+in+aggregates+of+mouse+ES+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Symmetry breaking, germ layer specification and axial organization in aggregates of mouse ES cells.</a> Development. 141 (22), (2014).</li>
<li>Eiraku, M., Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organized+formation+of+polarized+cortical+tissues+from+ESCs+and+its+active+manipulation+by+extrinsic+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Self-organized formation of polarized cortical tissues from ESCs and its active manipulation by extrinsic signals.</a> Cell Stem Cell. 3 (5), 519-532 (2008).</li>
<li>Turner, D. A., Hayward, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt%2F%CE%B2-catenin+and+FGF+signaling+direct+the+specification+and+elongation+of+a+neural+axial+progenitor+in+ensembles+of+mouse+ES+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Wnt/β-catenin and FGF signaling direct the specification and elongation of a neural axial progenitor in ensembles of mouse ES cells.</a> Development. 141 (22), (2014).</li>
<li>Faunes, F., Hayward, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+membrane-associated+%CE%B2-catenin%2FOct4+complex+correlates+with+ground-state+pluripotency+in+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A membrane-associated β-catenin/Oct4 complex correlates with ground-state pluripotency in mouse embryonic stem cells.</a> Development. 140 (6), 1171-1183 (2013).</li>
<li>Kalmar, T., Lim, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulated+Fluctuations+in+Nanog+Expression+Mediate+Cell+Fate+Decisions+in+Embryonic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulated Fluctuations in Nanog Expression Mediate Cell Fate Decisions in Embryonic Stem Cells.</a> PLoS Biol. 7 (7), e1000149(2009).</li>
<li>Turner, D. A., Trott, J., Hayward, P., Rué, P., Martinez Arias,, A, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+interplay+between+extracellular+signalling+and+the+dynamics+of+the+exit+from+pluripotency+drives+cell+fate+decisions+in+mouse+ES+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Open%22%5BJournal%5D)">An interplay between extracellular signalling and the dynamics of the exit from pluripotency drives cell fate decisions in mouse ES cells.</a> Biol. Open. 3 (7), 614-626 (2014).</li>
<li>Turner, D. A., Rué, P., Mackenzie, J. P., Davies, E., Martinez Arias,, A, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brachyury+cooperates+with+Wnt%2F%CE%B2-Catenin+signalling+to+elicit+Primitive+Streak+like+behaviour+in+differentiating+mouse+ES+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">Brachyury cooperates with Wnt/β-Catenin signalling to elicit Primitive Streak like behaviour in differentiating mouse ES cells.</a> BMC Biol. 12 (1), 63(2014).</li>
<li>Ying, Q. -L., Smith, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defined+conditions+for+neural+commitment+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Defined conditions for neural commitment and differentiation.</a> Methods Enzymol. 365, 327-341 (2003).</li>
<li>Ying, Q. -L., Stavridis, M., Griffiths, D., Li, M., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+embryonic+stem+cells+into+neuroectodermal+precursors+in+adherent+monoculture%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Conversion of embryonic stem cells into neuroectodermal precursors in adherent monoculture.</a> Nat. Biotechnol. 21 (2), 183-186 (2003).</li>
<li>Rivera-Perez, J. A., Hadjantonakis, A. -K., Johnson, R., Sun, X., Escalante-Alcalde, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRivera-Perez%2C+JA+%22Molecular+Embryology+of+the+Mouse%22">Molecular Embryology of the Mouse</a>. , CSHL. 1-90 (2011).</li>
<li>Baillie-Johnson, P., van den Brink, S. C., Balayo, T., Turner, D. A., Martinez Arias,, A, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+Aggregates+of+Mouse+ES+Cells+that+Show+Symmetry+Breaking%2C+Polarisation+and+Emergent+Collective+Behaviour+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Generation of Aggregates of Mouse ES Cells that Show Symmetry Breaking, Polarisation and Emergent Collective Behaviour in vitro.</a> bioRxiv. , (2014).</li>
<li>Fehling, H. J., Lacaud, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+mesoderm+induction+and+its+specification+to+the+hemangioblast+during+embryonic+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Tracking mesoderm induction and its specification to the hemangioblast during embryonic stem cell differentiation.</a> Development. 130 (17), 4217-4227 (2003).</li>
<li>Ring, D. B., Johnson, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+Glycogen+Synthase+Kinase+3+Inhibitors+Potentiate+Insulin+Activation+of+Glucose+Transport+and+Utilization+In+Vitro+and+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Selective Glycogen Synthase Kinase 3 Inhibitors Potentiate Insulin Activation of Glucose Transport and Utilization In Vitro and In Vivo.</a> Diabetes. 52 (3), 588-595 (2003).</li>
<li>Inman, G. J., Nicolás, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SB-431542+is+a+potent+and+specific+inhibitor+of+transforming+growth+factor-beta+superfamily+type+I+activin+receptor-like+kinase+%28ALK%29+receptors+ALK4%2C+ALK5%2C+and+ALK7%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">SB-431542 is a potent and specific inhibitor of transforming growth factor-beta superfamily type I activin receptor-like kinase (ALK) receptors ALK4, ALK5, and ALK7.</a> Mol Pharmacol. 62 (1), 65-74 (2002).</li>
<li>Hao, J., Daleo, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dorsomorphin%2C+a+selective+small+molecule+inhibitor+of+BMP+signaling%2C+promotes+cardiomyogenesis+in+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Dorsomorphin, a selective small molecule inhibitor of BMP signaling, promotes cardiomyogenesis in embryonic stem cells.</a> PLoS ONE. 3 (8), e2904(2008).</li>
<li>Neely, M. D., Litt, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DMH1%2C+a+highly+selective+small+molecule+BMP+inhibitor+promotes+neurogenesis+of+hiPSCs%3A+comparison+of+PAX6+and+SOX1+expression+during+neural+induction%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">DMH1, a highly selective small molecule BMP inhibitor promotes neurogenesis of hiPSCs: comparison of PAX6 and SOX1 expression during neural induction.</a> ACS Chem. Neurosci. 3 (6), 482-491 (2012).</li>
<li>Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat. Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Niakan, K. K., Ji, H., Eggan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((12+Sox17+promotes+differentiation+in+mouse+embryonic+stem+cells+by+directly+regulating+extraembryonic+gene+expression+and+indirectly+antagonizing+self-renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">12 Sox17 promotes differentiation in mouse embryonic stem cells by directly regulating extraembryonic gene expression and indirectly antagonizing self-renewal.</a> Genes Dev. 24 (3), 312-326 (2010).</li>
<li>Chambers, I., Silva, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanog+safeguards+pluripotency+and+mediates+germline+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Nanog safeguards pluripotency and mediates germline development.</a> Nature. 450 (7173), 1230-1234 (2007).</li>
<li>Rhee, J. M., Pirity, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((et+al.+In+vivo+imaging+and+differential+localization+of+lipid-modified+GFP-variant+fusions+in+embryonic+stem+cells+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">et al. In vivo imaging and differential localization of lipid-modified GFP-variant fusions in embryonic stem cells and mice.</a> Genesis. 44 (4), New York, N.Y. 202-218 (2006).</li>
<li>Serup, P., Gustavsen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partial+promoter+substitutions+generating+transcriptional+sentinels+of+diverse+signaling+pathways+in+embryonic+stem+cells+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Dis.+Models+Mech%22%5BJournal%5D)">Partial promoter substitutions generating transcriptional sentinels of diverse signaling pathways in embryonic stem cells and mice.</a> Dis. Models Mech. 5 (6), 956-966 (2012).</li>
<li>Hooper, M., Hardy, K., Handyside, A., Hunter, S., Monk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HPRT-deficient+%28Lesch-Nyhan%29+mouse+embryos+derived+from+germline+colonization+by+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">HPRT-deficient (Lesch-Nyhan) mouse embryos derived from germline colonization by cultured cells.</a> Nature. 326 (6110), 292-295 (1987).</li>
<li>Warmflash, A., Sorre, B., Etoc, F., Siggia, E. D., Brivanlou, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+to+recapitulate+early+embryonic+spatial+patterning+in+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">A method to recapitulate early embryonic spatial patterning in human embryonic stem cells.</a> Nature Chemical Biology. 11 (8), 847-854 (2014).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Human+Fertilisation+and+Embryology+ACT+2008+-+Elizabeth+II%22">Human Fertilisation and Embryology ACT 2008 - Elizabeth II</a>. , The Stationery Office. (2008).</li>
</ol>

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

この原稿に記載された技術は、効率的かつ再現Marikawa らハンギングドロップ培養の両方を組み合わせたマウス胚性幹細胞（たmESC）そのディスプレイに編成対称破りと伸び19の凝集体を生成します。14、EB形成。これらの凝集体は、視神経カップ11と大脳皮質13としてES細胞から前方器官の生成のための既存の方法を補完する、軸方向の伸びを開発するために行くと、原腸形成中と同様の表示処理3胚葉のアイデンティティと細胞を含みますこのような急速な細胞運動19,21として。 それは外部のパターニング組織が ​​存在しない場合に発生し、接合体非対称性が19を頭出しするので、それは、対称破りのイベントの性質を推測することは興味深いです。初歩的な軸の自発的な形成は、既存のheterogenから発生する可能性が非対称の開発のための基礎を形成する細胞の出発培養物中eities。実際、ESLIF条件で培養した細胞の集団は、1つの集約によって異なる可能性があるの相対的な割合を自己複製と分化する細胞の混合物を表示します。また、私たちの研究室での準備作業は、細胞の完全に多能性集団から凝集体が（DAターナー＆準備中A.マルティネスアリアス、）組織化パターン形成における不均一性の役割を示唆し、パターニングにおける遅延開発や欠陥を示すことを示唆しています。これは、反応拡散機構離れ骨材の表面からの阻害剤の拡散と、パターンを生成することができることを考えるとも価値があります。 Warmflash ら 41は 、このようなメカニズムが三次元でパターニングのための可能な候補作り、接着培養で放射状非対称性を開発するための責任であることを示唆しています。 イニシア中にL 48時間の集計期間は、細胞は、二次媒体19,21,24からのシグナルに応答する能力である、着床後の胚盤葉上層、内と同様の状態に達します。一般的に、ここで説明するプロトコルは、伸長のための十分な信号を提供する（例えばWntシグナル/βカテニンアゴニストなど）の要因が含まれている二次媒体のパルスで細胞を提供します。凝集細胞がオンするためのマトリゲル滴に移した前アル前ランカスターら培養方法。（ヒトESC 13を使用）、永楽ら。（たmESC 11を有する）は、低接着性の96ウェルプレート中で凝集の短い期間を使用し文化を行きます。凝集およびマトリゲル挿入の間の時間は、研究の間で異なったが、両方の場合において、多数の細胞を凝集体形成（約3,000-4,500細胞）のために使用しました。対照的に、プロトコル19ははるかに少ない細胞（約400細胞を使用してここに記載さ）集合当たりの伸長、対称性破壊及び19で観察された偏光の過程に不可欠であることが決定されています。また、これらの細長い構造は人工のマトリックス中に埋め込 ​​むことなく、はるかに短い時間周期で生成することができます：ランカスターらによって定義された脳領域の生成を比較する（&gt; 20〜30日）永楽から13と、光学カップ。ら（〜11日）、11偏細長い構造の生 ​​成に必要な5日間です。 しかし、ここで説明する培養方法と制限の1つは、その大きさは井戸の底に沈むと非にでも接着性を強制するために、重力の下でそれらが有能なレンダリングまで、彼らは唯一のメッ​​キポスト約5〜6日間培養することができるということですコー​​ティングされたプラスチックウェア。 、先に述べたもののような人工のマトリックスを用いたさらなる実験は、私たちはの期間を長くすることを可能にします観察と実験、ワークオン行くように集合体を拘束する効果を決定することです。この技術のさらなる限界は、凝集物を除去することなく、メディアを変更するために、培地の少量をウェルの底に残さなければならないことです。化学遺伝学のための結果は、アプローチは、この希釈し、前のメディアからの残留効果を検討する必要がある：3μMチーパルスの日に、2.37μM溶液を実際に配信し、その後のメディアの変更は0.499のキャリーオーバーが生じていますμM（72〜96時間）と時間の点の間の0.105μM（96から120時間）。現在の仕事は、希釈のために修正されていない、それは日常の中の変更が残留効果を最小限にすることを想定しています。 内および実験間の再現性の両方を確保するためのプロトコルにおける重要なステップの数があります。まず、たmESCの出発培養物は十分に維持されていない共同オーバーする必要がありますnfluent、および媒体は常に良い品質、すなわちである必要があります。、新鮮でよく混合（ 図5A、B）。悪い培養条件は不利に集約（ 図5Bi）に影響を与えます 。 〜400セル/ 40μlの細胞懸濁液を得るための細胞の正確なカウントより大きな凝集体は、自己組織化に失敗し、各ウェル内の二重凝集体を形成する可能性が高いように、必要不可欠である（ 図5Bii）より小さな凝集体は正しいに到達することができないのに対し、彼らは刺激（ 図5Biii）に対応することができます密度。重要な最適化ステップは、細胞懸濁液からの汚染物質の血清を除去する第二のPBS洗浄（2.6ステップ）を含めることでした。これは、集計頻度が向上し、約24時間までに集合体の開発を加速させました。次に、確実に媒体の変更がウェルの表面に付着する可能性がある任意の凝集物を除去するのに十分な力が印加されます。そうRESUを行うに失敗骨材「クラッシュ」でLTS（ 図5Biv）。さらに、以前に言及した（以下）としては、凝集体は、懸濁培養中に維持され、任意の表面に付着することが防止されることを保証することが不可欠です。凝集物が付着したら、遺伝子発現及びその伸びの可能性のパターンが破壊されます。 この技術は、比較的簡単で、かつ十分に良好な組織培養技術を有する個体の任務の範囲内にあるように、凝集に関連する問題の多くは、比較的迅速に、これらの重要なステップに従っている場合に解決することができます。トラブルシューティングの完全なテーブル（表1）が利用可能です。マスターと、この技術は、軸開発、対称性破壊および細胞決定イベントを研究するために使用することができます。具体的には、これらの凝集体は、脊髄およびモトとしてこれまで培養物中で利用できなかった細胞のプールを生成する可能性を有しますr個のニューロン。 倫理注：これは、ヒトESやiPS細胞培養物へのこのプロトコルの翻訳はヒト胚の研究、原始線条の、すなわち世代の14日の制限の法的根拠に近い実験をもたらすことができることにより、慎重に注意すべきです、ヒト受精胚研究法と2008（英国）42で説明するように。同法に関係なく、作成した方法のすべてのライブ人間の胚をカバーしているので、ステージのような原始的ストリークを超えた人間gastruloidsの文化は、ライセンス供与研究の範囲を越えています。

初期の哺乳類の発生における細胞運命決定の研究と理解は胚性幹細胞（ESC）の文化、自己更新し、生物、すなわち 、すべての細胞型に分化する能力を持つ胚盤胞由来クローン集団を利用することができます。、彼らは多能性1,2です。これらの培養物がされていると細胞運命決定の分子基盤を理解するために有用であることが継続しているが、それらは原腸形成中の胚で生成された空間的配置とグローバル行動の一部を再現することはできません。胚では、原腸形成のプロセスは、3つの異なる胚葉に単一上皮層を変換し、明白な前後組織3-5で胚を付与します。 ex vivoでこれらのイベントを再現しようとする試みは、ESCの三次元凝集体の発生に基づいて、胚様体（EB）と呼ばれ、それらにTを施すされていますO分化条 ​​件6,7。これらの凝集体は、いずれかの得られるか、または誘導された低効率で接着培養または全く製造できないことができないいくつかは、多くの異なる細胞型に分化するようになだめすることができる; 例えば 、血液8および始原生殖細胞9。 EBの使用には制限がしかし、空間的な崩壊6,10で、その結果、発生中の胚の主要な特性であること胚葉分布や軸方向の組織、彼らは形態形成の動作を表示することができないということです。ある報告では、WntとEBの治療は、いくつかの集合体における遺伝子発現の弱い分極につながるが、明確な形態形成は7を観察されません。より最近の報告では、長期間にわたって培養されたEBは、その胚の対応を模倣するように網膜、皮質および内耳感覚細胞として前部構造を開発するが、軸方向のorganizatのコンテキストなし開発しますイオン11-13。 Marikawa らの報告14は 、ハンギングドロップ法により形成されたマウスP19胚性癌（EC）細胞の集合体で作業しながら、両生類でexogastrulaeで観察された伸びを思わせる中胚葉起源の細長い構造の出現を報告しましたウニ胚とケラー植15-18。これはマウス胚性幹細胞（たmESC）で観察されていなかったとして、我々はたmESC 19の集合体を使用して、P19 EC細胞で観察された現象を再現しようとしたと我々は彼らの対称性の破れと軸方向の伸びにつながる培養条件を報告します。 P19細胞を用いた作業の重要な違いは、ここで説明する集約プロトコルが代わりに懸滴の、永楽ら 20によって記載されたものと同様の96ウェルプレートで行われることです。この変更は、集約回復の観点との両方で効率の向上をもたらしました内および実験間の再現性。重要なことは、個々のウェルに凝集体を維持することは、凝集体（懸滴から共通プール集合体）との間の融合が生じないことを保証します。また、プロトコルの重要な特徴は以下の集約、GSK3阻害剤CHI99021（カイ）、Wnt /βカテニンシグナル伝達の強力な活性化への24時間の暴露です。 ここで説明する方法は、推論がインビボ19,21 の軸開発に関して行わできるようにすること、文化の中で自己組織化のプロセス、軸組織および生殖層の仕様を理解するための基礎を提供します。これらの理由のための方法は、胚で勉強することが困難な場合があるプロセスの詳細なメカニズムの分析を可能にする可能性を有します。さらに、潜在的なアプリケーションが原因のような構造化された細胞のニッチの欠如に接着培養で容易に得ることができない組織や器官の世代であり、脊髄は21とモータニューロンを前駆体です。三次元集約文化が空間的に組織的に胚系統の誘導のための新しいアプローチにつながる、従来の手段によって達成可能ではないかもしれない物理的な構造およびシグナリング環境を提供しています。

<table><tbody><tr><td>2-メルカプトエタノール</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td>31350-010</td><td></td></tr><tr><td>25 cm2 細胞培養フラスコ</td><td>Grenier Bio-one</td><td>690 175</td><td></td></tr><tr><td>卓上型遠心分離機</td><td></td><td>MSE MSB020.CX1.5</td><td></td></tr><tr><td>BES 緩衝生理食塩水 (BBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B2891</td><td>BBS+CaCl2 50 mM BES ナトリウム塩、280 mM NaCl、1.5 mM Na2HPO4 を蒸留水 1 mM CaCl2 に溶解し、pH 6.96 に調整し、1 M HCl&nbsp;</td></tr><tr><td>遠心分離チューブ(15または50 ml)</td><td>Greiner Bio-One&nbsp;</td><td>118271または227261</td><td></td></tr><tr><td>CHIR 99021 (Chi)</td><td>CSCR</td><td></td><td>ウェルカムトラスト-医学研究評議会ケンブリッジ幹細胞研究所を通じて購入。ストック濃度:DMSO</td></tr><tr><td>解剖ウェル(内径30 mm)</td>の10 mMフィ<td>ッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>12678586</td><td></td></tr><tr><td>ESLIF</td><td></td><td></td><td>500 ml GMEM、5 mlピルビン酸ナトリウム、5 ml非必須アミノ酸、5 mlグルタマックス、1 mlベータメルカプトエタノール、50 ml FBSおよび550 &l LIF (1,000台)</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清 (FBS)</td><td>Biosera</td><td>FB-1090/500</td><td></td></tr><tr><td>ゼラチン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890-100G</td><td>蒸留水に1%(w/v)溶液に溶解し、オートクレーブ滅菌し、PBS(下記参照)で0.1%に希釈して個別使用。</td></tr><tr><td>グラスゴーのミニマルエッセンシャルメディウム(GMEM)</td><td>Gibco</td><td>11710-035</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050-038</td><td></td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>改良型ノイバウアー血球計算盤</td><td>ホークス</td><td>リーAS1000</td><td></td></tr><tr><td>白血病抑制因子(LIF)、組換え</td><td>CSCR</td><td></td><td>ウェルカムトラスト-医学研究評議会ケンブリッジ幹細胞研究所によって社内で製造されています。</td></tr><tr><td>n-ガレートプロピル</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>02370</td><td></td></tr><tr><td>N2B27/NDiff 227</td><td>Stemcells, Inc.</td><td>SCS-SF-NB-02</td><td><a href="http://www.stemcellsinc.com/_literature_40366/Technical_Specifications_Ndiff">http://www.stemcellsinc.com/_literature_40366/Technical_Specifications_Ndiff</a></td></tr><tr><td>非必須アミノ酸</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド粉末</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>水に溶解して8%ホルムアルデヒドストック溶液を形成します。BBS+CaCl2で希釈して4%の作業溶液を得る</td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水(PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8662</td><td>カルシウムと</td></tr>ピル<tr><td>ビン酸ナトリウム</td><td>Invitrogen</td><td>11360-039</td><td></td></tr><tr><td>滅菌リザーバー</td><td>STARLAB</td><td>E2310-1010</td><td></td></tr><tr><td>滅菌、非組織培養処理、U底96ウェルプレート</td><td>グルニエBio-one</td><td>650185</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr></tbody></table>

対称性の破れ、偏光と創発集団行動を表示、マウス胚性幹細胞の凝集物の生成<em&gt;インビトロ</em

Generation of Aggregates of Mouse Embryonic Stem Cells that Show Symmetry Breaking, Polarization and Emergent Collective Behaviour In Vitro

我々は現在の自己組織化の研究を可能にする胚様体（EB）の文化、対称性の破れ、軸方向伸長および懸濁培養でマウス胚性幹細胞（たmESC）の集合体を用いて細胞の運命の仕様を改善プロトコルを開発しました。たmESCの少数は、それらが実験的シグナルに応答する能力があるその後、非組織培養処理された、U底96ウェルプレートで48時間基礎培地に集約されます。処理後、これらの凝集体は、偏遺伝子発現の兆しを見せ、徐々に外部非対称性の手がかりのない状態で細長い、よく組織構造への細胞の球状の塊から、その形態を変えるために始めます。これらの構造だけでなく、三胚葉のマーカーを表示することができますが、積極的に決定的に細長い構造の一つの領域で発生する骨材からの個々の細胞の方向性脱落によって証明原腸陥入のような動きを、表示します。このprotocオールは、これらの凝集体の再現性の形成、などのWnt /βカテニンの活性化及びBMP阻害および単一の時点またはタイムラプス蛍光顕微鏡によるそれらの分析などの信号との刺激のための詳細な方法を提供します。さらに、当社は固定凝集体内の特​​異的マーカーの免疫細胞化学分析のための現在の全体のマウントマウス胚染色手順の変更について説明します。凝集体の形態、遺伝子発現及び長さの変化を定量的シグナルが、軸方向の運命を変えることができる方法についての情報を提供し、測定することができます。これは、このシステムは、このような軸方向の開発や組織として初期発生事象の研究の両方に適用され得ることが想定され、より広範に、自己組織化および細胞の意思決定のプロセス。それはまた、脊髄および運動ニューロンのような従来の接着培養か​​ら得られないある胚に存在する細胞型の生成に適したニッチを提供することができます。

すぐにメッキした後、および集約後の細胞の外観すぐにプレーティングした後、いずれかの標準的な倒立組織培養顕微鏡（ 図1B）で、96ウェルプレートの各ウェル内に単一細胞の存在を観察することができます。メッキの8時間以内に、これらの細胞は重力によってウェルの底に降下し始めているし、個別のクラスタ（ 図1C）に合体し始めています。 24時間後、合体細胞は一次凝集を完了しているし、個々の細胞が互いに（ 図1D）から不明瞭であり明確に定義された、まだぼろぼろの凝集体に圧縮しています。二日目（48時間）の終わりまでに、凝集体が「クリーン」になります、よく（ 図1E）内のすべてのセルを取り上げました。ウェルの底部は、この段階で集合から放出されているいくつかのセルを有していてもよいです。提供凝集体はこの時点で、N2B27に集約されていることを、彼らは、直径約150〜200ミクロン、自由にウェル内の移動（ すなわち 、ウェルの底に付着していない）、球状である必要があります。他のメディアでの集約（ すなわち 、特定の因子とESLIFまたはN2B27）が初期の凝集形態とその後の刺激に対する応答の両方変更する可能性を有する（ターナーら、準備中）。 代表的形態変化 48と72時間の間にカイを含む二次媒体（ 図1A、5A）の24時間パルスの添加は胚葉19,21の特異的なマーカーの偏発現を示す明確に定義された細長い凝集体を生成します。すぐにカイパルス（72時間）の後、凝集体は細胞を当てると、この日の終わりに向かって、これらの信号への反応（ 図3A）を表示するために開始するために開始されます。これらの応答凝集体はN2B27の最初の48時間の集約期間（ 図3B）は、次の受けた治療に依存しているどちらの遺伝子発現および形態の変化によって明らかにされています。唯一のエンドポイント解析が必要な場合は、画像に最適な時間凝集体は約96から120時間です。この時点で、凝集体は、明確な形態と遺伝子発現パターン（ 図3A）を開発してきたし、P200ピペットからの培地の排出が付着している可能性があり、そのいずれかを除去するのに十分であるので、そのサイズと質量は、まだ十分に低くなっています。ウェルに集合体の付着を防止するために失敗すると、悪影響の凝集体形成（ 図5Biv）に影響します。凝集体の形態と遺伝子発現パターンは、治療に応じて変更することができます。単一治療または因子の組み合わせのいずれかでの持続的又はパルス政権のための代表的な結果をBMP4、ドルソモルフィンH1のために示されている（BMP受容体阻害剤）、ActivinA、SB43（アクチビン/ Nodalの阻害剤）、bFGFのかPD03（MEK阻害剤）（ 図3B）。 集計イメージングと定量的画像解析凝集体は、（主にタイムラプスイメージングのための19）のいずれか広視野顕微鏡でイメージングに適している、または19,21（ 図2）共焦点イメージングのために固定して免疫染色しました。現在のプロトコルとイメージング説明は上記の定量的な情報は、これらの凝集体から得られることを可能にします。以下、共焦点または広視野画像キャプチャ、長さ（球面または細長い; 図4A、B）凝集体の直径または脊柱に沿って対応する遺伝子の発現を測定することができます。これらの分析はまた、一つの異なる条件下での凝集体の成長、サイズ、および伸び率の情報を得ることができるタイムラプス画像、（ 図4に直接適用されています</strong&gt;）。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53252/53252fig1.jpg" /> 図1.標準的な時間経過と初期の形態。（A）凝集実験のための典型的な時間経過。細胞を96ウェルプレート（P1、P2）でマウスES細胞（10細胞/μL）の懸濁液を含むN2B27中で48時間、集約されます。（B）すぐに（T =〜5分）をメッキした後、個々の細胞がすることができます懸濁液中に見られ、8H（C）で塊を形成し始めている。（D）24時間後の細胞は約100μmの直径である各ウェルの単一の集約を形成している。（E）48時間の集計後、集計直径150-200ミクロンの範囲です。 Bが変更される前に、この時点で、凝集培地（N2B27）が除去され、二次培地は、実験（パートAにおけるP1）の残りの部分または24時間のいずれかに添加されN2B27（A部におけるP2）にACK。スケールバーは100μmを表す。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53252/53252fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53252/53252fig2.jpg" /> 図2.顕微鏡スライド上にマウント集合体。凝集体が固定された後、免疫染色およびメディアをマウントに配置されたが、各集計は17μlの滴として顕微鏡スライド上にピペットされる（A、B、B &#39;）。十分なスペースは、そのマージを防止するために、集計滴間に残されています。スペーサは、両面テープを用いて作られ、顕微鏡スライド（A、A &#39;、B）の各隅部に配置されます。これは、カバーガラスが配置され、これらの上にある。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53252/53252fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 集約されたES細胞の形態に対する異なる処理の効果。図。N2B27で2日後、ES細胞は、凝集体を形成しています。特定の要因の1日パルス（A）として、または連続的にのいずれかで（B）の添加は、遺伝子発現、伸長可能性、またはそれらの全体形状の極性に対する凝集体の表現型を変化させることができます。この図の例では、ブラ:: GFP 30（A）または SOX1のいずれかから形成された骨材:: GFP 27（B）は、マウス ES細胞120時間後に画像化し、指示に従って処理されます。ホーチミン：CHIR 99021 31。 SB43：SB 431542 32; DM：DorsomorphinH1 33,34; PD03：PD0325901 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53252/53252fig3large.jpg" target="_blank">番目の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください</a>図です。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/53252/53252fig4.jpg" /> 図4.集約。ブラから形成された典型的な集合体の定量分析 :: GFPたmESC 25,30は、ホーチミンの24時間のパルスの後、120時間後に画像化しました。マージされた明視野像とGFPチャネルは、点Aから集合体の蛍光と長さを測定することができ、それに沿ってB（A）、（B）への集約の「背骨」をマーキングセグメント化されたラインで示されています。長さ（C）と同じ実験内の24の凝集体から「丸み」（D）が示されています 。このような丸み（D）、円形、周囲および面積などの形状記述子は、画像解析ソフトウェアフィジー35から画像解析クックブックプラグインを使用して測定することができます。各時点での水平線で示した意味。エラーバーは標準偏差を示します。 （A）中のスケールバーは200μmで示しています。レポーター細胞株との間の微妙な違いがあるように、カイのパルスの後、凝集体の平均最大長さと最小の平均円形度が変化することが予想されます。異なる細胞株の間に、我々は平均最大長は400〜800ミクロンと0.4と0.6との間の平均最小真円度〜の範囲内とすることができることがわかります。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53252/53252fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/53252/53252fig5.jpg" /> 凝集体形成の失敗の図5.例。再現性の集合体（A）を生成する能力は、（BI）、新鮮でよく混合二次媒体、（BII、BIII）などの重要な要因の初期のnをカウントの精度に依存します細胞のアンバーと（BIV）凝集体は、すなわち接着性コロニーを形成しない保証する。ウェルの表面に、「クラッシュ」。上述の条件（B）のそれぞれについて、凝集体形成における誤差の典型的な例が示されています。示されるように、スケールバー;詳細については、トラブルシューティングの表 （表1）を参照してください 。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53252/53252fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="表1" src="/files/ftp_upload/53252/53252table1.jpg" /> トラブルシューティングの表1ガイド。集約プロトコルに関連の典型的なエラーは、その解決方法についての提案を与えられています。 <img alt="表2" src="/files/ftp_upload/53252/53252table2.jpg" /> AGGの形成のために試験した細胞株の表2表regates。細胞株との間の微妙な違いが予想されるが、凝集体とを形成するために特徴づけられていると観察された19,22,27,30,36-40細胞株の数は、上記のすべての行が条件で同様の動態を示します伸びと形態の。遺伝子発現の観点から、発現パターンは、発現された遺伝子に特異的であるが、各細胞株内で発現パターンは、継代の数に対する一般的一貫性があります。一貫性のために、私たちは文化の中で15継代を超えていない細胞からの凝集体を生成します。 <img alt="表3" src="/files/ftp_upload/53252/53252table3.jpg" /> これらの研究で使用される代表的な抗体の表3のリスト。抗体および集約免疫染色のために使用される希釈係数を選択します。

私たちは、自己組織化、対称性の破れ、軸方向の発達と並行する伸長を示すマウス胚性幹細胞の凝集体を生成するためのプロトコルを開発しました。この技術により、軸方向の発生過程の研究や、単層培養では困難な細胞タイプの作製が可能になります。

We have developed a protocol improving current Embryoid Body (EB) culture which allows the study of self-organization, symmetry breaking, axial elongation ...

このプロトコルの総合的な目的は、自己組織化および軸方向への伸長を行い、懸濁培養が可能なマウス胚性幹細胞の一様な凝集塊を作製することです。この手法は、胚形成における組織間相互作用の役割や、原腸陥入のようなプロセスにおける自己組織化など、発生生物学分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。本手法の主な利点は、凝集前の胚の外側で、新たな脱構築的な視点から発生イベントを研究できることです。凝集体の作製のため、マウス胚性細胞（M MECs）をゼラチンコートした25 square centimeter組織培養処理済みフラスコ内でES.Lift培地を用いて維持します。細胞密度が40〜60%Confluenceに達した組織培養フラスコを使用し、培地を吸引してフラスコ内をPBSで2回洗浄します。0.25%trypsin EDTAを1 milliliter加え、37 degrees Celsiusで約5分間インキュベートして、フラスコから細胞を剥離させます。次に、剥離した細胞懸濁液に5 mLのEs.Lift培地を加え、十分に混ぜ合わせます。細胞を50 mL遠心チューブに移し、細胞数を計測するために1 mLのアリコートを分取します。5 × 10⁴個の細胞を5 mLの温めたPBSに加え、170 ×gで5分間遠心分離します。ペレットを乱さないように溶液を吸引します。次に、5 mLのPBSを静かに加え、遠心分離を繰り返します。細胞ペレットを乱さないように、最大限の容量を吸引して取り除きます。PBSのキャリーオーバーを防ぐため、細胞ペレットを1 mLの温めたN2B27培地で再懸濁します。P1000ピペットで十分に混ぜ合わせ、均一な細胞懸濁液を作成します。次に、さらに4 mLのN2 B27培地で希釈します。マルチチャンネルピペットを用いて、細胞懸濁液を滅菌済みのリザーバーに移します。細胞を十分に混ぜ合わせ、リザーバーから細胞懸濁液40 µLを、組織培養処理されていないubo nonの各ウェルに分注します。96ウェルプレート。細胞のプレートへの接着を最小限に抑えるため、あえて組織培養用ではないプレートを使用します。プレートを37°C、5% CO2の加湿インキュベーター内で48時間インキュベートし、48時間後に細胞凝集させます。プレートをインキュベーターから取り出し、倒立顕微鏡下で細胞を観察して、凝集体の存在を確認します。10 millimolarのCHI 9 9 0 2 1ストック溶液を、加温したN two B 27に最終濃度が3 micromolarとなるように添加します。これが細胞刺激用の二次培地となります。マルチチャンネルピペットを使用して、各ウェルに二次培地を150 µLずつ分注します。付着した凝集塊を剥離させるのに十分な力で操作してください。インキュベーション後、プレートを細胞培養インキュベーターに戻し、24時間静置します。細胞凝集塊を吸引しないように注意して、培地を取り除きます。各ウェルに150 µLの新鮮な N two B 27 を、付着している凝集塊を剥離させるのに十分な強さで加えます。これを24時間ごとに繰り返し、計5日間ほど培養します。固定のための凝集体を準備するには、まずピペットを30度の角度に保持し、各ウェルから培養液を穏やかに吸引します。細胞凝集体の吸引を防ぐため、各ウェルに150 µLのPBSを加えます。凝集体が底に沈殿するまで数分間待ち、その後PBSを吸引します。滅菌済みのハサミを使用して、この洗浄工程をさらに2回繰り返します。P 1000ピペットチップの先端から約3 mm上の位置でチップを切断します。このチップを用いて、少量の液体を吸い込み、ウェル内に放出させて終了します。凝集塊を攪拌してウェルの底から剥離させます。次に、チップで凝集塊を吸い上げ、ガラス製のショウジョウバエ解剖皿へと移します。同様の手順で、同一の免疫染色処理を行うすべての凝集塊を、1つの解剖皿に回収します。ディセクションウェルを顕微鏡下に配置し、軽く回して凝集塊を中央に寄せます。次に、凝集塊を除去しないように注意しながら、ウェルの端からPPSを慎重に吸引します。凝集物を固定するために、調製したばかりの4%ホルムアルデヒド溶液を1 mL加え、オービタルシェーカーを用いて4 °Cで2時間インキュベートします。回転速度は低速に設定してください。凝集物を吸引しないよう注意しながらホルムアルデヒド溶液を吸引し、その後、ウェルに1 mLのPBSを加えます。プレートをオービタルシェーカーに戻し、10分間振盪します。ウェルからPBSを取り除き、この洗浄工程をさらに2回繰り返します。次に、1 mLのPBSFT溶液を加え、プレートをオービタルシェーカーに載せて10分間振盪します。溶液を吸引し、洗浄をさらに2回繰り返します。凝集体の非特異的な免疫反応をブロックするため、1ウェルあたり1 mLのPBS-FTを添加します。プレートをオービタルシェーカーに載せ、4°Cで低速にて1時間振とうします。インキュベーション後、ウェルからブロッキング液を慎重に吸引し、P-B-S-F-Tで希釈した一次抗体 500 µL を加えます。蒸発を防ぐためにプレートをパラフィルムで密閉し、低速のオービタルシェーカーを用いて 4 °C で一晩インキュベートします。次に、一次抗体溶液をあらかじめ冷却した P-B-S-F-T に置換します。プレートをオービタルシェーカーに設置し、凝集体を洗浄します。4 °Cの低速で5分間設定してください。この洗浄操作をもう一度繰り返します。オービタルシェーカーを用い、4°C、低速でPBS-FTによる洗浄サイクルをさらに2回行います。テキストプロトコルに従い、洗浄液を除去し、PBS-FTで希釈した二次抗体 500 µLを加えてインキュベートします。核を可視化するために 1 µg/mLのherstを添加し、遮光状態で、ジャイラトリーローターを用いて4°Cで一晩インキュベートします。アルミホイルで包んだボックスに入れ、遮光した状態で、4 °CでPBS FTを用いてさらに1回洗浄サイクルを行います。続いて、0.2% FBSおよび0.2% Triton X 100を含むPBS、またはPBTバッファーを用いて、室温で追加洗浄を行います。溶液を慎重に吸引した後、1:1のグリセロールとPBTの混合液1 mLを加え、室温・暗所にて30分間、凝集体をインキュベートします。その後、1 mLの7:3グリセロール/PBT溶液で30分間インキュベートします。共焦点イメージングの準備として、グリセロール/PBT溶液を吸引して除去し、1 mLの封入剤に交換します。次に、凝集塊を17 µLの液滴としてガラススライド上に封入します。ピペットチップを用いて、両面テープを4回折り畳み、スペーサーを作成します。次に、スライド上の凝集体の両側にスペーサーを1つずつ配置し、カバーガラスを反転させてスペーサーの上に滑り込ませ、共焦点顕微鏡を用いて凝集体のイメージングを行います。播種から48時間後には、直径約150 µmで境界が滑らかな凝集体が形成されます。一方で、培地の品質不良、不適切な細胞播種数、または細胞接着の不備により、適切に凝集しない場合があります。グリコゲン合成酵素キナーゼ3阻害剤であるCHI 99021による120時間の連続処理を行うと、球状の凝集塊は伸長します。また、処理後は凝集塊の一端にSOX GFP陽性細胞が明確に局在します。処理条件が異なれば、単一の凝集塊の形態および蛍光マーカーの形態変化も異なります。凝集塊内での局在を経時的に追跡することが可能です。習熟すれば、適切に実施することで約45分で凝集塊を作成できるようになります。凝集塊が形成された後は、凝集塊内の遺伝子発現の変化を調べるために、免疫染色の代わりにQ-R-T-P-C-Rなどの他の手法を行うことができます。このビデオを視聴することで、MECsから凝集体を形成する方法、特定の刺激を適用する方法、および免疫染色と共焦点顕微鏡解析のために凝集体を調製する方法について十分に理解することができます。

generation-aggregates-mouse-embryonic-stem-cells-that-show-symmetry

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

このビデオでは、ハンギングドロップ法を用いて胚様体には、マウス胚性幹細胞のin...

ハンギングドロップ法を用いたマウス胚性幹（MES）細胞のin vitroにおける分化

彼らは多能性のための標準的なテストを通過した時、誘導多能性幹細胞（IPSC）ラインを生成することはあっても発生能の異なる行が生成されます。ここでは、所有している完全な多能性としてIPSC行を定義性IPSC、から完全に由来するマウスを作製するためのプロトコルを記述する...

人工多能性幹細胞に由来するマウスの作製

このビデオでは、マウス胚性幹細胞(mESC)から神経前駆細胞(NPC)をin...

マウス胚性幹細胞から神経前駆細胞を作製する技術

ここでは、許容的培養条件下でヒトの生物学的特徴を再現収縮筋線維（myospheres）の三次元クラスターを形成し、骨格筋前駆細胞の均質な集団を生成することに向けて、ヒト胚性幹細胞（hESC）のエピジェネティックな再プログラミングに基づくプロトコルを記載骨格筋。...

エピジェネティックリプログラミングによるヒトES細胞からMyospheresの生成

ヒト多能性のサスペンション集計ベースの心臓分化を開始する従来の方法は、細胞（hPSCs）は凝集体の大きさや形状に関して培養異質で悩まされている茎。ここでは、サイズ制御HPSCは心臓の促進条件下で培養された凝集体を生成するためにマイクロウェルを用いた心臓分化のための堅牢な方法を説明します。...

ヒト多能性幹細胞の懸濁液ベースの心臓分化のためのマイクロウェル中の凝集体サイズの最適化

このプロトコルでは、変更された胚様体-単層法を用いたマウス胚性幹細胞から皮質介在ニューロン前駆細胞と後細胞分裂の介在ニューロン前駆体を生成するためのメソッドについて説明します。これらの前駆細胞/前駆体生体外で使用することができますまたは蛍光ソート運命決定を研究するため新生児大脳新皮質に移植や治療への応用で使用されます。...

マウス胚性幹細胞の皮質介在ニューロン前駆細胞への分化

細胞外マトリックスリガンドは、ポリアクリルアミドヒドロゲル上にパターン化することができ、準拠基板上の閉じ込められたコロニーにおけるヒト胚性幹細胞の培養を可能にする。この方法は、トラクション力顕微鏡と生化学アッセイと組み合わせて、組織形状、細胞発生力、および運命指定の相互作用を調べることができます。...

組織レベルの力学を制御するための準拠基板上のヒト胚性幹細胞コロニーの幾何学的パターン化

我々は、胚性幹細胞から生成された胚体における高スループットシーケンシングに続く定量染色体立体構造捕捉の適用を報告する。この技術は、胚性幹細胞分化中に所定の遺伝子の推定エンハンサーとプロモーター領域との接触を同定し、定量することを可能にする。...

定量染色体立体構造捕捉による胚体におけるエンハンサー・プロモーター接触の同定(4C)

我々は、二次元(2D)成長および創傷修復アッセイのタイムラプスイメージングのための一次マウス胚口蓋間葉細胞の単離および培養のためのプロトコルを提示する。また、タイムラプスイメージングデータの解析方法を提供し、細胞流の形成と指向運動性を決定します。...

集団運動属性を解析するためのマウス胚性口蓋前葉細胞の単離とタイムラプスイメージング

このプロトコルは、マウス多能性幹細胞（PSC）から機能洞結節組織を生成する方法について説明します。 T-BOX3（TBX3）過剰発現プラス心臓ミオシン-重鎖（MYH6）プロモーター抗生物質選択は、高純度のペースメーカー細胞凝集につながる。これらの「誘導された-洞房-体」（「iSABs」）、80％以上のペースメーカー細胞を含む非常に増加鼓動率を示し、ex vivoで心筋をペーシングすることができます。...

MYH6プロモーター - 選択と組み合わせたES細胞のプログラミングに基づいて、マウス心臓ペースメーカー細胞凝集体の生成

学ぶマウス胚性幹細胞凝集物の作製法。ES.Lift培地で培養し、非接着性プレートで凝集させ、軸方向の伸長と自己組織化を観察する。発生生物学における組織相互作用と細胞分化の理解に有用なモデルです。

対称性の破れ、偏光と創発集団行動を表示、マウス胚性幹細胞の凝集物の生成

さらに動画を探す