Name: ALSのSOD1-G93Aマウスモデルにおける疾患進行を評価するためのクイック表現型の神経学的スコアリングシステム (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 49 s
Description: 学ぶALSのSOD1-G93Aマウスモデルにおける神経学的スコアリングシステムによる疾患進行評価法。後肢機能の日次評価により、神経筋機能を迅速かつ信頼性高く測定し、治療効果の判定に有用です。

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原稿を批判的にレビューしてくれたBeth Levine氏、ジェノタイピングプロトコルを開発したValerie Tusinari氏、そして彼らの優れた動物ケアを提供してくれたMatt Ferola氏とCarlos Maya氏に感謝したいと思います。

すべての実験動物の管理と使用のための健康ガイドの国立研究所によって記載されたプロトコルに従って実施されており、ALS TDIの制度的動物のケアと使用委員会（IACUC）によって承認されました。 1.動物、住宅、および研究デザイン注意：SOD1-G93Aマウスコロニーは、もともとガーニーら7によって生産高コピーB6SJLTgN（SOD1G93A）1Gur株に由来するものでした。コロニーは、現在、野生型C57BL / 6-SJL F1の雌とトランスジェニックC57BL / 6-SJL男性を交配することによって維持されています。 F1動物をB6雌とSJL男性を交配することによって生成されます。マウスは、生​​後35〜45日でALSのTDI毎週に出荷されます。 <ol><li>マウス少なくとも1週間は研究に割り当てる前（18〜23°Cと40〜60％の湿度の温度で、12時間の明/暗サイクル）動物施設に順応できるようにします。 </li><li>ハウスオスSOD1-G93Aマイクグループを収容するので、ケージごとに電子1マウスは、男性は戦うために傾向があります。ケージ当たり最大2つの家の女性SOD1-G93Aマウス。プラスチック小屋の形で、環境エンリッチメントを提供します。マウスは、水/食品飲料に薬物投与を必要とする研究の一部である場合を除き、食料および水を自由に摂取させてください。これらのケースでは、配給、レコード食料と水。 </li><li>年齢50日目の周りの薬剤有効性試験を開始し、64ゴミをマッチさせたジェンダーバランスのとれたマウス（コホートごとに32）が挙げられます。最後に、研究を行う研究者が実験条件を知らされていることを確認。 注：これは、典型的な薬剤の有効性の研究は、しかし、それは前または後の研究を開始することが望ましいかもしれない治療的介入の種類に基づいて、年齢50日に開始することをお勧めします。 注意：コホートあたり32匹のマウスを用いた研究は、性特異的薬剤の効果を検出するために供給されています。何の性別固有の比較が必要とされない場合は、コホートあたり24匹のマウスは、全体的な薬剤の効果を検出するために十分なはずです。</li></ol> 2.体重<ol><li>グラムの10分の1の精度で日常の研究におけるすべてのマウスのレコードの体重。注意：体重は疾患進行の慢性薬物治療から生じる可能性の倦怠感の敏感な指標です。 </li><li>マウスの体重は、このように、朝に高いこと、日中かなり変動毎日同じ時期にそれらを記録。 </li></ol> 3.神経学的スコアリングシステム（NeuroScore） <ol><li> A）マウスがその尾によって中断され、b）のマウスは、歩くことが許可され、麻痺cの発症後）：順次実行次の3つの条件の下でマウスを観察することで、毎日、各マウスのための神経学的スコア（NS）を評価マウスは、その側面に配置されています。 <ol><li>尾懸垂試験では、OBSながら、離れた食品流域から、1〜2秒のための彼らのホームケージのワイヤー上から約1.5 &quot;尾の付け根からマウスを開催後肢をアービング。懸濁試験を3回繰り返し、最も一貫性のある結果を記録します。 </li><li>歩行テストでは、いくつかのトラクション25センチ歩行距離を提供してきれいな表面上でマウスを置く（ 例えば 、ペーパータオルは、滑り防止のためにダウンしてテープで固定しました）。その歩行を観察しながらマウスを75センチ合計（ペーパータオルの3倍の長さ）を歩くことを許可します。 </li><li>その左側または右側にマウスを置き、テスト「立ち直り反射」とストップウォッチを使用するために、それが両側から自力自体を右にかかる時間を測定します。注：このテストの唯一の試験が必要です。 </li></ol></li><li> 0〜4注に独立規模で（左または右）各後肢のNSを決定します。右後肢NSが1である間例えば0のスコアは、1は、左後肢NSが0であることを示しています。 </li><li> （ 表1に提供要約）観測の次のセットに対応する神経学的スコア（0-4）を割り当てます。<ol><li>以下が観察されている場合は、NS 0（発症前）を割り当てます、マウスを尾によって中断されると、後肢は通常のスプレイつまりを提示し 、それが完全に離れて横正中線から延長され、それが2秒間、この位置に留まりますか長いです。マウスが歩いさせると、通常の歩行が観察されます。 </li><li>以下が観察されている場合は、NS 1（最初の症状）を割り当て：マウスを尾によって中断されると、後肢は異常な広がりを示し、 すなわち、それが崩壊している、または部分的に崩壊し、横方向の正中線に向かってか、尾懸垂中に震えるか、後退させます/握りしめ。マウスが歩いて許可された場合、通常のまたはわずかに遅い歩行が観察されます。 </li><li>以下が観察されている場合は、NS 2（麻痺の発症）を割り当てます。マウスを尾によって中断されると、後肢はあまり伸びるない、部分的または完全に崩壊しています。 （まだ関節の動きがあるかもしれません）。マウスが歩いさせると、後肢を前方MOTのために使用されますイオンは、しかし、つま先を90センチ歩いたり、足の一部がケージの底/テーブルに沿ってドラッグしている間に少なくとも二度下向きにカール。マウスは、その左右側に配置されている場合には、両側から10秒以内に自身を右することができます。 </li><li>以下が観察されている場合は、NS 3（麻痺）を割り当て：マウスを尾によって中断されると、後肢または最小限の関節の動きの剛性麻痺があります。マウスを歩くことを許可されている場合には、前方が後肢は前進運動のために使用されていない動きがあります。マウスは、その左右側に配置されている場合には、両側から10秒以内に自身を右することができます。注：まれに、麻痺の発症後、尿の水分が後肢に表示されない場合があります。左未処理の尿の水分が尿に「バーン」と皮膚病変を引き起こす可能性があります。髪をクリッピングすることによって尿の水分を扱い、暖かい水が尿を除去するために浸す適用され、静かに乾燥ブロット。皮膚病変が存在する場合antibio適用チック軟膏。 </li><li>以下が観察されている場合は、NS 4（動物愛護エンドポイント）を割り当てます。マウスを尾によって中断されると、後肢で剛性麻痺があります。マウスを歩くことを許可された場合、何の前進運動はありません。マウスは、その左右に配置されているとき、それはどちらの側から10秒以内に自分自身を右することはできない。 すなわち、立ち直り反射の欠如。 </li></ol></li></ol> 4.データ入力と分析<ol><li>薬効の研究の過程で、研究室情報管理システム（LIMS）に各マウスについて、市販の表計算ソフトに収集されたデータを入力します。 注意：ALS TDI-開発LIMSソフトウェアは、ALSのTDI研究者のための時間をかけて、これらのデータは便利なアクセスできるように、内部の研究から収集したすべてのデータの中央リポジトリです。 LIMSは、すべての試験日に戻ってその系統、体重または神経学的スコアに、そのユニークなIDで、任意の個々のマウスを追跡し、その有効期間中に注意し、他の観測値が含まれています。 LIMSは、最終的にはその後の分析のために使用されているスプレッドシートを生成します。 </li><li>薬効試験の完了時、 すなわち、全てのマウスは、左と右の後肢NSを平均化することによって毎日のために、各マウスのための組み合わせNSを計算するために人道的エンドポイント用表計算ソフト（材料の表を参照）に達したとき。次に、各マウスそれぞれのマウスは、特定のNSに費やした日数の間、それぞれのNSで年齢の中央値を計算します。 </li><li>統計ソフトウェアに表計算ソフトからデータをインポートすることで、時間をかけて、NSの全体的な変化を分析（材料の表を参照のこと）。中央値NS時の年齢と回帰における効果などの薬物治療と、期待NSを推定順序ロジスティック回帰モデルを使用してこれらのデータを合わせます。ログランクカイ二乗検定を用いて効果尤度確率を推定し、NS進行に対する薬物治療の効果は統計的であるかどうかを判断LY有意な（ステップバイステップの手順については、補足コードファイルを参照してください）​​。 注：p値&lt;0.05は、統計学的に有意であると考えられます。 注：統計分析するこの方法は、NSデータと個々のマウスのNS軌跡の可変性の序性質を尊重します。個々のNS軌跡がNS応答の十分に反映していないNS時間に関連するグループの平均値が得られる著しく異なるものとすることができるので、好ましいです。加えて、いくつかのケースでは、特にNSときゼロから1つの範囲で変動することができます。 </li><li>最後に、薬剤処理動物と対照動物のためのグラフ（;補足コードは、ステップバイステップの手順については、ファイルの図 2を参照）、「序数はNS時の年齢中央値対NSを期待」を生成する（材料の表を参照してください）ソフトウェアのグラフを使用します。 私は （便利なy軸から疾患の発症年齢の中央値を補間することにより、薬物治療群と対照群との間のシフトを推定するためにこれらのグラフを使用してください。Eは、x軸上のNS 2）。 注：二つのグループ間の年齢の中央値の差は、薬剤誘発性のシフトを表しており、効果の大きさの実用的な尺度として扱われます。 注意：予想NS対年齢の中央値曲線が右へシフトが遅く症候性疾患の進行を示しています。逆に、予想NS対年齢の中央値曲線の左方シフトが加速症候性疾患の進行を示しています。 </li></ol>

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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

本稿では、適切に適用された場合、迅速かつ簡単にビデオプロトコルを記述し、確実にSOD1-G93Aマウスにおける疾患の進行を評価し、薬物誘発性の変化を識別することができます。別のグループは、SOD1-G93Aマウス8〜10のための表現型のスコアリングシステムを開発してきたが、それらは多くの場合、手続きに十分な詳細を提供し、レプリケーションのために不十分であるしないでください。その結果、スコアリングシステムはほとんどそれらを開発し、特定のグループ外で使用されていません。この報告では、ビデオで詳細な原稿の組み合わせは、このように他の研究所に採用されるためのプロトコルを可能にし、異なる設定で行われている研究との比較を可能に得点曖昧さとインター実験の変動を最小限に抑えることができます。 NeuroScoreと呼ばれるこの報告書に記載の神経学的スコアリングシステムは、正確な数値は、標識やSYのセットに起因する順序データを生成し、mptomsはランク付けされ、疾患の重症度を確立超えては意味がありません。この場合、NS 0は少なくとも重篤な疾患状態であるとNS 4は、マウス...

1990年代半ばにおけるその開発SOD1-G93Aトランスジェニックマウスモデルは、筋萎縮性側索硬化症（ALS）1の最も広く使用される動物モデルとなっている以来。このトランスジェニックマウスモデルは、遺伝的に、アミノ酸93（G93A）のアラニンへの変異ALS関連グリシンを保有する人のCu / Znのスーパーオキシドジスムターゼ1（SOD1）遺伝子の変異型を過剰発現するように設計されました。 G93A変異を一括メイク家族性ALS症例2の約​​1/5 SOD1遺伝子の多くの変異の一つです。 ALSとの明らかな遺伝的リンクに加えて、このような運動ニューロンの損失、進行性の筋力低下や萎縮などのヒトでALSの病理学的特徴の多くを再現するため、SOD1-G93Aモデルは、最終的に、ALS創薬研究の主力となっています麻痺と死3。多くの場合、トランスジェニック動物モデルの場合と同様にかかわらず、固有の双方向性がありますSOD1-G93Aマウスに関連する学的変動。スコットら 。少なくとも24ごみをマッチさせた男女バランスのマウスのコホートは、4生物学的変動によって作成されたノイズを克服するために、薬剤の有効性の研究のデザインに必要とされていることを確認しました。攻撃的な疾患の進行、毎日モニタリングの必要性と組み合わせたこれらの研究に必要な動物の多くは、神経筋強度および機能を測定するための精巧な、時間がかかり、潜在的にストレスの多い技術の使用を禁止する（例えば、筋電、握力、回転棒、等）。代わりに、それは確実に迅速な方法でSOD1-G93Aマウスの神経筋機能を評価するin vivoでのスクリーニングツールの必要性を強調しています。 ALS TDIでプロトコルが平均でマウスあたり30秒未満でSOD1-G93Aマウスの神経筋機能の信頼性の評価が可能になるように開発されました。このプロトコルのencompaプレスで、ビデオでは、この報告書に記載されている単純な神経学的スコアリングシステム（NeuroScore）を使用して、後肢機能のSSES毎日評価。後肢の赤字が最も早く、SOD1-G93Aマウス5,6における疾患の神経学的兆候を報告しているためNeuroScoreは、後肢の機能に焦点を当てています。さらに、ALS TDIが開発したプロトコルは、不全麻痺（わずかなまたは部分的な麻痺）の発症の公平な評価を提供する麻痺の進行および重症度、それが疾患の進行における薬剤誘発性の変化を識別するのに十分な感度です。

<table><tbody><tr><td>B6SJLTgN(SOD1G93A)1Gur</td>株 <td>ジャクソン研究所、バーハーバー、メイン州</td><td>002726</td><td>この研究で使用されたマウスの系統</td></tr><tr><td>Breeders</td><td>Biomedical Research Models, Inc., Worcester, MA</td><td></td><td>コロニー維持</td></tr><tr><td>Scale</td><td>Navigator OHAUS, Parsippany, NJ</td><td>Model N14120</td><td>マウスの体重を量るために使用されます</td></tr><tr><td>Nutra-GelH</td><td>Bio-Serv, Flemington, NJ</td> <td>#S4798</td><td>ウェットフード病気のマウスに提供</td></tr><tr><td>照射実験動物ダイエット</td><td>ハーラン、インディアナポリス、IN</td><td>2918-111914M</td><td>チョウダイエット</td></tr><tr><td>ラボグレードのサニチップス</td><td>ハーラン Teklad、インディアナポリス、IN</td><td>7090</td><td>寝具</td></tr><tr><td>JMPH&nbsp;</td><td>SAS Institute, Inc., SAS Campus Drive, Cary, NC</td><td>&nbsp;v10.0.2</td><td>統計ソフトウェア</td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft, One Microsoft Way, Redmond, WA</td><td>Excel 2013 (v 15.0)</td><td>スプレッドシートソフトウェア</td></tr><tr><td>GraphPad Prism 5</td><td>GraphPad software Inc., La Jolla, CA</td><td>v5.4</td><td>Graphing software</td></tr><tr><td>Mouse Huts</td><td>Bio-Serv, Flemington, NJ</td><td>K3272</td><td>For environmental enrichment</td></tr></tbody></table>

alsのsod1-g93aマウスモデルにおける疾患進行を評価するためのクイック表現型の神経学的スコアリングシステム

A Quick Phenotypic Neurological Scoring System for Evaluating Disease Progression in the SOD1-G93A Mouse Model of ALS

SOD1-G93Aトランスジェニックマウスは、筋萎縮性側索硬化症(ALS)の最も広く使用されている動物モデルです。ALS TDIでは、SOD1-G93Aマウスの神経筋機能を迅速に確実に評価する表現型スクリーニングプロトコルを開発しました。このプロトコルには、後肢の機能を評価するために設計された単純な神経学的スコアリング システム (NeuroScore) が含まれています。 NeuroScoreは、後肢の欠損がSOD1-G93Aマウスで最も早く報告された疾患の神経学的徴候であるため、後肢の機能に焦点を当てています。ALS TDI によって開発されたプロトコルは、麻痺 (軽度または部分的な麻痺) の発症、麻痺の進行および重症度の偏りのない評価を提供し、疾患の進行における薬物誘発性の変化を特定するのに十分な感度を備えています。このレポートでは、詳細な原稿とビデオを組み合わせることで、スコアリングの曖昧さと実験者間のばらつきが最小限に抑えられ、他の研究室でプロトコルを採用することができ、異なる環境で行われている研究間の比較が可能になります。このビデオプロトコルは、現在および将来のALS研究者にとって優れたトレーニングツールとして役立つと信じています。

90男性と94女性の非処置SOD1-G93Aマウスのデータは2014年の間に、ALS TDIで学ん神経学的スコアを評価しました。結果は、女性に比べNS 1におけるその寿命の大部分によって証明されるように、雄マウスは、典型的に、雌のマウスよりもより攻撃的な疾患進行を有することを示しています。 NS 2、NS 3は、男女全体で事実上等しい頻度で発生します。それは「通常の」表現型と考えられているので、NS 0は分析から除外しました。 NS 4はまた、それが唯一のSOD1-G93Aマウスの寿命（ 表2、図1）に一度発生する可能性がありますので、定義によって除外されました。 NSデータは、SOD1-G93Aマウスでの試験化合物TDI173のALS疾患進行の有効性薬理研究から提示された（n =性別/処理当たり16; 64総マウス）。 図2において、神経学的疾患の進行の速度は、データcの順序回帰分析によって捕捉として提示されています本明細書に詳述NeuroScoreプロトコルを使用してaptured。 TDI173処置マウス...

このビデオプロトコルは、筋萎縮性側索硬化症のトランスジェニックマウスモデルにおける神経筋欠損を評価するための、高感度で信頼性が高く、迅速な方法を説明しています。

ALSのSOD1-G93Aマウスモデルにおける疾患進行を評価するためのクイック表現型の神経学的スコアリングシステム

The SOD1-G93A transgenic mouse is the most widely used animal model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS). At ALS TDI we developed a phenotypic screening ...

本手順の全体的な目的は、単純な表現型神経学的スコアリングシステムを用いて後肢機能を毎日評価し、SOD1-G93Aマウスの神経筋機能を迅速かつ確実に評価することです。まず、マウスを尾で吊り下げた状態で後肢を観察します。次に、マウスに歩行させ、その歩容を観察します。次に、マウスを横向きに置き、ライティングリフレックス（書字反射）の有無をテストします。最終ステップとして、マウスコホートの神経学的スコアデータを順序ロジスティック回帰モデルに当てはめてデータ解析を行います。最終的に、この表現型神経学的スコアリングシステムを用いて、ALSのマウスモデルであるSOD1-G93Aにおける疾患の進行を評価し、治療介入の有効性を判別します。既存のあらゆる手法と比較した本方法の最大の利点は、迅速かつ簡便で信頼性が高く、マウスへのストレスを最小限に抑えられる点にあります。本手法は、この疾患の最も一般的なマウスモデルにおいて治療介入の迅速な評価を可能にするため、筋萎縮性側索硬化症（ALS）の治療法開発への応用が期待されます。神経学的スコアリング法は、神経学的な差異がわずかである場合があり習得が困難であるため、視覚的な実演による解説が不可欠です。まず、雄のSOD1-G93Aマウスは1ケージあたり1匹で飼育し、雌のSOD1-G93Aマウスは1ケージあたり最大2匹で飼育します。プラスチック製のシェルターを設置し、マウスに環境エンリッチメントを提供します。マウスには、自由摂取（ad libitum）で餌と水を提供してください。すべてのマウスの体重を、同一の時間に測定します。日々の体重変化は、疾患の進行や、慢性的薬剤投与によって生じる可能性のある不快感を示す鋭敏な指標となります。研究期間中は、3つのテストを順次行うレジメンを通じて、各マウスの神経学的スコアを毎日評価してください。最初のテストでは、表現型移行点でのスコア判定が非常に困難であるため、注意深く観察してください。尾部懸垂テストでは、ホームケージ上部のワイヤー部分の上で、マウスの尾の付け根から約1.5インチの位置を保持します。後肢の機能を1〜2秒間観察し、このテストを3回繰り返します。歩行テストの手順です。マウスを、ある程度の摩擦があり、少なくとも 25 centimeters の歩行距離が確保された清潔な平面に置きます。マウスの歩行状態で観察しながら、最大 75 centimeters まで歩かせます。右起き上がり反射テストでは、マウスを横向きに置き、ストップウォッチを使用して、補助なしで自力で起き上がるまでにかかる時間を両側から測定します。このテストは1回のみ実施します。3つの表現型観察テストの総合的な結果に基づき、左右それぞれの後肢に0から4のスケールで独立してスコアを付けます。サイナススコアが0であることは、マウスが発症前であることを示します。懸垂テストにおいて、後肢が側方正中線から完全に伸展し、その状態が2秒以上維持される場合、および歩行テストにおいて正常な歩行が観察される場合がこれに該当します。最初の症状が現れた場合にスコア1を割り当てます。懸垂試験において、後肢が外側正中線に向かって脱落している、外側正中線に向かって部分的に脱落している、震えている、あるいはその他の方法で異常に開いている場合に該当します。上述した懸垂試験の症状に加え、スコア1となるマウスの歩行は、依然として正常であるか、わずかに低下しているように見えるはずです。パレジー（後肢麻痺）の発症を示すスコア2を割り当てます。懸垂試験において後肢が部分的または完全に脱力し、かつ歩行試験において後肢が前進に使用されている場合に該当します。ただし、75 centimeterの歩行中に足指が少なくとも2回下向きに丸まるか、あるいは足のいずれかの部分が地面に引きずられた場合にスコア2となります。また、マウスを左右どちらかの方に傾けて置いた後、10秒以内に自力で起き上がれる必要があります。麻痺を示す場合は、サイナススコアを3とします。懸垂試験中に後肢に硬直性麻痺が見られるか、関節の可動性が最小限である場合、歩行試験中に前進動作が見られることがありますが、それは後肢を使用したものではありません。サイナススコアが3点であることに加え、マウスを左右どちらかの側臥位に置いた後、10秒以内に自力で起き上がることができなければなりません。最後に、懸垂中にマウスが硬直性麻痺を示した場合は、人道的エンドポイントと定義し、スコアを4点とします。試験の結果、後肢を用いた歩行テストで前進せず、かつ左右どちらかの側臥位に置いた後10秒以内に自力で起き上がることができない状態を指します。一般的に、雄マウスは雌マウスよりも疾患の進行が激しく、神経学的スコア1に分類される症状を示す期間が雌に比べて寿命における割合が高いことが示されています。症状が神経学的スコア2または3の範囲に悪化すると、各スコアで過ごす日数は雌雄間で同等になります。ここでは、上述のneurocoプロトコルを用いて作成された統計解析グラフである順序ロジスティック回帰分析の結果を示します。これらのデータは、被験化合物TDI 1 73を投与したSOD one G 93 aマウスの群と、溶媒を投与したマウスの群を比較した薬効薬理学研究によるものです。性別を分けて解析した場合には統計的に有意な差は認められませんでしたが、性別を統合して解析したところ、統計的有意性に達しました。生存率のカプラン・マイヤー解析においても同様の傾向は示されましたが、性別を統合した場合であっても、有意な差を明らかにするほどの感度は得られませんでした。習得すれば、適切に実施することで1匹のマウスにつき1分未満でスコアリングを行うことができます。このビデオを視聴することで、Neurocoシステムを用いてALSのマウスモデルであるSOD one G 93の病勢進行を評価する方法について、十分に理解できるはずです。

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