タンパク質 - 小分子標的薬のスクリーニングのための迅速かつ定量的蛍光法

この新しい蛍光薬物スクリーニング法の全体的な目的は、薬物がロードされたタンパク質テンプレート内で蛍光金ナノクラスターを形成させることにより、標的タンパク質に対する低分子薬物の結合親和性を決定することです。この手法は、低分子薬物の結合強度が、タンパク質のアンフォールディング（変性）からの安定性にどのように影響し、それが結果として異なる強度の蛍光金ナノクラスターの形成につながるかなど、タンパク質標的薬物探索分野における重要な疑問への回答に寄与します。本手法の主な利点は、標的タンパク質を蛍光バイオセンサーに変換できるため、高度な装置や煩雑な標識ステップを必要とせずに、低分子薬物の迅速なスクリーニングが可能になることです。

私自身の知見と共著者の発見を組み合わせることで、タンパク質のロードがプラズモンナノ粒子に対して明確な安定化効果を持つことが分かりました。この手法は、そのアイデアに基づいています。この手順を開始するにあたり、テキストプロトコルに詳述されている通り、薬剤スクリーニング用の化学試薬を準備します。ヒト血清アルブミン（HSA）をテンプレートとした金ナノクラスターを調製するため、マイクロマグネティックスターラーをそれぞれに入れた2本のガラスバイアルを、個別に温度制御可能な2台のマグネティックスターラー上に配置します。

マグネチックスターラーの温度を60 °Cに設定します。次に、金イオンをタンパク質テンプレート内に封入させるため、撹拌を続けながら各バイアルに200 µLのヒト血清アルブミン溶液、200 µLの超純水、および200 µLの塩化金溶液を加えます。2分後、各バイアルに20 µLの水酸化ナトリウム溶液を加え、ヒト血清アルブミンの還元能を活性化させて金ナノクラスターを形成させます。反応時間を0分から開始し、20分ごとに記録します。

各サンプルから50 µLを分注し、384ウェルブラックプレートに移します。マイクロプレートリーダーを用いて発光スペクトルを測定します。100分後にマグネチックスターラーを停止します。

シンク内で流水を用いてガラスバイアルを冷却します。異なる温度条件下での金ナノクラスターの形成速度論を把握するため、各サンプルの光放出スペクトルを常時プロットします。牛血清アルブミン（BSA）をテンプレートとした金ナノクラスターを調製するには、マイクロマグネチックスターラーを投入したガラスバイアルをマグネチックスターラーの上に配置します。

温度は室温のままにします。ガラスバイアル内で、200 µLのBSA溶液、200 µLの尿素、および200 µLの塩化金溶液を絶えず撹拌しながら混合します。2分後、20 µLの水酸化ナトリウム溶液を加えます。

BSAの還元能を活性化させて金ナノクラスターを形成させ、反応時間を0分として記録を開始します。反応混合物の光放出スペクトルを1時間ごとに測定します。磁気撹拌子を入れ、薬剤または純粋なHSAとあらかじめラベルを貼った5本のガラスバイアルを、温度制御可能なマルチポイント磁気撹拌機の上に配置します。

各バイアルに200 µLのHSAを加えます。次に、事前に調製した各薬剤溶液を1 µLずつ、対応する4つのバイアルに加えます。また、コントロールとして、攪拌機上のスイッチに1 µLのDMSOを加えます。

回転速度を360 RPMに設定し、各バイアルに200 µLのmilli Q水と200 µLの塩化金溶液を加え、一定の撹拌条件下で1時間インキュベートして、薬物をHSAに結合させます。その後、一定の撹拌条件下で温度を60 °Cに設定し、10分間保持します。10分後、各バイアルに20 µLの1.5 M水酸化ナトリウムを加え、反応時間を0分として記録を開始します。

測定用の混合反応溶液は、薬剤の添加順序を統一し、タイムラグによる影響を最小限にするため、可能な限り迅速に操作してください。各バイアルから50 µLの溶液を速やかに分注します。384ウェルのブラックプレートに移し、放出スペクトルを測定します。各サンプルの放出スペクトルを10分ごとに記録し、少なくとも4つの異なる時点で4回以上のスペクトルを収集してください。

一貫した傾向の結果を得るために、これらのステップを数回繰り返します。各サンプルの時間分解光電子放出スペクトルをプロットします。すべてのサンプルのピーク強度を特定し、それを時間に対してプロットして、異なる薬剤負荷タンパク質テンプレートにおける金ナノクラスターの形成キネティクスを比較し、各薬剤とHSAの間の結合定数を測定します。

薬剤溶液を4つの異なる濃度のイブプロフェン溶液に置換します。10分後、シンクの流水下でガラスバイアルを冷却します。各バイアルから上記の溶液を50 µLずつ384ウェルブラックプレートに分注し、放出スペクトルを測定します。

磁気攪拌を停止する前に、これらの手順をさらに2回繰り返し、異なる薬剤濃度で別の2組の結果を得ます。その後、光放出スペクトルをプロットし、個々のバッチで得られた生データを分析します。Origin Proなどのソフトウェアを用いて各サンプルの光放出スペクトルをプロットし、ピーク強度を決定します。

薬剤濃度に対する相対蛍光強度を算出し、プロットします。次に、データを単一部位結合モデルにフィットさせて結合定数を算出します。Origin Proなどのソフトウェアを用いて、Mics cementin方程式を使用してこれを実行してください。

メニューから「分析」→「非線形曲線フィッティング」を選択し、設定の関数選択ページにある「成長シグモイド」カテゴリーから「Hill関数」を選択します。「フィット」をクリックして表示します。ここに示されているフィッティング結果は、異なるタンパク質変性条件下で生成された金ナノクラスターの時間分解光放出スペクトルの代表的な結果です。

金ナノクラスターは、温度が高いほどより速く形成されることが観察されます。また、尿素変性条件下では、BSAタンパク質をテンプレートとして用いた金ナノクラスターの直接合成が促進されます。ここでは、薬物をロードしたHSAをテンプレートとして用い、金ナノクラスターの蛍光強度に基づいた高速蛍光薬物スクリーニングの典型的な結果を示します。

蛍光強度が高ければ高いほど、薬物分子のHSAに対する結合強度は弱くなります。これらのスペクトルは、イブプロフェンを負荷したHSA内部における蛍光金ナノクラスターの形成速度に、薬物負荷濃度が及ぼす影響を示しています。薬物濃度が高くなるほど、得られる金ナノクラスターの蛍光信号は低下します。ここに示したのは、タンパク質と薬物の結合定数決定における代表的な結果です。

これは、さまざまな濃度のイブプロフェン薬剤をあらかじめ充填したHSAテンプレート中で合成された金ナノクラスターの相対蛍光強度を、MICUs cementin方程式を用いてフィッティングさせることで算出されます。この手法を習得すれば、適切に行うことで、複数の薬剤スクリーニングを並行して30分で完了させることができます。このビデオを視聴することで、薬剤充填タンパク質中で金ナノクラスターを合成する方法と、得られた金ナノクラスターから放出される蛍光信号によって検出可能な、標的タンパク質に対する薬剤の結合親和性を決定する方法について、十分に理解できたはずです。