Name: 使い方エクスビボ全体の胎児器官の直立飛沫培養物をマウス器官中に発生過程を研究します (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: 学ぶエクスビボ直立飛沫培養法を用いたマウス胎児器官の発生過程研究。低用量試薬で血管形成と器官形成を詳細に解析し、免疫蛍光顕微鏡で組織構造変化を可視化する革新的手法です。

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著者は、CancerFree KIDS Research Grant、March of Dimes Basil O'Connor Starter Scholar Award (#5-FY14-32)、Cincinnati Children's Hospital Medical Center (CCHMC) Trustee Grant Award、CCHMC Research Innovation and Pilot Funding Award、CCHMC Developmental Fundsの支援を受けました。著者はまた、この手法の初期最適化についてCapel研究室を認めています。

これらの研究で使用されているすべてのマウスは、チャールズ・リバー・ラボラトリーズから入手したCD-1マウスでした。前培養実験はまた、C57BL / 6J（データは示していない）などの他の株に対して実行されているが、任意の株を使用することができます。妊娠中の成人女性は約2〜3ヶ月齢で頸椎脱臼や胚の除去の前に両側性開胸続くCO 2吸入によって安楽死させました。マウスは、NIHガイドラインに従って飼育した、実験プロトコルは、シンシナティ小児病院医療センターの施設内動物管理使用委員会によって承認されました。 楽器、文化メディア、料理の作製<ol><li> 70％エタノール溶液を調製します。 （加湿チャンバーを作るための、および/希釈のソリューションを作成するための）オートクレーブ脱イオン水。 70％エタノールでダウン噴霧することにより解剖ツール（鉗子、はさみ、および27 G針注射器）を滅菌します。 </li><li>準備カルシウムとマグネシウム（80グラムのNaCl、2グラムのKCl、14.4グラムHPO 4、2.4 NA 2グラムのKH 1 M MgCl 2を1 M CaCl 2を、3.75 mlの2 PO 4、6.75 mlを含有する10×リン酸緩衝生理食塩水（PBS） ）。 1 Lの滅菌オートクレーブ処理水に溶解した後、ろ紙でフィルタリングするかき混ぜます。 1X PBSを作るために水で10倍に希釈します。 </li><li>熱は、30分間55℃でのウシ胎児血清（FBS）を不活性化し、フィルターを、0.22μmシリンジフィルターを用いて滅菌します。 </li><li>ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、10％のフィルタリング熱不活性化FBSおよびペニシリン - ストレプトマイシン株の100分の1希釈からなる、（完全DMEM、CDMEMと呼ばれる）38ミリリットル1X完全培地を準備します。これは、通常、新鮮な使用されるべきではなく、1ヶ月間、4℃で保存することができます。 </li><li> 5 mg / mlのストック濃度をDMSO中のVEGFRチロシンキナーゼ阻害剤II（TKI II）を再構成し、作業溶液を作るためにCDMEMで株式を希釈します。最終的なコンこの研究のためのセンタリングはCDMEMで1.875μgの/ mlです。同社の勧告によると、ストック溶液を-20℃で6ヶ月まで安定です。作業溶液としては、新鮮な作りと同じ日に使用します。 注：（それは、液滴に2倍に希釈されるため）ワーキング溶液中のこの薬の濃度は、所望の最終濃度よりも2倍以上である必要があります。同時に、「制御」処理のためにDMSOの同じボリュームを含むCDMEMの同じ体積を準備します。 </li><li>蒸留水に別々に尾消化試薬（50mMのNaOHおよび1Mのトリス塩酸[pHが8.0]）を準備します。 </li><li>ヌクレアーゼフリー水で一緒にXY PCRプライマー（XYフォワード5&#39;-TGA AGC TTT TGG CTT TGA G-3 &#39;とXYリバース5&#39;-CCG CTG C​​CA AAT TCT TTG G-3&#39;）の25μMのストックを作ります。 </li><li> 50X TAEバッファー（242グラムトリズマベース、​​57.1ミリリットル氷酢酸、100ミリリットルの0.5M EDTA、pHが8.5を用意し、1 L Fiのに水を追加します最終容量）。 1×TAEランニング緩衝液を準備します（20ミリリットル50X TAEは1 L全量を水で希釈）。 </li><li>沸騰するまで電子レンジで2.5％アガロース溶液（0.625グラムアガロース、0.5ミリリットル50X TAEバッファー、24.5ミリリットルの水）、熱アガロース溶液を作成するには、次いで約55〜65℃（触れることができる）まで冷まします。一度クール、1％エチジウムブロマイド溶液2μlを添加し、ゲルを注ぎます。 注意！エチジウムブロマイドは変異原と催奇形物質です。取り扱う際ニトリル手袋と適切な安全プロトコルを使用してください。代替的に、他の潜在的に毒性の低いゲル分割剤又は染料を使用することができます。 </li><li>免疫蛍光のために（0.1％トリトンX-100、10％ウシ胎児血清[FBS]、および3％ウシ血清アルブミン[BSA]を有するPBS）ブロッキング溶液を調製します。 </li><li>免疫蛍光のために洗濯液（0.1％トリトンX-100を含むPBS、1％FBS、3％のBSA）を調製。 </li><li>免疫蛍光のためにPBTx（0.1％トリトンX-100を含むPBS）を準備します。 </li><li>銅のインキュベーション室を準備lture。水をオートクレーブし35ミリリットルで、大（直径100mm）ペトリ皿を埋めます。解剖や文化が実行される場所の近くに配置します。 </li></ol> ハツカネズミの胎児精巣の2の単離<ol><li>毎朝膣プラグ用のメスのマウスを確認してください。膣プラグが検出された日の正午をE0.5と考えられています。承認された動物プロトコルと一致する方法で、E11.5で妊娠雌性マウスを安楽死させます。 </li><li> 70％エタノールでマウスの腹部を下にスプレーしてください。 </li><li>細かいハサミを使用して、V字型の切開を腹の皮膚や腹膜を開き、内部の臓器を露出するために組織のフラップを引き戻します。 </li><li>子宮角の両端に卵巣の位置を確認します。はさみを使用して、母親の体から胚を含む子宮を分離するために卵巣および結合組織で切断。 </li><li>卵黄嚢を露出させ、静かに胎盤の反対側を切断して子宮壁を開きます。ないPUに注意してくださいncture卵黄嚢が損傷または失わ胚を避けるために。 </li><li>胚含有卵黄嚢を削除して、カルシウムとマグネシウムを含むPBSを含む皿にそれらを配置するために胎盤の近くにカットします。カルシウムおよびマグネシウムイオンの存在は、組織構造を維持し、切開ツールに付着組織を防止するために、細胞接着分子を支援します。 </li><li>ピンセットで、慎重に胚が引き出し可能な穴を作成するために、卵黄嚢を穿刺することにより、胚から卵黄嚢と羊膜を除去します。胚は卵黄嚢の外になると、へその緒を切りました。 </li><li>この時点から、滅菌組織培養フード内に配置顕微鏡を使用しています。胚の頭部を外し、首の両側に鉗子でつまんで捨てます。 </li><li>尾を削除して、胚の性別を決定するために、XY PCR分析のための新しいマイクロ遠心チューブに入れます。 注：それは収穫後できるだけ早く培養生殖腺に最適ですが、それはまた、POSですsible尾DNAを除去し、各胚の性別が知られており、唯一の希望のセックスは、培養する必要があるように、文化の前にXX / XY遺伝子型決定を実行します。遺伝子型決定が行われている間（それらを追跡することができるように）、胚を培養するための準備ができるまで4℃または氷上で分離保持することができます。一つの注意点は、 子宮内又は培養条件の外に、この期間は、潜在的に培養中の文化やその後の開発のための実行可能性に影響を与える可能性があるということです。 </li><li> （通常は弱い手で保持鉗子）鉗子の一組での胚の脇の下を固定することによって培養皿の底に対して、仰臥位で胚を固定します。全体の解剖プロセスの間に、まだ胚を保持するための場所でこれらの鉗子を維持します。 </li><li>鉗子の他のペアで、肌カバー腹部を削除し、優しく体壁をバック露出するために、肝臓、腸、および他の器官を削除します。 </li><li>生殖腺は、背側大動脈の両側に背体壁に配置されるように、閉じた鉗子で泌尿生殖器の尾根の下にスコップや鉗子を​​開き、持ち上げて泌尿生殖器の尾根を削除し、体の正中線に沿って実行している大血管。生殖腺が緩く壁に添付されるように、これらの接続または生殖腺を除去することなく、速すぎてプルアップしないように注意して臓器の障害の原因、ストレッチがあります。 </li><li>メディアに組織を順応さ皿にCDMEMに泌尿生殖器の尾根を移動します。 </li><li> 27 G針を使用して、泌尿生殖器の尾根の残りの部分から生殖腺 - 中腎複合体を分離します。最適な分離を可能にするために押し下げて切断し、正確に組織を導くために他を使用する1つの針を使用してください。鋭い針が組織に固執することができ、プラスチックの破片を作成するように、皿底に対するソーイングモーションを使用しないでください。完全に生殖腺に接続されている中腎を維持することを確認します。 </li></ol>小分子阻害剤を用いた生殖腺の3培養<ol><li> 2 20μを設定15μlのそれぞれにリットルピペット。他のピペットは薬剤処理CDMEMのためにのみ使用されますが、生殖腺および制御CDMEMの追加の転送のためのきれいな、滅菌カミソリの刃を使用してバリアピペットチップのオフ約1〜2ミリメートルカット。 </li><li>彼らは簡単にカットオフチップを用いてピペットで注入できるように、ピペットチップへの長軸に平行で生殖腺をラインアップ。ピペットチップの内側に付着し、生殖腺のように注意してください。 </li><li>薬物含有液滴のような制御滴と他のように、1つの側にラベルを付けます。 2つだけ液滴は35mm皿の蓋に合うことができます。蓋のラベルは、尾組織を含むマイクロ遠心チューブのラベルと一致していることを確認してください。 </li><li>小（35ミリメートル）培養皿の蓋で液滴に単一の生殖腺を含むCDMEMのピペット15μL（ボトムスは加湿シャーレチャンバ内に収まらないほど背が高いように、唯一の蓋​​を使用します）。皿のいずれかの側にある2つの別々の生殖腺を含む液滴を置き、十分に分離FRオム互いに。生殖腺液滴に転送されたことを確認するために顕微鏡下で確認してください。 </li><li>コントロールとして指定された液滴には、30μlの総容量で液滴を作るために、DMSO（ステップ1.5で作られた）を含むCDMEMの追加の15μlを添加します。薬剤に接触しないだけで「コントロール」のピペットを使用してください。 </li><li>他の液滴（薬剤処理サンプル）には、30μlの総容量で液滴を作るためにTKI-II含有CDMEMの15μlを添加します。薬剤処理されたサンプルに指定された唯一のピペットを使用してください。 </li><li>ピペットを用いて、それらは直径約1​​5〜18ミリメートルになるまで拡大して円形パターンで液滴を広げ、生殖腺はおおよそ中間に位置しています。オリエント性腺それは、その側に位置し、生殖腺と中腎は容易に区別されるように。 2つの葉が平らになるように肺を向けます。 <ol><li>液滴直径が若干異なる場合がありますが、生殖腺がfloatinていないことを確認してくださいグラムとは、表面張力によって適所に保持されます。液滴が互いにまたは蓋の側面に触れていないことを確認します。表面張力がなければ、臓器は、このように臓器の形態を歪め、培養中に蓋の上に成長し、平らにします。 </li></ol></li><li>慎重に直立大（100ミリメートル）加湿皿内の水の表面に液滴を含む培養皿のふたを置きます。蓋の下の下に閉じ込められた気泡がないことを確認し、それが水の表面に平らに置かれていること。蓋を反転し、任意の水が液滴が配置されている蓋の上部を触れないように注意してはいけません。 </li><li>小、加湿チャンバーを作成するには、すぐに生殖腺培養を囲むために、より大きな加湿皿の蓋でカバーしています。メディアのいずれかの蒸発を最小限に抑えるために可能な限り迅速に行動します。小さい料理が自由に移動することと、より大きな皿の蓋との間にスペースがあることを確認します。それ以外の場合は、結露がシールaとbをすることができます組織への空気交換をロックします。 </li><li>二つの小さな蓋をチャンバー内に配置されると、すぐにインキュベーターにチャンバーを配置。 37℃で加湿したCO 2インキュベーター中で48時間培養液滴をインキュベートします。 </li></ol>胚の性別を決定するための4ポリメラーゼ連鎖反応<ol><li> 1.5ミリリットルマイクロチューブの底に胚尾を追加します。 </li><li>各チューブに50 mMのNaOHを200μLを加えます。 </li><li> 15分間、または組織が完全に溶解するまで95℃で置きます。 </li><li>軽く簡単に50の1Mトリス塩酸μlの渦を追加します。 </li><li> 0.5μlの25μMプライマー溶液、2.5μlの10XのTaqバッファー、0.5μlの10 mMのdNTPを（ヌクレオチド）、19.3μlのヌクレアーゼ1.5 mlのマイクロ遠心チューブでは、サンプルの合計数で各ボリュームを乗じて新たなPCRマスターミックスを作ります無料の水、0.2μlのDNA Taqポリメラーゼ。よく混ぜます。 </li><li> 23を追加消化尾の3μlの溶解液を含むPCRチューブにPCRマスターミックスμlの。 </li><li>フリック次いで、チューブをチューブの底にサンプルをもたらすために、短いスピンを行い、それらを混合します。 </li><li> XY（ショート）PCRプログラム（ 表1）を実行します。 </li><li> 1X TAE緩衝液中の2.5％アガロースゲル中で（5×染料と）サンプルおよびラダーをロードします。 </li><li> XXとXYバンドが解決されるまで、アガロースゲル電気泳動を実行します。 </li><li>イメージ紫外線とキャプチャ画像を有するゲル。 </li><li> ; Y染色体-特異的なバンド（X染色体= 331塩基対[BP]とXY = 302 bp）の13対のX染色体特異的に分析しますXX（メス）のサンプルは、単一の331 bpのバンドとして表示されます一方、XY（オス）のサンプルは、331と302塩基対の二つのバンドを持っています。 </li></ol> 5.全体のマウント免疫器官 1日目： <ol><li>カットオフチップで千μlのピペットを用いて培養物から生殖腺を削除します。必要に応じて、それらがあってもよいですメディアおよび試薬を洗い落とすために、PBSの皿に置きました。 0.5ミリリットルマイクロチューブにPBSに置きます。小さいチューブサイズは、試薬を節約し、それが簡単にチューブ内のサンプルを追跡するために行います。 <ol><li>潜在的な薬物汚染を避けるために、別々のチューブに、制御および処理されたサンプルと同様に、XXとXYサンプルを維持し、ピペットの独立したセットで、培養物からそれらを削除してください。 </li></ol></li><li> PBSで2回生殖腺を洗ってください。この時点以降、このプロトコルは、カルシウムとマグネシウムを欠く1×PBSを使用することができます。それらを洗浄するために、生殖腺が（重力によって）チューブの底に沈み、その後、上記の液体を除去することができます。それらに近すぎるピペットで生殖腺を失わないように注意してください。 </li><li>チューブからできるだけ多くのPBSを削除します。 0.1％Triton X-100を含むPBS中の4％パラホルムアルデヒド250μlのを追加し、ロッカーの上に4℃でO / Nインキュベートしましょう​​。また、この固定は、ロッカーの上に4℃で2時間行うことができます。注意！ Paraformaldehydeは有害物質ですので、取り扱いの際に安全プロトコルに従ってください。 </li></ol> 2日目： <ol start="4"><li> RTで250μlのPBTxで二回生殖腺をすすぎます。 </li><li>ロッカー上、室温で10分ごとに250μlのPBTxで生殖腺を3回洗浄します。 </li><li>ロッカー上で室温でブロッキング溶液250μlの生殖腺は、少なくとも1時間ブロックします。 </li><li>ブロッキング溶液中に希釈した250μlの一次抗体で、ロッカーに4℃で生殖腺O / Nを染色します。 </li></ol> 3日目： <ol start="8"><li> 250μlの洗浄液中に二回生殖腺をすすぎます。 </li><li>ロッカー上、室温で10分ごとに、250μlの洗浄液で生殖腺を3回洗浄します。 </li><li>生殖腺にロッカーに室温でブロッキング溶液を250μlで1時間をブロックします。 </li><li>光から蛍光二次抗体を保護するためにアルミホイルでマイクロ遠心チューブを覆います。 </li><li> AR上でRTで生殖腺2-4時間インキュベートしますあるいは、ヘキスト33342を含むブロッキング溶液中に希釈した250μlの二次抗体で無骨な、ロッカーに4℃で二次抗体およびヘキスト33342インキュベーションO / Nを実行します。 </li><li> 250μlのPBTxで二回生殖腺をすすぎます。 </li><li>ロッカー上、室温で10分ごとに250μlのPBTxに生殖腺を3回洗浄します。 </li><li>カットオフピペットチップを使用して、最小限の液体とスライド上に生殖腺を転送します。ピペットを用いて余分な液体を削除するが、組織が乾燥していないことを確認してください。 </li><li>オリエントすぐにピンセットで所望の様式で生殖腺、およびスライドに生殖腺をマウントするマウントメディアのドロップを追加。取り付けメディアのコート完全にすべてのサンプルを確認してください。それは、サンプルが乾燥させるのを防ぐのに重要です。 </li><li>静かにサンプルをカバーするために適切なサイズのカバーガラス（数1.5スタイル）を使用します。カバーガラスの表面全体に接触するように取り付けメディアの広がりをしてみましょう。必要であれば、非常に軽くなるようにカバーガラスの隅に押し大きな気泡が存在しません。 </li><li>取り付けメディアの蒸発を減らすためにエッジの周り明確なマニキュアでスライドをシール。ストアは、4℃の暗所でスライドをマウントしました。 </li></ol>

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<li>Gohbara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+murine+spermatogenesis+in+an+organ+culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">In vitro murine spermatogenesis in an organ culture system.</a> Biol. Reprod. 83, 261-267 (2010).</li>
</ol>

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

本研究では、胎児の発達を研究するための多くの潜在的なアプリケーションを持ってex vivoでの臓器全体ドロップレット法を示しています。この技術は、複数の器官のために使用され、in vivoで使用して検査することが困難である生物学的問題に対処するための研究が原因胚および胚の潜在的な致死の到達不能に近づくことができることができます。この培養方法は、哺乳動物細胞株として接近する他のインビトロ以上の追加の利点があります。全体の器官は、したがって、 子宮内に存在する重要な細胞間相互作用を維持し、使用することができます。培養容積は、このように珍しいまたは高価な医薬品試薬の非常に少量を使用して、（約30μl）を非常に小さいです。 液滴培養プロトコルの重要な側面は、次のとおりです。臓器のa）のクリーンな解剖。きれいな切開は、組織構造を維持することができ、露出切断または損傷SURの数を最小に培養皿の表面に引き付けられ、文化を乱すことの顔、。 b）は臓器の成長と形態形成を可能にするために、液滴内の器官の正しい向き;液滴が表面張力に...

ヒトにおけるインビボでの臓器再生は非常に限られています。したがって、組織工学、ホストから寄贈された個々の細胞からの組織や臓器の開発は、臓器置換のための魅力的な潜在的な治療法となってきています。しかし、成功するために、この治療戦略のために、要因や器官の形態形成に関与する細胞の相互作用は、徹底的に研究されている必要があり、よく理解していました。伝統的なアプローチと特定の器官の発達を研究することができないことに起因して、研究者は代替全胚または全臓器培養物になっています。 Kalaskar ら 1は、ex vivoでの培養方法は、器官形成研究のための実行可能な代替物である示唆し、 子宮の発達にに（培養胚の58％に）そのex vivoで全胚培養物が同等の結果が得られ示されています。 このような個別の器官培養系、 エキソビボ DROplet培養系、理学的試薬または抗体を添加することにより、特定のシグナル伝達経路や細胞間相互作用の操作を可能にしながら、全身作用の全臓器分析に​​依存しないために可能にします。伝統的に、胎児の器官の発達の研究は、母系配信理学的試薬に加えて、トランスジェニックおよびノックアウトマウスの技術に限定されていました。しかし、 生体内でこれらの技術や治療に関わる技術的な問題があります。最も懸念は、多くの場合、胚致死になり、同時に様々な臓器に影響を与えるの影響を中心に展開。胎児の発育を操作する研究の追加の懸念は、薬理学的にこのような試薬は、胎盤関門を通過することができる場合（ 例えば、薬剤の母体代謝が、それは胚に到達する前）と子宮内で胚発生に対する薬物の母性効果です。 全器官培養技術が記載さここで最初のMaatouk らによって記載されたプロトコルから適合させた。2、全体の胎児の生殖腺をex vivoで直立滴培養中でインキュベートされました。胎児の生殖腺を培養する1つの重要な利点は、小分子阻害剤は、容易に、単純な拡散によって全臓器にアクセスできることです。 。DeFalcoらは、小分子阻害剤と一緒にエクスビボで 、これを利用した液滴培養法は、生殖腺の発達3中に発生するプロセスとの相互作用を研究するためにシグナリングを使用することができることを示しました。これらのプロセスは、技術的な課題に、in vivoで検討するのは困難であろう（ 例えば 、胎盤または遺伝的または薬理学的ア ​​プローチを使用して、複数の臓器に影響を与えるの致死性を通じて薬物の通過）。 液滴の文化だけでなく、 子宮内の実験で特定の側面を超えるの改善ですが、またそれは 、in vitro および ex VI以上の改善でありますVOシステムなども。これらは、多様な細胞型を欠いている器官構造の形成を可能にする重要な細胞外マトリックス（ECM）の成分を欠いており、シグナル伝達カスケード内のアーチファクトを示すことができるため、形態形成を研究するための細胞株の使用は非常に困難です。組織工学は、ECMをシミュレートする足場を作成する際に重要な改良を加えているが、信号が器官形成時の各細胞型によって必要とされるに関して知識の欠如は、それが困難なin vitroでの臓器システムを構築することができます。その他のex vivoでのシステムは、以前器官形成を研究するために設立され、より具体的形態形成、ライブ寒天4中の胎児の臓器のイメージング、トランスウェル5、フィルタ6、および他の足場マトリクス7,8のために非常に成功しているされています。液滴の培養系の利点は、Oである、より少ない試薬を利用する能力を提供することにより、形態形成の研究を可能にすることですften高価なだけでなく、成長とシグナリング機能9のために重要である臓器表面張力を、与えます。 マウスでは、初期の精巣の形態形成は、E11.5およびE13.5ステージ（E）は、胚との間で行われます。これらの段階は、性特異的分化に影響を与える要因を調べるための最適な時間ウィンドウを含みます。精巣形成時に発生する重要なプロセスの中で精巣コードアーキテクチャの生成および精巣特異的血管網の形成です。このエキソビボ全臓器滴培養系を利用して、一方が雄特異的血管新生を変化させ、小分子阻害剤の使用を介して精巣の形態形成を阻害することができることブロック血管内皮増殖因子（VEGF）の受容体の活性。 VEGF媒介血管リモデリングは、精巣の発達10-12のために重要です。この技術は、他の正常臓器に適用することができ、特定の時間をターゲットにすることができ開発の窓。全体のマウント臓器イメージングは​​重要な構造の可視化だけでなく、様々な阻害剤の投与に起因する構造的および細胞の変化を可能にします。重要なことには、このシステムは、研究者が、in vivoで標的遺伝子戦略の間母体薬物投与または全身崩壊からの潜在的な交絡の影響を回避することができるという点で有利で ​​す。このように、この全体の臓器ex vivoでの液滴培養系は大幅に胎児の発達中に特定の器官内、特に発生の相互作用およびシグナル伝達を理解する能力を向上させることができます。

<table><tbody><tr><td>Superfrost Plus 顕微鏡スライド</td><td>フィッシャーブランド</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>カバー メガネ: 正方形 (22 mm x 22 mm、No. 1.5)</td><td>フィッシャーブランド</td><td>12-541B</td><td></td></tr><tr><td>サリー ハンセン エクストリーム ウェア マニキュア、インビジブル</td><td>サリー ハンセン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>8-ストリップ 0.2 ml PCR チューブ &デタッチフラットキャップ</td><td>GeneMate</td><td>T3218-1</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman L P1,000L, P200L, P20L, P10L, P2L</td><td>Gilson</td><td>FA10006M, FA10005M, FA10003M, FA10002M, FA10001M</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 鉗子</td><td>FST</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>細かいハサミ</td><td>FST</td><td>91460-11</td><td></td></tr><tr><td>Posi-Click 1.7ml 微量遠心チューブ</td><td>デンビル</td><td>C2170</td><td></td></tr><tr><td>Posi-Click0.6 ml 微量遠心チューブ</td><td>Denville</td><td>C2176</td><td></td></tr><tr><td>10 &mu;l シャープ 精密バリアチップ</td><td>デンビル</td><td>P1096FR</td><td></td></tr><tr><td>20 &mu;l シャープ精密バリアチップ</td><td>デンビル</td><td>P1121</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu;l シャープ精密バリアチップ</td><td>デンビル</td><td>P1122</td><td></td></tr><tr><td>1,000 &mu;l SHARP精密バリアチップ</td><td>デンビル</td><td>P1126</td><td></td></tr><tr><td>27ゲージ針付き1mlシリンジ</td>BD <td>PrecisionGlide</td><td>309623</td><td></td></tr><tr><td>10mlシリンジ</td><td></td>BD <td>305559</td><td></td></tr><tr><td>0.2 &mu;M PES シリンジ フィルター</td><td>VWR</td><td>28145-501</td><td></td></tr><tr><td>グレード 3 定性的濾紙 標準グレード、円、185 mm</td><td>Whatman</td><td>1003-185</td><td></td></tr><tr><td>Primaria 35 mm イージー グリップ スタイル 細胞培養皿</td><td>ファルコン/コーニング</td><td>353801</td><td></td></tr><tr><td>ペトリ皿、滅菌 (100 mm x 15 mm)</td> <td>VWR</td><td>25384-088</td><td></td></tr><tr><td>ニューブランズウィック ギャラクシー 14 S CO2 インキュベーター</td><td>エッペンドルフ</td><td>CO14S-120-0000</td><td></td></tr><tr><td>バイオセーフティキャビネット</td><td>NuareNU-425-400</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ミニ遠心分離機&nbsp;</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>05-090-100</td><td></td></tr><tr><td>BioExpress GyroMixer Variable XL</td><td>GeneMate</td><td>R-3200-1XL</td><td></td></tr><tr><td>Mastercycler Pro サーマルサイクラー コントロールパネル付き</td><td>Eppendorf</td><td>950040015</td><td></td></tr><tr><td>SMZ445 実体顕微鏡</td><td>Nikon</td><td>SMZ445</td><td></td></tr><tr><td>MultiImage Light Cabinet with AlphaEase Software</td><td>アルファ・イノテック・コーポレーション</td><td>販売終了</td><td></td></tr><tr><td>絶対 200 プルーフ エタノール</td><td>フィッシャー</td><td>BP2818-500</td><td></td></tr><tr><td>トリトン X-100</td><td>フィッシャー</td><td>BP151-100</td><td></td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム (二塩基性 MW 142) Na2HPO4</td><td>Fisher</td><td>S374-1</td><td></td></tr><tr><td>リン酸カリウム (モノ塩基性 MW 136) KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5379-1KG</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム(NaCl)</td><td>フィ</td><td>ッシャーS671-3</td><td></td></tr>塩化<tr><td>カリウム(KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911-1KG</td><td></td></tr><tr><td>塩化マグネシウム(MgCl2)</td><td>Sigma</td><td>M2393-100g</td><td></td></tr><tr><td>塩化カルシウム(CaCl2)</td><td>Sigma</td><td>C5670-100g</td><td></td></tr><tr><td>アンビオンヌクレアーゼフリーウォーター</td><td>ライフテクノロジー</td>ズ<td>AM9938&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>XY PCRプライマー&nbsp;</td><td>IDT</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>氷酢酸</td><td>フィッシャー</td><td>A38-500</td><td></td></tr><tr><td>エチレンジアミン四酢酸 (EDTA)</td><td>フィッシャー</td><td>BP2482-1</td><td></td></tr><tr><td>1% エチジウムブロマイド溶液</td><td>フィッシャー</td><td>BP1302-10</td><td>有毒</td></tr>ア<tr><td>ガロー</td>ス <td>GeneMate</td><td>E-3120-500</td><td></td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム (NaOH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>367176-2.5KG</td><td></td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma</td><td>T1503-1KG</td><td></td></tr><tr><td>dNTP Set, 100 mM Solutions</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0182</td><td></td></tr><tr><td>DNA Choice Taq ポリメラーゼ with 10x バッファー</td><td>Denville</td><td>CB-4050-3</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>Fisher</td><td>O4042-500</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>FluorMount-G</td><td>Southern Biotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>塩化水素 (HCl)</td><td>フィッシャー</td><td>A144212</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン(BSA)、粉末、フラクションV、ヒートショックアイソレーション</td>Bioexpress0332-100g<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコの修正イーグルミディアム(DMEM)&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清 (FBS)、トリプル 100 nm フィルター</td><td>フィッシャー</td><td>03-600-511</td> ペニシリン-ストレプトマイシン (10,000 U/ml) <td>を使用する前の熱不活性化</td></tr> <tr><td></td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ 15140-122</td> 1<td>:100</td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド (DMSO)、Hybri-max、滅菌フィルター</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>VEGFR チロシンキナーゼ阻害剤 II - CAS269390-69-4 - Calbiochem</td><td>EMD Millipore</td><td>676481</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit Anti-Sox9 Antibody</td><td>Millipore</td><td>AB5535</td><td>希釈時の使用: 1:4,000</td></tr><tr><td>ラット抗マウス PECAM1 (CD31) 抗体</td><td>BD Pharmingen</td><td>553370</td><td>希釈時の使用: 1:250</td></tr><tr><td>ウサギ切断カスパーゼ-3 (Asp175) 抗体</td><td>細胞シグナル伝達</td><td>9661S</td><td>希釈時の使用: 1:250</td></tr><tr><td>ラット E-カドヘリン / CDH1 抗体(ECCD-2)</td><td>Life Technologies</td><td>13-1900</td><td>希釈時の使用:1:500</td></tr><tr><td>Hoechst 3342、三塩酸塩、三水和物</td><td>Invitrogen (Molecular Probes)</td><td>H1399</td><td>2 ug/ml</td></tr><tr><td>Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>712-165-153</td><td>希釈時の使用:1:500</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>712-605-153</td><td>使用時希釈率:1:500</td></tr><tr><td>ロバ抗ウサギIgG(H + L)二次抗体、Alexa Fluor 555コンジュゲート</td><td>Life Technologies</td><td>A31572</td><td>希釈時の使用:1:500</td></tr><tr><td>ドンキー抗ウサギIgG(H + L)二次抗体、Alexa Fluor 488コンジュゲート</td><td>Life Technologies</td><td>A21206</td><td>希釈時の使用:1:500</td></tr><tr><td>ロバ抗ラットIgG(H + L)二次抗体、Alexa Fluor 488コンジュゲート</td><td>Life Technologies</td><td>A21208</td><td>希釈時使用時:1:500</td></tr><tr><td>ロバ抗ウサギIgG(H+L)二次抗体、Alexa Fluor 647コンジュゲート</td><td>Life Technologies</td><td>A31573</td><td>希釈時使用:1:500</td></tr></tbody></table>

使い方<em&gt;エクスビボ</em&gt;全体の胎児器官の直立飛沫培養物をマウス器官中に発生過程を研究します

Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis

子宮内器官を調査すると、子宮内開発胚による試薬の到達不能に胎盤哺乳類における技術的に困難なプロセスです。新たに開発されたex vivoで直立滴培養法は、 子宮内で行われた研究に魅力的な代替手段を提供します。 ex vivoでの液滴の文化は、様々なブロッキングと活性化化合物の使用を介して細胞間相互作用および多様なシグナル伝達経路を調べて、操作する能力を提供します。さらに、特定の器官の発達に様々な薬理学的試薬の影響は、 子宮内 、全身薬物送達の望ましくない副作用なしに研究することができます。他のインビトロ系と比較して、液滴の培養は、哺乳動物細胞系において再現することができない三次元の形態形成および細胞-細胞相互作用を研究する能力を可能にするだけでなく、大幅に少ない研究を必要とするだけでなく他のex vivoおよび in vitroよりもプロトコルで eagents。本稿では、適切なマウス胎児臓器解剖及び方法の有効性を実証するために、全体の臓器免疫蛍光続く直立滴培養技術を、示しています。 エキソビボ液滴の培養方法は、同等の生体内で観察され、in vivoモデルにおける胚致死によるさもなければ困難な試験プロセスを研究するために利用することができるものに臓器構造の形成を可能にします。モデルのアプリケーションシステムとして、小分子阻害剤は、精巣の形態形成における血管新生の役割を調べるために利用されます。各器官は広範囲であるプロトコルへの任意の器官特異的修飾を決定するために検討しなければならないが、これエキソビボ液滴の培養方法は、例えば、肺および潜在的に他のもののような他の胎児の臓器系に拡張可能です。この器官培養系は、胎児の器官、およびその結果と実験の柔軟性を提供するobtaineDこの技術を使用すると、研究者は、胎児の発育への洞察を得るのに役立ちます。

ex vivoでの液滴の文化は、細胞間相互作用とダイナミクスを研究するために、1は、生殖腺などの器官全体を操作することができます。 図1は、E11.5の性腺滴文化を準備する方法を段階的に示しています。培養プロトコルの最初のステップは、母マウス（ 図1Aおよび1B）からの胚を含む子宮の初期除去が含まれます。母親から子宮を除去した後、子宮壁が切断され、胚をさらに解剖（ 図1C-E）のために、PBSに卵黄嚢から解放されます。内臓を除去した後、泌尿生殖器の尾根は、胚（ 図1F）の後身頃の壁に沿って明確に表示され、（ 図1G）を単離します。生殖腺-中腎複合体は、その後離れて尿生殖隆起部（ 図1H）の切開され、小分子阻害剤（ 図1Iに液滴培養内に配置されます左：治療のために「T」）と小分子阻害剤（ 図1Iなし、右：制御のための「...

ex vivoの直立液滴培養は、現在のin vitroおよびin vivoの実験技術に代わるものです。このプロトコールは簡単に実施でき、必要な試薬の量が少なくて済みますが、胎児の血管新生、形態形成、器官形成を操作および研究することができます。

Investigating organogenesis in utero is a technically challenging process in placental mammals due to inaccessibility of reagents to embryos that develop ...

本手順の全体的な目的は、ex vivoドロップレット培養法を用いて、低分子阻害剤が胎児の器官形成に及ぼす影響を調べることです。まず、妊娠マウスの腹膜を開き、胚を含む子宮を摘出します。次に、子宮から胚を取り出し、卵黄嚢および羊膜から分離させます。その後、goad me neph complexを胚から解剖し、単離します。最後に、goad Meris complexを、低分子阻害剤を含むまたは含まない液滴中で培養します。最終的に、細胞種特異的抗体を用いて、免疫蛍光顕微鏡法により器官構造の変化を確認します。細胞株を用いた培養と比較した際、本研究の全器官ex vivo直立ドロップレット培養の利点は、三次元構造を有していることで局所的な細胞間相互作用が生じる点にあり、さらに器官の形成やパターニングに重要と考えられる細胞外マトリックスのシグナリングが得られる点にあります。また、この直立ドロップレット法を用いることで、使用する試薬量を削減でき、その結果、コストの低減および副作用による潜在的な毒性を軽減することが可能です。これは他の全器官培養手法に対する利点であり、かつ標的器官への薬理剤の拡散も維持することができます。この手法は胎児精巣の血管発達に関する知見を提供できるだけでなく、肺などの他の胎児器官にも適用可能であり、多様な生物学的プロセスの調査にも利用できます。胚齢11.5日の胎児の発達過程において、他の細胞シグナル伝達経路も存在します。処置書に従い、妊娠マウスを安楽死させた後、腹部に70% ethanolをスプレーし、微細剪刀を用いて切開します。腹部の皮膚と腹膜にV字型の切開を加え、組織のフラップを押し広げて前方の臓器を露出させます。子宮角の両端にある卵巣を確認し、ハサミで卵巣と結合組織を切断して、胚を含む子宮を母体から分離します。次に、胎盤とは反対側の側面を慎重に切開して子宮壁を開き、卵黄嚢を露出させます。胚を損傷させたり消失させたりしないよう、卵黄嚢を突き刺さないように注意してください。次に、胎盤の近くを切断して卵黄嚢を含む胚を取り出し、カルシウムとマグネシウムを含むPBSが入ったディッシュに入れます。これにより、細胞接着分子がサポートされ、組織構造が維持されるとともに、組織が器具に付着するのを防ぐことができます。ピンセットを用いて、卵黄嚢を慎重に突き刺して穴を開け、そこから胚を滑り出させるようにして、胚から卵黄嚢と羊膜を取り除きます。胚が卵黄嚢から出たら、臍帯を切断します。ここからは、滅菌済みの組織培養フード内にある顕微鏡を使用します。ピンセットで頸部の両側をつまんで胚の頭部を取り除き、頭部を廃棄します。次に尾部を取り除き、胚の性を判定するためのX-Y-P-C-R分析用として、新しいマイクロ遠心チューブに入れます。その後、1組のピンセットで胚の脇の下を固定し、別

using-ex-vivo-upright-droplet-cultures-whole-fetal-organs-to-study

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

このビデオはembyonic日12匹のマウスからマウスの前脳の外植片を分離して培養するためのプロトコルを示しています。子宮の除去、子宮から胚、および胚の解離の手続が与えられている。さらに、それらが培養されている特殊な膜にこれらの外植片を転送するための方法論が示されている。前脳の発達は、この準備だけでなく、遺伝子発現の変化を用いてin...

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学ぶエクスビボ直立飛沫培養法を用いたマウス胎児器官の発生過程研究。低用量試薬で血管形成と器官形成を詳細に解析し、免疫蛍光顕微鏡で組織構造変化を可視化する革新的手法です。

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