使い方エクスビボ全体の胎児器官の直立飛沫培養物をマウス器官中に発生過程を研究します
October 21st, 2015
ex vivoの直立液滴培養は、現在のin vitroおよびin vivoの実験技術に代わるものです。このプロトコールは簡単に実施でき、必要な試薬の量が少なくて済みますが、胎児の血管新生、形態形成、器官形成を操作および研究することができます。
この手順の全体的な目標は、ex vivo液滴培養技術を使用して、胎児臓器の発達に対する低分子阻害剤の影響を調べることです。これは、最初に妊娠したマウスの腹膜を開き、子宮を含む胚を摘出することによって達成されます。次に、胚を子宮から取り出し、卵黄と羊膜嚢から解放されます。
その後、goad me neph複合体が解剖され、胚から分離されます。最後に、ヤギメリス複合体は、低分子阻害剤の有無にかかわらず、液滴中で培養されます。最終的に、免疫蛍光顕微鏡法を使用して、細胞型特異的抗体を使用して臓器構造の変化を示します。
ですから、例えば細胞培養株と比較して、私たちの全臓器のex vivo直立液滴培養の利点は、局所性による細胞相互作用を引き起こす三次元構造を持つという利点と、臓器形成やパターニングに重要な細胞外マトリックスシグナル伝達を持っていることです。さらに、当社の直立液滴技術により、使用する試薬が少なくて済むため、副作用によるコストと潜在的な毒性が軽減されます。これは、他の全臓器技術よりも優れており、それでも標的臓器への薬理学的物質の拡散を可能にします。
この手法は、胎児精巣の血管発達に関する洞察を提供しますが、肺などの他の胎児臓器にも適用でき、多様な生物学的プロセスを調査するためにも使用できます。胎児の発育中に他の細胞シグナル伝達経路があります E 11.5で。テキストによると、妊娠中のマウスを安楽死させた後、70%エタノールを使用して細いはさみで腹部にスプレーします。
V字型の切開を行って腹部の皮膚と腹膜を開き、組織のフラップを引き戻して前臓器を露出させます。子宮角の両端に卵巣を配置し、次に卵巣と結合組織をはさみで切って、胚を含む子宮を母親の体から分離します。次に、胎盤の反対側をそっと切って子宮壁を開き、卵黄の袋を露出させます。
胚の損傷や損失を避けるために、卵黄袋に穴を開けないように注意してください。次に、胎盤の近くを切って卵黄袋を含む胚を取り出し、カルシウムとマグネシウムを含むPBSを含む皿に入れます。これにより、細胞接着分子をサポートして組織の構造を維持し、組織がツールにくっつくのを防ぎます鉗子を使用して、卵黄嚢を慎重に穴を開けて胚から卵黄嚢と羊膜を取り除き、胚が滑り出すことができる穴を作ります。胚が卵黄嚢の外に出たら、臍帯を切断します。
この時点から、無菌組織培養フードにある顕微鏡を使用します。鉗子を使用して首の両側をつまんで胚の頭を取り出し、頭を捨て、尾を取り外し、新しいマイクロ遠心チューブに入れてX-Y-P-C-R分析を行い、胚の性別を決定します。次に、一対の鉗子を使用して胚の脇の下を別の一対の鉗子で固定することにより、胚を培養皿の底に対して仰臥位
に固定します。腹部を覆っている皮膚を切除し、肝臓、腸、その他の臓器をそっと取り除いて、泌尿生殖器の隆起がある後部の体壁を露出させます。鉗子を使用して、鉗子を慎重に開いて持ち上げることにより、泌尿生殖器の隆起の下をすくい取ります。泌尿生殖器の隆起を取り除きます。
生殖腺を傷つけないように注意してください。泌尿生殖器隆起をC-D-M-E-Mの皿に移し、27ゲージの針を使用して組織を培地に順応させ、生殖腺Sphs複合体を泌尿生殖器ブリッジの残りの部分から分離します。片方の針で押し下げて切断し、もう片方の針で組織を正しくガイドして、培養に最適な分離を可能にします。
低分子阻害剤を添加した生殖腺は、清潔な滅菌されたカミソリの刃を使用して、2つの20マイクロリットルのピペットをそれぞれ15マイクロリットルにセットしました。生殖腺の移し替えおよび制御C-D-M-E-Mの付加のための障壁のピペット先端の1つから約1から2ミリメートル切って下さい。生殖腺の長軸をピペットチップと平行にしてピペットで簡単にピペッティングできるように、35ミリメートルの皿蓋の片側を制御液滴としてラベル付けし、もう片側を薬剤含有液滴としてラベル
付けします。蓋のラベルが、マイクロ遠心チューブを含む尾部組織のラベルと一致していることを確認してください。1つの生殖腺を含む15マイクロリットルのC-D-M-E-Mを蓋の液滴にピペットで入れます。生殖腺がピペットチップの内側にくっつかないように注意し、反対側の2番目の液滴で繰り返します。
生殖腺がコントロールとして指定された液滴に移されたことを顕微鏡で確認します。コントロールピペットを使用して、DMSOを含む15マイクロリットルのC-D-M-E-Mを追加して、他の液滴に30マイクロリットルの液滴に到達します。薬剤指定のピペットを使用して、ピペットを使用してC-D-M-E-MにTKI 2の15マイクロリットルを追加します。
液滴の直径が約15〜18ミリメートルになり、生殖腺がほぼ中央に位置するまで、液滴を拡大円形のパターンで広げます。生殖腺が横になり、ヤギとメッシーヌが簡単に区別できるように、生殖腺を向きます。2つの葉が平らになり、互いに接触しないように表面張力によって所定の位置に保持されるように、肺の向きを合わせます。
液滴を直立させ、大きな加湿器皿の水面に平らに置いた培養皿の蓋を慎重に置き、下に泡が閉じ込められていないこと、および蓋に水が入らないようにします。小さな加湿チャンバーを作成するには、すぐに大きな皿を蓋で覆い、小さな皿の蓋が大きな皿の中で自由に動き、空気交換が起こることを確認します。2つの小さな蓋をチャンバーに入れたら、すぐにチャンバーを摂氏37度の二酸化炭素インキュベーターに48時間置きます。
PCRおよび免疫蛍光法をテキストプロトコルに従って実施します。Exvivo液滴培養システムを使用して培養すると、ここに示すように胎児のgona sphs複合体の生存率が高くなります。初期インキュベーション時のE 11.5生殖腺と培養中の24時間または48時間の比較では、ここで見られるように、コントロールXY生殖腺の生殖腺の形状と縞状のコード構造の外観に劇的な変化が見られます。
液滴培養システムは、XY生殖腺内のSOX9陽性セルトリ細胞が結束状臍帯に形成され、臓器全体に血管系が形成されることを視覚化できるため、精巣の分化イベントを生体外で再現できます。肺では、48時間培養により、SOX 9 eco herrin double陽性上皮枝の分岐が増加します。肺のアポトーシス細胞はいくらか増加していますが、同じ培養条件では、対照培養と子宮内で同様のレベルのアポトーシスが見られます。
生殖腺は、生殖腺が特に培養条件に適していることを示唆しています。精巣の形態形成における血管新生と血管リモデリングの影響を調べるために、VEGF受容体の活性を阻害する低分子阻害剤TKI twoを使用しました。この結果は、胎児精巣における血管リモデリングの破壊が液滴培養系において有効であり、この手順に従ってその後の精巣臍帯形態形成の欠損を可視化できることを実証しています。
リアルタイム定量PCR、次世代RNAシーケンシング、フローサイトメトリーなどの他の方法を実行して、さまざまな薬理学的試薬が目的のタンパク質や遺伝子の発現にどのように影響するかなどの追加の質問に答えることができます。さらに、トランスジェニック蛍光胚を使用する場合、タイムラプスライブイメージングを使用して細胞のダイナミクスをリアルタイムで視覚化できます。さらに、胎児の器官形成に関与する可能性のあるシグナル伝達経路の候補を標的とするために、さまざまな試薬が利用可能です。
これらの技術は、胎児の発育を促進する根本的なメカニズムを理解するのに役立ちます。このビデオを見た後、胎児の器官形成中のシグナル伝達経路を解明するために、全臓器のex vivo直立液滴培養を行うことができるはずです。この技術には、妊娠半ばの胚の解剖、標的臓器の単離、およびこれらの臓器を医薬品試薬とインキュベートするための直立液滴培養物の調製が含まれます。
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
概要
エクスビボの直立液滴培養は、胎児器官発達を研究するための革新的な技術です。この方法では、より少量の試薬を使用しながら、胎児の血管形成と器官形成を操作することができます。
主要な研究要素
科学分野
- 神経科学
- 発生生物学
- 細胞生物学
背景
- 現在のインビトロおよびインビボ技術には限界があります。
- エクスビボの液滴培養は、より簡単な代替手段を提供します。
- この方法は、複雑な生物学的プロセスの研究を容易にします。
- 小分子阻害剤の器官発達への影響をテストすることができます。
研究目的
- 小分子阻害剤が胎児器官発達に与える影響を調べる。
- この検査にエクスビボの液滴培養技術を利用する。
- 免疫蛍光顕微鏡を用いて器官構造の変化を評価する。
使用した方法
- 妊娠マウスの腹膜を開く。
- 胚を取り出し、腺-メルニス複合体を分離する。
- 腺-メルニス複合体を液滴で培養する。
- 細胞タイプ特異的な抗体を用いた免疫蛍光顕微鏡を使用する。
主要な結果
- 器官構造の変化が観察された。
- 小分子阻害剤の影響が記録された。
- 液滴培養技術がこの研究に効果的であることが証明された。
- 免疫蛍光顕微鏡が貴重な洞察を提供した。
結論
- エクスビボの液滴培養は、胎児器官発達を研究するための実行可能な代替手段である。
- この方法は器官形成の詳細な検査を可能にします。
- 小分子阻害剤は胎児器官発達に大きな影響を与える可能性があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
The ex vivo upright droplet culture method enables mechanistic interrogation of fetal organ development with reduced reagent consumption and preserved three-dimensional architecture. This approach supports target validation and pathway de-risking in early discovery by allowing pharmacological modulation of specific signaling pathways without systemic toxicity. The system provides a scalable, reproducible platform for assessing compound effects on organ morphogenesis, informing go/no-go decisions in preclinical pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables functional validation of therapeutic targets by examining organ-specific responses to small molecule inhibitors in intact fetal organs.
- Operational Value: Reduces reagent usage and cost compared to traditional ex vivo or in vitro systems while maintaining tissue integrity.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by visualizing downstream effects of pathway inhibition on organ architecture and cellular differentiation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides a quantitative readout of organogenesis through immunofluorescence-based assessment of structural changes and marker expression.
- Operational Value: Facilitates assay standardization via upright droplet culture format that ensures consistent organ positioning and reagent diffusion.
- Scalability: Enables parallel testing of control and compound-treated conditions within the same experimental setup.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical evaluation by modeling human-relevant organogenesis processes in a physiologically contextual system.
- Biomarker Alignment: Supports evaluation of pathway-specific biomarkers (e.g., SOX9) in response to pharmacological perturbation.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables early detection of developmental toxicity or mechanistic liabilities that may not appear in cell-based assays.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation through lead optimization by providing a physiologically relevant system for assessing compound effects on fetal organ development.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling direct observation of pharmacological impacts on morphogenesis and cell-cell interactions.
- Screening: Delivers assay readiness through reproducible droplet culture technique that allows standardized compound exposure and readout via immunofluorescence.
- Analytics: Generates quantitative, imaging-based readouts that enable comparison of organ architecture, branching patterns, and cellular differentiation across conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by modeling organ-specific responses relevant to developmental toxicity assessment.
- Enterprise Reuse: Represents a reusable platform applicable across multiple fetal organ systems (e.g., testis, lung) with organ-specific adaptation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence by preserving native tissue architecture and enabling study of multicellular interactions lost in monolayer cultures.
- Operational Value: Improves reproducibility and reduces variability through standardized dissection, culture, and imaging protocols.
- Strategic Value: Informs better go/no-go decisions by identifying mechanistic liabilities early in the discovery pipeline.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by providing data on target engagement and pathway modulation in intact organ systems.
Implementation Considerations
- Requires expertise in embryonic dissection and organ isolation under sterile conditions.
- Dependent on access to microscopy and immunofluorescence infrastructure for endpoint analysis.
- Necessitates standardization of droplet preparation and incubation conditions across users and labs.
- Involves adaptation considerations for different fetal organs due to variations in size, fragility, and culture tolerance.
- Limited by the embryonic lethality of certain genetic or pharmacological perturbations in vivo, which this method helps circumvent.
