蛍光標識ナノ粒子を用いたマウス、ヒトおよびブタ起源のライブ細胞の細胞内遺伝子発現の検出

本手順の目的は、遺伝子特異的な蛍光ナノ粒子を用いることで、生細胞内の遺伝子発現を直接的に解析することです。まず、目的遺伝子における適切なターゲット配列を定義します。次に、特定のキャプチャストランドおよびリポーターストランドを備えたナノ粒子を作製します。

次に、ナノ粒子を生存細胞の培地に直接添加します。最終ステップとして、細胞をナノ粒子と共に、加湿された37°C、5% CO2の条件下で一晩インキュベートします。最終的に、蛍光顕微鏡を用いて生存標的細胞内の遺伝子特異的な蛍光を可視化し、フローサイトメトリー解析を用いて蛍光細胞数を定量します。

免疫組織化学、分子ビーコン、またはPCR解析などの既存の手法に対するこの技術の主な利点は、細胞培養への操作を加えることなく、生存細胞内で遺伝子発現を視覚的に観察できることです。手順のデモンストレーションは、当研究室の生物学者で博士課程の学生であるMartina Teresaと、フローサイトメトリーを担当するLynette Henkelが行います。標的配列を決定した後、市販の供給源から凍結乾燥された金ナノ粒子を注文してください。

これらの粒子は、キャプチャーストランドに共有結合した中心の金粒子で構成されており、そのキャプチャーストランドにリポーターストランドが結合しています。標的mRNAがキャプチャーストランドに結合すると、リポーターストランドとそれに結合したフルオロフォアが溶液中に放出され、Fluor fourが蛍光を発します。再構成させる前に。

ナノ粒子は、段ボール箱に入れ、4°Cの暗所で保存してください。金ナノ粒子を再構成するには、2重蒸留水を20 µL加え、最終濃度を100 nMにします。再構成したナノ粒子は、室温の暗所で少なくとも1年間保存可能です。

適用当日に、金ナノ粒子のストック溶液をPBSで20倍濃縮のワーキングソリューションに希釈します。HEK 2 93細胞を含む24ウェルプレートを細胞培養インキュベーターから取り出し、培地を吸引して除去した後、237.5 µLの新鮮な培養培地を加えます。次に、調製した各ウェルに12.5 µLのナノ粒子ワーキングソリューションをピペットで加え、プレートを揺らしてナノ粒子を均一に分散させます。細胞を、加湿条件下、37 °C、5% CO2で一晩インキュベートします。翌日。

フローサイトメトリーに供するため、標準的な蛍光顕微鏡を用いて、細胞培養物の遺伝子特異的なサイト3蛍光を分析します。サイト3誘導蛍光を示すHEK 2 9 3細胞をPBSで1回洗浄し、0.05% trypsin EDTAを1 mL添加して、37 °C、5% CO2の条件下で3分間インキュベートします。インキュベーション後、CO mediumを0.5 mL添加し、ピペッティングを行います。

その後、細胞を15 mLチューブに移します。3 mLの培地を加え、300 ×gで5分間遠心分離します。次に、上清を除去し、細胞を200 µLの氷冷した FACSバッファーで再懸濁します。細胞を1.5 mLチューブに移し、分析まで氷上で遮光保存します。

フローサイトメトリー分析の前に、細胞の凝集を防ぐため、細胞を30 µmフィルターに通します。次に、最終濃度が2 µg/mLとなるようにプロピジウムヨードを細胞に加え、少なくとも2分間静置します。その後、細胞をフローサイトメーターのボルテックスにかけ、サンプルチューブを装置にロードします。SI3陽性細胞を検出します。

未処理のコントロール細胞を用いて、前方散乱光（FSC area）対側方散乱光（SSC area）サブセット、FSC height対FSCサブセット、およびSSC height対SSCサブセットに階層的ゲートを設定し、細胞デブリや非特異的に散乱する細胞を除外します。プロピジウムヨード染色に基づき、PEチャンネルをPE Texas Redチャンネルに対して表示させることで死細胞を解析から除外した後、サイト3のPE陽性細胞に対して最終的なソートゲートを適用します。GA dhの検出。

実験の実現可能性を検証するため、HEK 293細胞を用いて恒常的に発現するハウスキーピング遺伝子の解析を行いました。スクランブル陰性対照ナノ粒子はほとんど、あるいは全く蛍光を示しませんが、陽性取り込みでは持続的な蛍光が認められます。対照群では、一晩のインキュベーション後に強いシグナルが示されます。

これらのナノ粒子は、ヒトおよびブタの誘導多能性幹細胞（iPSC）において、多能性幹細胞マーカーであるnanoおよびGDF3の遺伝子発現を特異的に検出することが示されました。重要な点として、これらのマーカーはiPSCでのみ検出され、iPS細胞培養中にフィーダー層として使用した線維芽細胞では検出されませんでした。GA DHナノ粒子のラベル化効率を評価するために、ナノ粒子の添加量を0から1000まで段階的に変化させ、視覚的解析およびフローサイトメトリーによる定量的解析の両方を用いました。

PICOMOLARをHEK 293細胞を用いて実施したところ、蛍光強度が濃度依存的に明らかに増加することが示されました。次にマウス胚性幹細胞で定量分析を行ったところ、400 PICOMOLAR GA DHナノ粒子を添加した後、約40%の細胞がCY three陽性となりました。多能性マーカーについても同様の値が得られました。

NanoおよびGDF 3の習得後、本手法は適切に実施すれば16時間以内に完了させることができます。このビデオを視聴することで、遺伝子特異的ナノ粒子を用いて、蛍光顕微鏡により生細胞内の遺伝子発現を直接検出する方法について深く理解できるはずです。