2.3: モデル生物の遺伝子工学

遺伝子工学は、トランスジェネシスとして知られるプロセスでモデル生物のゲノムを改変するために使用される貴重なツールです。発生生物学では、このアプローチは、生体組織で視覚化できる修飾遺伝子を発現するためによく使用されます。あるいは、遺伝子工学を使用してタンパク質の発現を防止または中断し、特定の遺伝子の発生機能を研究することもできます。

このビデオでは、このテクノロジーの背後にある原理を要約し、いくつかの遺伝子工学手順をレビューし、これらの技術がラボでどのように使用されているかに焦点を当てます。

まず、トランスジェネシスの根底にあるいくつかの重要な概念を探ってみましょう。これには、モデル生物のゲノムへのDNAの挿入が含まれます。研究の目的に応じて、いくつかのアプローチがあります。

まず、改変された遺伝子を追加することで、突然変異による機能的または形態学的変化が明らかになるかもしれません。別の方法は、改変されていない野生型遺伝子の追加コピーを挿入して、過剰発現の影響を研究することですが、これはしばしば突然変異と同じくらい損害を与える可能性があります。別のアプローチは、緑色蛍光タンパク質などの視覚化可能なタグを含む融合タンパク質を挿入して、生きた動物における遺伝子発現の位置とタイミングを追跡することです。

ゲノムに挿入されるDNAのセグメントは、目的の発現パターンと結果を生み出すように慎重に設計する必要があります。プロモーターは、遺伝子がいつ、どこで発現するかを決定する配列要素であり、重要な構成要素です。特定のプロモーターは、ほぼすべての組織に遍在的に発現していますが、他のプロモーターは特定の組織でのみ活性があります。また、化学薬品の投与や高温への曝露によって活性化される誘導性プロモーターは、遺伝子発現のタイミングを制御するためにも使用できます。

組織で安定的に発現するためには、導入遺伝子はまずゲノムに組み込まれる必要があります。これを達成するために、導入遺伝子には、生物のゲノムの領域に一致する隣接するDNA配列を含めることができます。これにより、導入遺伝子は相同組換えとして知られるプロセスを通じて宿主DNAと統合することができます。あるいは、一部の種では、トランスポゾンと呼ばれる特別な要素が、トランスポゼーションのランダムなゲノム挿入を触媒する酵素トランスポザーゼの認識部位を含めることで、トランスジェネシスをより効率的にすることができます。

導入遺伝子設計の基本を理解したところで、次はトランスジェニック動物の作り方を復習しましょう。導入遺伝子コンストラクトを作製するには、まずPCRを用いて目的の遺伝子を増幅します。次に、この増幅された領域は、導入遺伝子を細胞に運ぶことができるDNAの一部であるベクターにクローニングされます。ベクターには通常、大腸菌などの細菌を用いた効率的な導入遺伝子増幅を可能にする要素が含まれています。この増幅ステップの後、ベクターは細菌培養物から精製されます。

トランスジェニック動物は、精製したDNAを胚に注入することによって作られます。魚やカエルでは、通常、構築物は単細胞期の胚の卵黄または細胞質に直接注入されます。トランスポゾン媒介性トランスジェネシスの場合、トランスポゼース酵素をコードする転写産物を注入ミックスに添加します。

マウスでは、精子と卵子前核がまだ融合していない新しく受精した卵子を操作することでトランスジェネシスを達成できます。このコンストラクトは、より大きな前核に直接注入され、細胞が分裂するにつれてゲノムに統合される可能性があります。その後、卵子は開発のために偽妊娠女性の子宮に移植されなければなりません。

トランスジェネシスの効率はさまざまであるため、コンストラクトがゲノムにうまく組み込まれた子孫を特定するために、動物をスクリーニングする必要があります。これは、簡単に同定するために挿入された蛍光タグを探すか、小さな組織片から単離されたゲノムDNAのPCRなどの分子解析によって行うことができます。

遺伝子工学への2つ目のアプローチは、遺伝子機能を破壊するための特定の遺伝子ターゲティングに焦点を当てています。この目標を達成するには、複数のアプローチがあります。ゲノム編集として知られる比較的新しい方法の1つは、ヌクレアーゼと呼ばれる配列特異的な酵素を利用し、DNAが修復されるときにDNA骨格を切断し、遺伝子に突然変異を引き起こします。

別の標的化方法には、相同組換えを使用して、遺伝子を外来DNAまたは遺伝子のコピーに置き換え、リコンビナーゼとして知られる酵素の認識配列に隣接する方法が含まれます。リコンビナーゼが存在する場合、隣接する配列はゲノムから切り出されます。これはコンディショナルノックアウトとして知られており、遺伝子切り捨ての制御は、特定の組織または特定の時点で酵素を発現させることによって達成できます。

相同組換えによるノックアウトマウスの生成の一般的な手順を復習してみましょう。ここでは、ゲノムDNA配列の一部が外来DNAで置換されるコンストラクトを調製しなければならない。このDNAは、抗生物質耐性などの別の遺伝子をコードしていることが多く、後のステップで正常に改変された細胞を選択する方法を提供します。

手順を開始するには、胚盤胞として知られる初期のマウス胚の内部細胞塊から胚性幹細胞を採取します。次に、線形化された構造はエレクトロポレーションを介して幹細胞に送達され、電気パルスが細胞膜に一時的な細孔を生成します。次に、細胞を抗生物質の存在下でインキュベートし、導入遺伝子を含まない細胞を排除します。

この選択ステップの後、幹細胞は胚盤胞段階で別のマウス胚に注入することができます。その後、胚を雌マウスの子宮に移し、発生を続けます。結果として得られる仔は、野生型細胞とノックアウト細胞の両方で構成されるキメラになります。一部のキメラは、生殖細胞系内にノックアウト細胞を持ち、育種時に破壊された遺伝子を伝達し、新しいノックアウトラインを確立します。

発達モデルの遺伝子工学の基礎を学んだので、ここからは具体的な応用について見ていきましょう。

発生研究では、蛍光タグ付きタンパク質を使用して細胞を同定し、その発生を研究することがよくあります。組織特異的なプロモーターを使用して、トランスジェニック生物は、神経堤などの特定の細胞で蛍光タンパク質を発現するように操作できます。高度なイメージング技術を使用して、蛍光細胞をリアルタイムでイメージングできるため、研究者は複雑な発生イベントを直接視覚化できます。

遺伝子工学のもう一つの重要な用途は、特定の遺伝子と疾患の表現型におけるそれらの役割を研究することです。ここでは、TALENなどのヌクレアーゼを使用して、特定のマウス遺伝子に標的変異を導入します。PCRは、マウスが遺伝子のコピーを0個、1個、または2個変異させているかどうかを示します。現在では、2つの変異コピーを持つ胚を詳細に研究して、遺伝子の発生機能を決定することができます。

コンディショナルノックアウトを使用すると、科学者は制限された細胞セット内の遺伝子の機能を決定できます。ここでは、loxPに隣接する遺伝子が胚全体にわたって発現していましたが、Creは内皮細胞でのみ発現していたため、心臓と血管の遺伝子欠失が引き起こされました。この組織特異的なノックアウトは、胚の心拍数に測定可能な変化をもたらし、生物全体を変化させることなく遺伝子の局所的な役割をテストする方法を示しています。

JoVEのトランスジェニックテクノロジーの紹介をご覧になりました。これらの手法は、遺伝子工学の基本、関連するいくつかの方法、およびそれが日常の科学にどのように適用されるかを理解するのに役立ちます。遺伝子工学は、多くの生物に広く適用することができ、発達疾患や成人期に現れる疾患における遺伝学の役割を研究し理解するための重要なツールであり続けるでしょう。ご覧いただきありがとうございます!