Name: 上皮細胞の再増殖および腎組織の開発のための齧歯類細胞外マトリックスの足場の調製 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: 学ぶ ラット腎臓の脱細胞化とヒト腎上皮細胞による再増殖法。灌流型バイオリアクター内でレサズリンアッセイを用いて細胞生存性を評価し、腎組織工学と再生医療への応用可能性を示す。

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著者は、Zell Family Foundationの支援に感謝します。ノースウェスタン記念財団のディクソントランスレーショナルリサーチ助成金イニシアチブ、米国移植外科学会のファカルティデベロップメント助成金、およびイリノイ州の国立腎臓財団からの若手研究者のための研究助成金からの支援を認識しています。ロバート・R・マコーミック財団からの支援に感謝します。このDK10175研究に使用されたイメージングおよび組織学コアは、ノースウェスタン大学のマウス組織学および表現型研究室、電子プローブ機器センター(EPIC)、およびシンプソンクエリ研究所機器コア、およびがんセンター支援助成金(NCI CA060553)によってサポートされています。著者は、げっ歯類の腎臓調達のためのノースウェスタン大学のマイクロサージェリーコアに感謝したいと思います。再細胞化後の腎尿細管上皮の形態の評価は、P30 CA118100によってサポートされている蛍光顕微鏡共有リソースで実施されました。

<ol><li>Uzarski, J. S., Xia, Y., Belmonte, J. C., Wertheim, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+strategies+in+kidney+regeneration+and+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+nephrology+and+hypertension%22%5BJournal%5D)">New strategies in kidney regeneration and tissue engineering.</a> Current opinion in nephrology and hypertension. 23, 399-405 (2014).</li>
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<li>Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularized+allogeneic+and+xenogeneic+tissue+as+a+bioscaffold+for+regenerative+medicine%3A+factors+that+influence+the+host+response%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Decellularized allogeneic and xenogeneic tissue as a bioscaffold for regenerative medicine: factors that influence the host response.</a> Ann Biomed Eng. 42, 1517-1527 (2014).</li>
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<li>Sullivan, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularization+methods+of+porcine+kidneys+for+whole+organ+engineering+using+a+high-throughput+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Decellularization methods of porcine kidneys for whole organ engineering using a high-throughput system.</a> Biomaterials. 33, 7756-7764 (2012).</li>
<li>Vishwakarma, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+natural+three-dimensional+goat+kidney+scaffold+for+the+development+of+bioartificial+organ%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+journal+of+nephrology%22%5BJournal%5D)">Preparation of natural three-dimensional goat kidney scaffold for the development of bioartificial organ.</a> Indian journal of nephrology. 24, 372-375 (2014).</li>
<li>Ross, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cells+proliferate+and+differentiate+when+seeded+into+kidney+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cells proliferate and differentiate when seeded into kidney scaffolds.</a> J Am Soc Nephrol. 20, 2338-2347 (2009).</li>
<li>Song, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+and+experimental+orthotopic+transplantation+of+a+bioengineered+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Regeneration and experimental orthotopic transplantation of a bioengineered kidney.</a> Nat Med. 19, 646-651 (2013).</li>
<li>Bonandrini, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recellularization+of+well-preserved+acellular+kidney+scaffold+using+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">Recellularization of well-preserved acellular kidney scaffold using embryonic stem cells.</a> Tissue Eng Part A. 20, 1486-1498 (2014).</li>
<li>Burgkart, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularized+kidney+matrix+for+perfused+bone+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+C+Methods.2%22%5BJournal%5D)">Decellularized kidney matrix for perfused bone engineering.</a> Tissue Eng Part C Methods.2. 20, 553-561 (2014).</li>
<li>Ross, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+stem+cells+seeded+into+decellularized+rat+kidney+scaffolds+endothelialize+and+remodel+basement+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Organogenesis%22%5BJournal%5D)">Mouse stem cells seeded into decellularized rat kidney scaffolds endothelialize and remodel basement membranes.</a> Organogenesis. 8, 49-55 (2012).</li>
<li>Uzarski, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-purpose+bioreactors+to+monitor+non-invasive+physical+and+biochemical+markers+of+kidney+and+liver+scaffold+recellularization%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+C+Methods%22%5BJournal%5D)">Dual-purpose bioreactors to monitor non-invasive physical and biochemical markers of kidney and liver scaffold recellularization.</a> Tissue Eng Part C Methods. , (2015).</li>
<li>Brien, J., Wilson, I., Orton, T., Pognan, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+the+Alamar+Blue+%28resazurin%29+fluorescent+dye+for+the+assessment+of+mammalian+cell+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22European+journal+of+biochemistry+%2F+FEBS%22%5BJournal%5D)">Investigation of the Alamar Blue (resazurin) fluorescent dye for the assessment of mammalian cell cytotoxicity.</a> European journal of biochemistry / FEBS. 267, 5421-5426 (2000).</li>
<li>Loghman-Adham, M., Nauli, S. M., Soto, C. E., Kariuki, B., Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immortalized+epithelial+cells+from+human+autosomal+dominant+polycystic+kidney+cysts.+American+journal+of+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Renal+physiology%22%5BJournal%5D)">Immortalized epithelial cells from human autosomal dominant polycystic kidney cysts. American journal of physiology.</a> Renal physiology. 285, F397-F412 (2003).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

記載の脱細胞化プロトコルは、一貫して血管内皮細胞7,17に加えて、（近位および遠位尿細管の両方由来の）ヒト腎皮質尿細管上皮細胞の培養のための3次元テンプレートとして機能する完全無細胞腎ECMを生成します。カニューレを挿入し、腎血管系は、このように灌流脱細胞化、細胞播種、長期灌流培養、およびレサズリン灌流プロトコルを有効にする、バイオリアクターのセットアップ内の足場全体に試薬および細胞の均一な送達のための重要な特徴となっています。このように、従来の臓器灌流の腎動脈の適切な挿管は重要であり、特別なケアは、腎動脈が閉塞または損傷し、カテーテルが固定されていることをされていないように注意する必要があります。血管内血栓をbができないように腎臓が回収されるのSDラットは、全身、臓器調達時の血管系内の凝固を避けるために、ヘパリン処理されなければなりませんEを除去し、腎臓の完全な脱細胞化を阻害することができます。 再細胞化腎臓の播種および灌流培養に使用される灌流バイオリアクターは、その場 17 内の複数の</e...

An erratum was issued for <a href="http://www.jove.com/video/53271/epithelial-cell-repopulation-preparation-rodent-extracellular-matrix">Epithelial Cell Repopulation and Preparation of Rodent Extracellular Matrix Scaffolds for Renal Tissue Development</a>.
The human RCTEC/RCTE cell stocks used here and in Caralt et al., 2015, Uzarski et al., 2015 were originally provided by Dr. Loghman-Adham (then at St. Louis University) to co-author Dr. Wandinger-Ness (University of New Mexico) through an MTA in 2001. The SV40 immortalized human RCTEC/RCTE cells were characterized as being of distal tubule cell line as detailed in Loghman-Adham et al., 2003. On the basis of recent short tandem repeat (STR) DNA sequencing (Performed by IDEXX BioResearch) of the earliest passages of the RCTEC/RCTE cell stocks it became evident the cells were of mixed lineage. Further analyses of PCR products using QIAxcel capillary electrophoresis demonstrated the presence of a canine product. The product was sequenced and established to be of canine origin. A set of canine specific STR markers were compared to the sample and showed that the sample had a genetic profile with 92% identity to the MDCK cell line.&#160; Later cell stocks that were used in the present publication were STR profiled and showed drift to 100% MDCK lineage. Despite being of canine origin, rather than human as was previously thought, MDCK is similarly a distal tubule epithelial cell line. For this reason, previous interpretation and conclusions drawn using these cells here and in Caralt et al., 2015, Uzarski et al., 2015 remain sound, but for purposes of rigor, reproducibility and experimental validation by others we report on this misidentification. This information will also be reported for listing on the International Cell Line Authentication Committee (ICLAC) database (http://iclac.org).

Erratum: Epithelial Cell Repopulation and Preparation of Rodent Extracellular Matrix Scaffolds for Renal Tissue Development

末期腎不全に罹患している患者の数が増加し続けるように、移植のために利用可能なドナーの腎臓の多数の深刻な、成長不足しています。腎臓移植を待つ-リストされた候補者の継続的上昇数は需要1,2にカスタマイズされた、移植可能な腎臓移植の開発を究極の目標と腎臓臓器工学の研究を促してきた。の需要を満たすことができないこと患者自身の細胞から機能する腎臓組織を構築することは、生涯免疫抑制の必要性を排除する患者が腎臓移植を待っている透析に費やす時間の量を減少させ、慢性腎疾患を有するより多くの患者に救命移植を延長します。 患者由来の細胞を用いて、腎臓組織を生物工学に向けた最初のステップは、腎実質のための支援基質となる足場を開発することである（ 例えば、管状epitheLIAL）、間質線維芽細胞、および血管細胞増殖。自然の臓器の細胞外マトリックス（ECMの）由来の生体材料足場は、それらの天然の生物学的組成物を含む、組織工学での使用に望ましいものにいくつかの特徴を持っています。生理的機能を付与するための適切なマクロとミクロ構造;および細胞の生体適合性、細胞接着、遊走、および3を改造建設組織を促進します。腎組織再生のための足場を製造するための有望な方法は、腎ECM 4の複雑な天然のタンパク質組成物の多くを保存する臓器の固有のアーキテクチャの複雑さを保持し、ボトムに伴う困難を克服する同種異系または異種腎臓の脱細胞化によるものです足場再細胞化5の後に発展する細胞への血管供給を提供することによって、厚い細胞化組織のエンジニアリングまで。 灌流脱細胞化は、プロセスでありますこれは界面活性剤、酵素、または他の細胞破壊するソリューションを均一臓器6の血管網を介して配信されます。この戦略は破棄ヒト腎臓9から無細胞腎テンプレートの開発によって証明されるように、全体の臓器工学6-8のための生物学的テンプレートが、3次元（3D）のように無細胞器官系ECM足場を導出するために効率的な方法として確立されています大動物（ 例えば、ブタ 10、ヤギ11）および齧歯類源12から得られた異種腎臓。特に、げっ歯類などの小型動物モデルの使用は、より少数の細胞および幹細胞由来の組織と同様に、細胞数は、通常、限定された臓器の再細胞化の研究のために特に有用である培養培地を必要とします。説明脱細胞化プロトコルの目的は、腎臓の再生のための三次元足場システムとして使用することができる無細胞腎ECMを生成することであるstructurヒト腎臓皮質細管上皮（RCTE）細胞と、本実施例では再増殖しているネフロン細管を含め、ES。我々は以前、以前に報告されている他の方法よりも迅速で最適な、界面活性剤ベースのラット腎臓脱細胞化プロトコル7、（約1日）の当社の厳格な評価（ロスら .- 5日12、Song ら .- 4.5日を記載しました13）、前の報告12~15より脱細胞化中に変性剤ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）のかなり低い濃度（0.1％）の臓器を露出させます。 研究の限られた数は、（他の場所で1レビュー）細胞の再増殖12-16ための3D足場として脱細胞化およびその後の使用のためにげっ歯類の腎臓の使用を記載しています。このプロトコルでは、無細胞腎臓足場を製造するために私たちの前に確立、最適な脱細胞化戦略の詳細な説明を提供しますスプラーグドーリーラットの腎臓7から。デュアル播種とメンテナンス灌流培養17が可能なカスタムデザインの灌流バイオリアクターを使用して、我々は一貫して、これらの脱細胞化マトリックス中の管状部品を再増殖増殖し、一週間以上のための灌流培養で生存したヒトRCTE細胞と無細胞腎臓足場を再細胞化。 17研究以前に細胞毒性のために使用される安価な、非細胞傷害性、および非侵襲性の代謝性評価- -時間7にわたって再細胞化腎臓内の細胞の生存度および増殖の指標を提供するために、我々はさらにレサズリン灌流アッセイの私たちの使用を示します。

<table><tbody><tr><td>試薬</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TRITON X-100, Proteomics Grade, AMRESCO</td><td>VWR</td><td>M143-4L</td><td></td></tr><tr><td>Sodium dodecyl sulfate solution, BioUltra, for molecular biology, 20% in H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>05030</td><td></td></tr><tr><td>過酢酸溶液, purum, ~ 39% in acetic acid (RT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>77240</td><td>過酢酸は可燃性で腐食性があります。適切な個人用保護具(手袋、ゴーグルなど)を使用して、ドラフト内で準備します。</td></tr><tr><td>200プルーフエタノール</td><td>VWR</td><td>V1001TP</td><td></td></tr><tr><td>シグマコート、ガラスおよびその他の表面用シリコーン化試薬</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>SL2</td><td>バイオリアクターリザーバーの処理用。本文ではシリコン化試薬と表記しています。</td></tr><tr><td>DMEM/F12 media</td><td>Life Technologies</td><td>11320-033</td><td></td></tr><tr><td>Corning cellgro Fetal Bovine Serum Premium, Mediatech</td><td>Corning</td><td>35-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン溶液, 100X 10,000 I.U. ペニシリン 10,000 & マイクロ;g/mL Streptomycin</td><td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express (1X), Phenol Red</td><td>Life Technologies</td><td>12605-028</td><td>本文では細胞解離酵素と呼ばれています。</td></tr><tr><td>トリパンブルーステイン (0.4%)</td> <td>ライフテクノロジー</td>ズ <td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>レサズリンナトリウム塩</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>R7017</td><td></td></tr><tr><td>機器:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S デジタルドライブ、600 RPM、115/230 VAC</td><td>コールパーマー</td><td>EW-07522-20</td><td></td></tr><tr><td>マスターフレックス L/S 07519-05 および -06 ポンプヘッド用大型カートリッジ。</td><td>コールパー</td><td>マーEW-07519-70</td>テキスト<td>では大型ポンプカートリッジと呼ばれています。</td></tr><tr><td>Masterflex L / S 8チャンネル、4ローラーカートリッジポンプヘッド。</td><td>コールパー</td><td>マーEW-07519-06</td><td></td></tr><tr><td>ストレート6インチ標本鉗子、鋸歯状</td><td>VWR</td><td>82027-438</td><td></td></tr><tr><td>*腎臓灌流バイオリアクターWilMad</td><td>Labglass</td><td>*カスタムデザイン</td><td>バイオリアクターは、WilMad Labglassで説明されているように製造されています。設計については、以前の資料で詳しく説明されています。</td></tr><tr><td>灌流回路コンポーネント</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>24 G x 0.75 インチBD Insyte AutoguardシールドIVカテーテル(0.7 mm x 19 mm)は、BD Vialon生体材料製です。針に切り込みが入っています。(50/sp、200/ca)</td><td>BD Biosciences</td><td>381412</td><td>テキストでは 24 ゲージ カテーテルと呼ばれています。</td></tr><tr><td>Masterflex PharMed BPTチューブ、L / S #14、25'Cole-Parmer</td><td></td> <td>HV-06508-14</td><td>本文では蠕動ポンプチューブと呼ばれています。</td></tr><tr><td>過酸化物硬化シリコーンチューブ、1/16" ID X 1/8" OD、25 ft/パック</td><td>Cole-Parmer</td><td>HV-06411-62</td><td>本文では 1/16" ID シリコーン ゴム チューブと呼ばれます。</td></tr><tr><td>Masterflexプラチナ硬化シリコーンチューブ、L / S 14、25フィート</td><td>コールパー</td><td>マーHV-96410-14</td><td>本文では厚肉の1/16インチIDシリコーンゴムチューブと呼ばれています。</td></tr><tr><td>VWRシリコーンチューブ、1/4 "ID x 0.5" OD</td><td>VWR</td><td>89068-484</td><td></td></tr><tr><td>Acro 50ベントフィルター、ポールライフサイエンス</td><td>VWR</td><td>28143-558</td><td>テキストでは0.2ミクロンベントフィルターと呼ばれています。</td></tr><tr><td>コールパーマールアーアダプター、オスルアーロック-1/8インチID、ナイロン、25個入り</td>コール<td>パー</td><td>マーT-45505-11</td>テキスト<td>では、1/8インチバーブアダプターへのオスルアーロックと呼ばれます。</td></tr><tr><td>コールパーマールアーアクセサリー、オスルアープラグ、ナイロン、25個入り</td><td>コールパー</td><td>マーEW-45505-58</td><td></td></tr><tr><td>メスルアー×メスルアーアダプター、ナイロン、25個入り</td><td>コールパー</td><td>マーEW-45502-22</td><td>本文ではメスルアー×メスルアーアダプターと呼ばれます。</td></tr><tr><td>Cole-Parmer ルアー アクセサリー、メス ルアー キャップ、ナイロン、25 個入り</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-45502-28</td><td></td></tr><tr><td>Smiths Medical ラージ ボア Hi-Flo ストップコック # MX4311L - 3 ウェイ Hi-Flo ストップコック、拡張オス ルアー ロック付き、非 DEHP 配合、ラテックスフリー (LF)、脂質耐性、非 PVD、50/cs</td><td>Careforde Healthcare</td><td>10254821</td><td>Smiths Medical (ベンダー) カタログ番号は #MX4311L です。</td></tr><tr><td>その他のコンポーネント</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 ml BD Luer-Lok使い捨てシリンジBD Luer-Lok&trade;チップ付き。</td><td>BD Biosciences</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>35 mm x 10 mm Easy Grip Culture Dish</td><td>BD Biosciences</td><td>353001</td><td>細胞の播種のために細胞懸濁液をシリンジに引き込むために使用されます。</td></tr></tbody></table>

上皮細胞の再増殖および腎組織の開発のための齧歯類細胞外マトリックスの足場の調製

Epithelial Cell Repopulation and Preparation of Rodent Extracellular Matrix Scaffolds for Renal Tissue Development

このプロトコルは、無細胞の生成を詳述、まだ臓器規模な組織開発のための小規模なモデル基質として有用である生体機能、腎細胞外マトリックス（ECM）足場。スプラーグドーリーラットの腎臓がインタクト無傷、全腎臓足場を導出するために26時間かけて腎動脈にカテーテルを挿入することによりカニューレを挿入し、低濃度の界面活性剤（トリトンX-100、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS））のシリーズで灌流されています灌流血管系、糸球体および尿細管。脱細胞化の後、腎足場は、カスタム設計された灌流バイオリアクター容器の内部に配置され、カテーテルは、腎動脈からなる灌流回路に接続されている：蠕動ポンプ。チューブ;そしてpH、溶存酸素、および圧力のためのオプションのプローブ。過酢酸、エタノール、及びpH（7.4）で平衡と足場を滅菌した後、腎臓足場はラーグ内の培地の灌流を介して、播種のために準備されます電子容量、37℃インキュベーターで維持し、5％CO 2。四十万人の腎皮質尿細管上皮（RCTE）細胞は、腎動脈を介して注入し、急速に生理的なレートに流れを減少させる前に、15分間、高流量（25 ml /分）と圧力（〜230 mmHgの）下足場に灌流されています（4 ml /分）。 RCTE細胞は、主に、腎皮質内の管状のECMニッチを移入増殖し、灌流培養の7日間で尿細管上皮構造を形成します。培養液中の44μMレサズリン溶液は細管形成の間の細胞の生存率および増殖の蛍光、レドックス系の代謝評価を提供するために、培地交換の際に1時間の腎臓を介して灌流されます。腎臓灌流バイオリアクターは、生化学的評価のための媒体の非侵襲的なサンプリングを可能にし、複数の入口ポートは、腎静脈または尿管を介して代替の逆行性播種を可能にします。これらのプロトコルは、腎臓での足場を再細胞化するために使用することができこのシステム内の迅速な評価のための血管内皮、尿細管上皮および間質線維芽細胞を含む、様々な細胞型、。

腎臓は、順次、水 ​​で灌流し、以前に確立された、最適な脱細胞化プロトコル（ 図1A、Bを参照してください）7、26時間かけて徐々に透明になるに従って洗剤溶液（1％トリトンX-100、0.1％SDS）を希釈し、として図2Aに示します。得られた無細胞腎臓足場は、細胞を欠いていると灌流プロトコルに従って破損していない無傷の腎被膜、でサポートされている粘着性腎ECMを保持します。最終的な洗剤灌流（SDS）、腎臓の血管網、特に葉間船により、顕著に（ネフロン細管の比較的薄い基底膜に対するこれらの血管の大きな厚さ​​のために、脱細胞化足場に表示されています図2A、B）を参照してください。臓器全体は糸球体、尿細管、およびCOLの無傷の基底膜のネットワークを残して、ネイティブの細胞のクリアされますダクト、皮質葉間動脈の内部と外部の弾性板を含む脱細胞化血管のECMをlecting（ 図2B、C参照）。より大きな血管に加えて、糸球体内の微小血管の基底膜は、（ 図2B、C参照</stro...

このプロトコルは、血管系を介した洗剤の順行性灌流によるSprague Dawleyラット腎臓の脱細胞化を説明しています。これにより、ヒト腎上皮細胞の再増殖のテンプレートとして機能する無細胞腎細胞外マトリックスが生成されます。再細胞化と成長をモニターするためのレサズリン灌流アッセイの使用は、特別に設計された灌流バイオリアクター内で行われます。

This protocol details the generation of acellular, yet biofunctional, renal extracellular matrix (ECM) scaffolds that are useful as small-scale model ...

この手順の全体的な目的は、非細胞化された三次元ラット腎臓細胞外マトリックススキャフォールドに、ヒト腎上皮細胞を再播種することである。まず、26時間にわたり腎動脈から一連の界面活性剤溶液を灌流させることで、ラットの腎臓を脱細胞化する。その後、腎臓を滅菌し、カスタム設計のバイオリアクターシステム内で連続的な順行性動脈灌流を行いながら、40 million個のヒト腎皮質尿細管上皮細胞（RCTE細胞）を非細胞化腎細胞外マトリックススキャフォールドに注入する。最終的に、RCTE細胞による腎臓スキャフォールドの再細胞化能は、ERおよび灌流アッセイ、ならびに免疫組織化学的解析によって評価できます。この3D細胞培養技術により、研究者は臓器全体の細胞外マトリックスを再細胞化することが可能です。スキャフォールド細胞は細胞外マトリックス内の尿細管周囲腔に配置され、細胞の増殖、分化、および成熟に影響を与える因子や結合因子の調査が可能となります。合成ポリマースキャフォールドの作製などの代替手法に対する本手法の主な利点は、腎臓の細胞外マトリックスが、天然の構造タンパク質、成長因子、およびその他の生物学的成分からなる複雑なネットワーク内で、灌流細胞の接着、増殖、および成熟を促進することである。各解凍済み腎臓の腎動脈カテーテルを、ポンプの下流にある灌流回路チューブの末端に接続し、カテーテル内に気泡が混入していないことを確認して、脱細胞化手順を開始する。カテーテル内に気泡がある場合は、200 µLのマイクロピペットを使用して気泡を吸い出し、カテーテルを液体で満たす。腎動脈が折れ曲がったり巻き付いたりしないように、空の5Lビーカーの内壁に腎臓を吊るし、ポンプの駆動速度を5 mL/minに調整します。次に、臓器の底部から溶液が滴下していることを確認して各腎臓への灌流を確認し、スタートボタンを押します。灌流後、フローチャートで指定された適切な溶液を用いて、脱細胞化された腎臓を50 mLコニカルチューブ内のPBSに入れ、4°Cで最大2週間保存します。灌流回路を組み立てた後、バイオリアクターヘッドの赤いスクリューキャップを取り外し、開口部から0.1%過酢酸および4%エタノール溶液を50 mL、培地リザーバーにピペットで加えます。大型ポンプカートリッジを使用し、ペリスタルティックポンプのチューブセグメントをポンプヘッドに接続します。次に、流量を5 mL/minに調整します。スタートボタンを押し、液体がプロフュージョンラインを満たして三方活栓の残りのオープンポートに到達するまで、回路のプライミングを行います。オス型のルアープラグを使用してポートを塞ぎます。灌流回路のチューブ内またはインレット内部に気泡が見えなくなるまで、回路を完全にプライミングしてください。ルアーアクセプターを用い、ポンプの流速を一時的に上げることで、灌流回路から気泡を排出させます。システムのプライミングが完全に完了したら、ポンプドライブを停止させ、6インチフォースプスを滅菌します。腎動脈カテーテルのメス側ルアー端を、バイオリアクターヘッド内表面にあるオス側ルアー受入口に注意深く接続し、接続部が密閉され、カテーテル内に空気が残っていないことを確認します。腎動脈がねじれたり折れ曲がったりしないよう、腎臓を腎動脈カテーテルから静かに吊り下げます。次に、バイオリアクターのリザーバーがしっかりと密閉されるように、ヘッドと本体を固定している金属製クランプを締め、スクリューキャップを閉めます。ここで、過酢酸エタノール溶液を毎分5 mLの速度で室温灌流させ、腎臓を滅菌します。1時間後、ポンプを停止し、赤色のスクリューキャップを開けます。滅菌済みのペストを使用して、ピペットでバイオリアクターのリザーバーから溶液をすべて慎重に吸引します。次に、50 millilitersの新鮮なPBSをバイオリアクターのリザーバーにピペットで加えます。スクリューキャップを閉め、室温にて5 milliliters per minuteの流速で、1時間の灌流を3回連続して行います。最後のPBSによる洗浄後、リザーバーから生理食塩水を吸引し、スクリューキャップを閉めた状態でリザーバーに50 millilitersの培地を加えます。灌流回路が接続されたバイオリアクターを、37 degrees Celsius、5%carbon dioxideに設定された大容量インキュベーターに移します。その後、バイオリアクターの灌流回路をポンプに接続し、播種前に少なくとも1時間、4 milliliters per minuteの速度で腎臓に灌流を行います。細胞播種を行うために、目的の播種濃度に合わせて十分な数の培養フラスコを準備します。次に、各フラスコから培地を吸引し、37 °Cで10 mLの適切な細胞解離酵素を用いて、フラスコから腎皮質尿細管上皮細胞を剥離させます。10分後、位相差顕微鏡で2分ごとにフラスコを確認し、細胞の剥離が観察されるまで続けます。次に、細胞数計測用に少量の分注液を採取した後、対応する細胞懸濁液を同量のpremed培地で希釈し、遠心分離を行います。ペレットを適切な量の培養培地で再懸濁し、最終濃度を2 × 10⁷ cells/mLにします。播種用懸濁液2 mLを35 mm培養皿に移し、その後、その2 mLの液量を滅菌済みの5 mLシリンジで吸引します。灌流バイオリアクターを生物安全キャビネットに移し、ストップコックバルブを回してシーティングポートへの流れを遮断します。ストップコックからオスルアースリッププラグを取り外し、シリンジを接続します。その後、速やかに灌流回路をインキュベーターに戻し、大型ポンプカートリッジを使用してペリスタルティックポンプチューブセグメントをポンプヘッドに固定し、細胞をシーティングさせます。ポンプに向かうストップコックバルブのポートを閉じ、細胞を腎臓スキャフォールドにゆっくりと注入します。次に、ストップコックバルブを回してシリンジからの流れを遮断し、ポンプを 25 milliliters per minute で作動させます。15分後、ポンプの流量を 4 milliliters per minute に下げ、翌日およびその後2日ごとに培地を交換します。細胞の生存率および増殖を評価するために、培養液を10 mLのzarin作動液に無菌的に交換し、腎臓スキャフォールドを4 mL/minで灌流させます。正確に1時間後、コンディショニングされ一部が還元されたzarin溶液を回収し、再度4 mL/minで灌流を行います。100 mLの新鮮な培養液を用い、水および希釈界面活性剤溶液で順次灌流した腎臓は、26時間にわたって徐々に透明になります。最終的な界面活性剤灌流までに、脱細胞化スキャフォールド内の腎臓血管ネットワーク、特に葉間血管が顕著に現れます。臓器全体から固有の細胞が除去され、糸球体、尿細管、集合管の無傷な基底膜ネットワークと、脱細胞化された血管の細胞外マトリックスが残ります。大きな血管に加えて、糸球体内の微小血管基底膜もその構造的完全性を維持しています。先ほど示したように腎臓スキャフォールドに播種されたRCTE細胞は、主に腎臓スキャフォールドの皮質領域に定着し、優先的に糸球体周囲尿細管に再集積します。播種後1日目には、糸球体内に埋め込まれる細胞はほとんどなく、7日目までには、これらの細胞の大部分が腎外細胞マトリックスの皮質領域を占める一方で、糸球体内には細胞がほとんど存在しなくなります。7日間の順行性灌流培養の後、RCTE細胞の再定着と1週間の灌流培養を経て、外髄質および乳頭管、および集合管に多くのRCTE株の尿細管が存在します。しかし、脱細胞化後に観察された透明性は失われ、再細胞化された腎臓は不透明になり、天然の状態に近い外見になります。この手順の後、条件化培養液の免疫化学的分析などの他の手法を用いて、腎臓細胞外マトリックス内でこれらの細胞の代謝状態や表現型がどのように変化するかといった、さらなる疑問に対する検証を行うことができます。細胞外スキャフォールドを構築し、ドナー細胞をマトリックスに再添加できることで、研究者は天然の腎臓細胞外マトリックススキャフォールド内において、3次元的な成長と成熟を記述することが可能になります。最終的な目標は、この技術をツールとして活用し、腎臓の修復および再生のメカニズムをより深く理解することです。

epithelial-cell-repopulation-preparation-rodent-extracellular-matrix

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