上皮細胞の再増殖および腎組織の開発のための齧歯類細胞外マトリックスの足場の調製

この手順の全体的な目標は、Acellular 3 次元げっ歯類の腎臓細胞外マトリックス足場にヒト腎上皮細胞を再増殖させることです。これは、最初に、サンザメの腎臓を脱細胞化し、一連の洗剤溶液を腎動脈に26時間かけて灌流することによって達成されます。次に、腎臓を滅菌し、非細胞性腎細胞外マトリックス足場に、カスタム設計のBioreリアクターシステム内で連続的な順行性動脈灌流下で4,000万個のヒト腎皮質尿細管上皮またはRCTE細胞を注入します。

最終的に、RCTE細胞が腎臓足場に再増殖する能力は、ERおよび灌流アッセイおよび免疫組織化学分析によって評価できます。この3D細胞培養技術により、研究者は臓器全体の細胞外マトリックスを再増殖させることができます。足場細胞は、細胞外マトリックス内の尿細管周囲腔内に沈着し、細胞の成長、分化、成熟に影響を与える因子の調査と結合を可能にします。

合成ポリマー足場の作製のような代替方法に対するこの技術の主な利点は、腎臓の細胞外マトリックスが、天然の構造タンパク質、成長因子、その他の生物学的成分の複雑なネットワーク内で灌流された細胞の接着、増殖、成熟を促進することです。脱細胞化手順を開始するには、解凍した各腎臓の腎動脈カテーテルをポンプの下流にある灌流回路チューブの端に接続し、カテーテルに気泡が閉じ込められないようにします。カテーテルに気泡がある場合は、200マイクロリットルのマイクロピペットを使用して気泡を引き出し、カテーテルに液体を充填します。

腎臓動脈がねじれたりコイル状になったりしないように、空の5リットルビーカーの内壁に沿って腎臓を吊り下げ、ポンプ駆動を毎分5ミリリットルに調整します。次に、臓器の底部から溶液が滴下されるのを観察し、各腎臓にフローチャートで指定された適切な溶液を注入して各腎臓が灌流していることを確認した後、スタートを押します。灌流の最後には、脱細胞化した腎臓をPBSにPBSに格納します摂氏4度または最大2度。灌流回路を組み立てた後、バイオリアクターヘッドの赤いスクリューキャップを取り外し、0.1%あたり酢酸、4%エタノール溶液の50ミリリットルを開口部から培地リザーバーにピペットで送ります。

大型のポンプカートリッジを使用して、蠕動ポンプチューブセグメントをポンプヘッドに接続します。次に、流量を毎分5ミリリットルに調整します。スタートを押して、液体がプロフュージョンラインを満たし、3方向ストップコックの残りのオープンポートに到達したときに回路がプライミングされるのを待ちます。

オスのルアープラグを使用してポートを差し込みます。灌流回路のチューブまたは入口の内側に空気が観察されなくなるまで、回路を完全にプライミングします。ルアーアクセプターは、ポンプの流量を一時的に増加させることにより、灌流回路から気泡を排出します。

システムが完全にプライミングされたら、ポンプドライブを停止し、6インチの鉗子を滅菌します。腎動脈カテーテルのメスルアーエンドをオスインレットに慎重に差し込むには、バイオリアクターヘッドの内面にルアーアクセプターを差し込み、接続がしっかりとし、カテーテルに空気が残っていないことを確認します。腎臓がねじれたりねじれたりしないように、腎臓を腎動脈カテーテルからそっとぶら下げます。

次に、バイオリアクターのヘッドと本体を固定している金属製のクランプを締めて、バイオリアクターのリザーバーがしっかりと密閉されるようにし、スクリューキャップを閉じます。次に、酢酸エタノール溶液を室温で灌流し、毎分5ミリリットルで腎臓を滅菌します。1時間後、ポンプを停止し、赤いスクリューキャップを開けます。

滅菌害虫を使用して、ピペットはバイオリアクターリザーバーからすべての溶液を慎重に吸引します。次に、50ミリリットルの新鮮なPBSをバイオリアクターリザーバーにピペットで入れます。スクリューキャップを閉じ、ポンプを室温で毎分5ミリリットルで1時間連続3回連続して始動します。

最終的なPBSすすぎ後、リザーバーから生理食塩水を吸引し、スクリューキャップを閉じた状態でリザーバーに50ミリリットルの培地を追加します。灌流回路が取り付けられたバイオリアクターを、摂氏37度、二酸化炭素5%の大容量インキュベーターに移します。次に、バイオリアクター灌流回路をポンプに接続し、播種前に少なくとも1時間、毎分4ミリリットルで腎臓を灌流します。

細胞化するために、腎臓は所望の着座濃度に十分な数の培養フラスコを収集します。次に、各フラスコから培地を吸引した後、10ミリリットルの適切な細胞解離酵素を使用して、腎皮質尿細管上皮細胞をフラスコから摂氏37度で持ち上げます。10分後、折り目の剥離が観察されるまで、2分ごとにフェイスコントラスト顕微鏡でフラスコのチェックを開始します。

次に、カウントのために細胞の少量アリコートを取った後、関連細胞懸濁液を等量の既製培地で希釈し、細胞を遠心分離します。ペレットを適量の培地で懸濁し、1ミリリットルあたり10〜7番目の細胞の2倍の最終濃度を得る。2ミリリットルの着座懸濁液、35ミリメートルの培養皿に移し、次に2ミリリットルの容量を滅菌5ミリリットルの注射器に引き込みます。

灌流バイオリアクターを生物学的安全キャビネットに移し、ストップコックバルブを回して着座ポートへの流れを閉じます。オスのルアースリップを取り外し、ストップコックからプラグを差し込んでシリンジを接続します。次に、灌流回路をインキュベーターに素早く戻し、大型のポンプカートリッジを使用して蠕動ポンプチューブセグメントをポンプヘッドに固定し、細胞を固定します。

ストップコックバルブポートをポンプに向けて閉じ、細胞を腎臓の足場にゆっくりと注入します。次に、ストップコックバルブを回してシリンジからの流れを閉じ、毎分25ミリリットルでポンプを始動します。15分後、ポンプの流量を毎分4ミリリットルに下げ、翌日とその後2日ごとに媒体を交換します。

細胞の生存率と増殖を評価するには、培養培地を10ミリリットルのザリン作業溶液と無菌的に交換し、ちょうど1時間後に腎臓足場の毎分4ミリリットルの灌流を行い、条件付けされ部分的に還元されたザリン溶液を回収し、さらに毎分4ミリリットルの灌流を行います。100ミリリットルの新鮮な培養物を用いて、水と希薄な洗剤溶液を順次大量に投入した中腎臓は、最終的な洗剤灌流によって26時間にわたって徐々に透明になり、腎臓の血管網、特に葉間血管は脱細胞化した足場に目立つように表示されます。臓器全体から天然細胞が除去され、糸球体細管と収集管の無傷の基底膜ネットワークと脱細胞化血管の細胞外マトリックスが残ります。

より大きな血管に加えて、糸球体内の微小血管基底膜もその構造的完全性を保持しています。ちょうど示されたように、腎臓足場に播種されたRCTE細胞は、主に腎臓足場の皮質領域に生息し、そこで彼らはペレグ糸球体尿細管に優先的に再増殖します。播種後1日目に糸球体内に埋め込まれる細胞はほとんどなく、7日目までに糸球体には細胞がほとんどなくなっていますが、これらの細胞の大部分は腎臓の細胞外マトリックスの皮質領域を占めています。

7日間の順行性灌流培養の後、多くのRCTE系統の尿細管が外側の髄質および乳頭細管に存在し、RCTE細胞の再増殖と1週間の灌流培養後にアヒルを収集します。しかし、脱細胞化後に観察される透明性は失われ、化した腎臓は不透明で、その自然な状態に近い外観に見えます。この手順に続いて、コンディショニング培養培地の免疫化学分析などの他の方法を実行して、これらの細胞の代謝状態または表現型の状態が腎臓細胞外マトリックス内でどのように変化するかなどの追加の質問に答えることができますか?

細胞外スキャフォールドを開発し、ドナーの売上をマトリックスに戻すことができるため、研究者は天然の腎臓exoマトリックススキャフォールド内で成長と成熟を3次元で描写することができます。最終的な目標は、この技術をツールとして使用して、腎臓の修復と再生のメカニズムをよりよく理解することです。