バイオメディカル応用のための機械的に調整可能な生物活性金属スキャフォールドの作製

本手順の全般的な目的は、生物医学的な応用のための、機械的な調整が可能で生物活性を持つ金属スキャフォールドを作製することです。この手法は、薬物放出が可能な機械的調整可能金属スキャフォールドの実現可能性など、整形外科的インプラント分野における重要な課題への回答に寄与します。この手法は、制御パラメータが1つのみであるため、簡便に実施できます。

これらのパラメータにより、機械的特性の向上と持続的な薬剤放出の両方が達成され、機能的な多孔質構造の作製が可能となります。まず、4種類の初期気孔率を持つ多孔質チタン・スキャホールド用として、適切な量のチタン粉末、カフェイン、およびKD 4を500 mLのポリエチレンボトルに混合します。ボトルをボールミル機に入れ、55 °C、30 RPMの速度で30分間回転させます。その後、ポリエチレンボトルからスラリーを、直径および高さが60 mmの円筒形アルミニウム型に注ぎ入れます。

各アルミ型をアルミカバーガラスで密封した後、ボールミルオーブンを用いて 55 °C、30 RPM の速度で 10 分間回転させます。続いて、ボールミルオーブンの温度を 44 °C に下げ、44 °C、30 RPM の速度で 12 時間連続して型を回転させます。室温で 1 時間回転させて型を冷却した後、ボールミルオーブンから取り出します。

次に、アルミニウム製プランジャーを用いて、各アルミニウム型から凝固したチタン・カフェイングリーンボディを取り出します。その後、凝固したチタン・カフェイングリーンボディをゴム袋に入れ、紐で縛って袋を完全に密封します。

ゴムバッグを冷間等方圧加圧機の水槽に入れ、200 megapascalsの等方圧を10分間印加します。ゴムバッグを装置から取り出した後、圧縮されたグリーンボディをゴムバッグから取り出します。チタン・カフェイン・グリーンボディをアルミナるつぼに移します。

るつぼを凍結乾燥機に入れ、-40 °Cで24時間凍結乾燥させ、カフェイン相を昇華させます。凍結乾燥後、るつぼをIllumina製カバーガラスで密閉します。密閉したるつぼを室温の真空炉内に設置します。

次に、昇温速度を毎分5 °Cとして、炉の温度を1300 °Cまで上昇させます。風乾させたグリーンボディ（成形体）試料は通常強度が低く、崩れる可能性があるため、取り扱いには十分注意してください。

温度を1300 °Cで2時間保持した後、炉内の中央に配置した多孔質チタンを、炉が室温まで完全に冷却するまで6〜7時間保持します。サンプルを炉から取り出した後、より小さな試験片にするためにサンプルを機械加工し、ガラスビーカーに移します。ビーカーをオートクレーブに入れ、121 °Cで15分間、サンプルを滅菌します。

完了後、滅菌済みサンプルを蒸留水で2回、次いで70% ethanolで2回洗浄します。その後、多孔質チタンをペトリ皿に入れ、UVライト照射下、室温でサンプルを風乾させます。この時点で、1 mLの緑色蛍光タンパク質（GFP）に9 mLのECCOsリン酸緩衝生理食塩水（PBS）を混ぜ、GFPを100 µg/mLに希釈します。50 mLの滅菌済みポリスチレンチューブ内で、多孔質チタンを希釈したGFP溶液に浸し、室温で静置します。

その後、すぐにサンプルを真空デシケーターに入れ、10分間排気します。GFP溶液が多孔質チタンの細孔により効果的に浸透するように、デシケーターからガラスビーカーを取り出します。次に、ピンセットを用いてガラスビーカーから多孔質チタンを取り出します。

GFPをコーティングした多孔質チタンを直径10cmのペトリ皿に入れ、クリーンベンチ内で室温にて一晩風乾させる。翌日、ガラスビーカー内で多孔質チタンを10mLのECCOsリン酸緩衝生理食塩水で2回洗浄する。その後、ピンセットを用いて多孔質チタンを直径10cmのペトリ皿に移し、クリーンベンチ内で室温にて一晩風乾させる。次に、高さの異なるGFPコーティング多孔質チタン試料を円筒形のスチールダイに入れ、スチールダイの上下の穴にパンチセットを挿入する。

室温にて、試料のZ方向に向かって、鋼製ダイアセンブリ内で多孔質チタンを圧縮します。プレス機を用い、あらかじめ設定した適用ひずみに対し、0.05から0.1 s⁻¹の中間ひずみ速度で圧縮を行います。圧力を1分間保持します。

プレス機から金型を取り出します。金型本体の底部にスチールリングを配置し、金型をプレス機に戻します。金型を反転させた後、プランジャーが緻密化された試料をDボアから押し出すまでゆっくりと圧力をかけ、プレス機から金型を取り除きます。

高密度化したチタン試料をスチールダイから取り出します。最後に、高密度化した試料をビーカー内でECCOsリン酸緩衝生理食塩水10 millilitersを用いて2回洗浄し、クリーンベンチ内で室温にて一晩自然乾燥させます。従来のフリーズキャスティングによるチタンの細孔構造は、カフェインのデンドライト成長のため、不規則な形状の細孔を伴う方向性のある細孔配向を示します。

ダイナミック凍結鋳造による試料の凍結過程では、ほぼ球形の気孔がランダムに分布して現れますが、緻密化が進むにつれて気孔の形状は扁平になり、最も高い緻密化レベルでは隣接する気孔同士が接触するため、気孔はほぼ消失します。気孔率の異なる4つの試験片は、緻密化前の初期高さは異なりますが、緻密化後の高さはほぼ同一となります。凹み構造を持つ試料および多孔質チタンのいずれにおいても、GFPの放出速度が速く、1週間以内に大部分が放出されるという初期バースト効果が認められました。

高密度化された多孔質チタンは1ヶ月にわたって継続的な放出を示し、1ヶ月後でも表面にGFPが明確に認められました。コア部分の密度を高めたスキャフォールドについては、機械加工によって外側部分を短縮しました。内部の高い部分を選択的に高密度化した後のマイクロCT画像では、異なる気孔率を持つスキャフォールドの内側部分と外側部分が示されています。外側を高く、内側を低くした多孔質チタンを高密度化すると、外側部分の気孔率が低下して外側が高密度になりますが、内側部分は初期の気孔率が維持されます。

適切に開発・実施されれば、この手法は72時間以内に完了させることが可能です。本手法は、生体材料分野の研究者が、機械的特性を制御し、脊髄損傷治療のための薬物放出能を備えたメタマテリアルの作製可能性を追求する道を開きました。作製されたスキャフォールドが薬物送達機能を備えた人工椎間板置換物として機能するため、本手法の意義は脊髄損傷治療へと展開されます。