Name: 失活ヒト真皮を用いて遺伝子組換え器官皮膚培養物の生成 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: 学ぶ 遺伝子組換え器官皮膚培養法。失活ヒト真皮と表皮角化細胞を用いて、遺伝子発現変化が表皮成長と分化に与える影響を解明する。数日で臨床的に関連性の高いヒト皮膚モデルを生成可能。

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この作品は、米国癌協会の研究学者グラント（RSG-12-148-01-DDC）とCIRM基本生物学賞（RB4-05779）supportedbyました。

ヒトの皮膚のプロトコールは、カリフォルニア大学サンディ​​エゴ校の研究倫理委員会のガイドラインに従って行いました。ヒトの皮膚は、廃棄された外科的サンプルから得られたか（スキンバンクは材料/機器表に記載されている）は、皮膚の銀行から購入することができます。皮膚が由来されている場所やドナーの年齢は限り真皮における基底膜領域タンパク質（コラーゲン/ラミニン）が分解されないように、実験には重要ではありません。 失活ヒト真皮の調製<ol><li>ヒトの皮膚を受信すると、（〜3-5分）を解凍し、組織培養フード内で組織を置きます。皮膚のサイズに応じて、滅菌使い捨て50mlコニカルチューブまたは125ミリリットル瓶で解凍組織を配置します。皮膚バンクからの皮膚の一般的なサイズは、0.75平方フィートです。 </li><li> 1×PBSで4倍のペニシリンおよびストレプトマイシン（ペニシリン/ストレプトマイシン）で、75％の完全な容器を満たします。激しく振ります5分とは、液体の処分。このステップを3回繰り返します。 </li><li>最後の洗浄後、新しいチューブ/ボトルに組織を転送し、コンテナの75％を埋めるために、新鮮な4倍ペニシリン/ストレプトマイシン/ PBSを追加します。表皮と真皮の分離を可能にするために2週間、37℃の組織培養インキュベーター中でこの混合物をインキュベートします。 </li><li>無菌条件下で、真皮から表皮を剥がすために鉗子を使用しています。表皮は、ドナー（ 図1A）のレースに応じてカラーリングを持つことになりますしながら、真皮は完全に白です。ヒト組織に対処するための金融機関のプロトコルに従って表皮を廃棄します。 </li><li>チューブや瓶の中に真皮を置き、（4回5分間の洗浄）激しく振盪しながら1×PBSで希釈した4倍ペニシリン/ストレプトマイシンでそれを洗います。最後の洗浄後、使用する準備ができるまで4℃で4倍ペン/ 1×PBSで希釈した連鎖球菌およびストアに新しいチューブ/ボトルに真皮を転送します。真皮は今年まで4℃で保存することができます。 </li></オール&gt; 2.遺伝的に変更初代ヒトケラチノサイト注：初代ヒトケラチノサイトに感染するウイルスを生成するために、完全DMEM培地[DMEM + 10％ウシ胎児血清（FBS）+ペニシリン/ストレプトマイシン]中で増殖させた使用アンホトロピックフェニックス細胞。このようなGAG-pol及びエンベロープのようなタンパク質をコードするウイルスパッケージング遺伝子を安定的に、レトロウイルスベクターでトランスフェクトされた場合、ウイルス産生を可能にするフェニックス細胞ゲノムに組み込まれています。フェニックス細胞は、高いウイルス力価の産生を可能にする、高効率でトランスフェクトすることができます。この包装ラインから産生されたウイルスは、ヒトを含む哺乳類細胞の多種多様に感染することができます。 <ol><li> 1日目：トランスフェクションの前日、完全DMEM培地でも80万個の細胞の密度で6ウェルプレートでシードフェニックス細胞。 </li><li> 2日目：トランスフェクションの日には、ウェル当たりレトロウイルスベクターの3μgのを使用しています。アリコート1.5mlチューブへのレトロウイルスベクターの3μgの。 100μのミックスを使用します;リットルのDMEMを加えたベクトルのすべての3μgのためのトランスフェクション試薬の6μlの。 1.5mlチューブ中の100μlのDMEMでトランスフェクション試薬の6μLを混ぜます。 （使用されているレトロウイルスベクターは、装置/材料の表に記載されています）。 <ol><li> 5分間インキュベートし、レトロウイルスベクターの3μgのを含む事前に小分けチューブに106μlの混合物を追加します。混合し、室温で30分間インキュベートします。フェニックス細胞の各ウェルに、この混合物全体を滴下して加えます。 </li></ol></li><li> 3日目：トランスフェクションの翌日、フェニックス細胞から培地を除去し、新鮮な完全DMEM培地2mlのを追加。同じ日に、ウェルあたり75,000細胞の密度で6ウェルプレートに初代ヒトケラチノサイトをシード。抗生物質（ペニシリン/ストレプトマイシン）でケラチノサイト無血清培地（KCSFM）でケラチノサイトを維持します。 注：一次ヒトケラチノサイトを購入しました。細胞は、（材料/機器表に記載されている）、さまざまなベンダーから購入することができます。 </li><li> 4日目：ハー今ウイルス粒子を含む、トランスフェクトされたフェニックス細胞から培地を権利が確定します。注射器を用いて0.45μmのフィルターを通してメディアを渡します（任意の汚染フェニックス細胞を除去するため）、ケラチノサイトに2ミリリットルを配置（前日/ウェル75,000細胞で播種：ステップ2.3を参照してください）​​。感染過程を媒介するために役立つ培地にヘキサジメトリンブロミド（5μg/ ml）を加えます。ウイルス力価は、約1×10 7 TU / mlです。 <ol><li> RTで1時間、200×gで遠心分離で6ウェルプレートをスピン。スピンした後、ウイル​​スを含む培地を除去し、KCSFMを追加する前に、1×PBSで細胞を1回洗浄します。 </li></ol></li><li> 5日目：ステップ2.4​​のように再びケラチノサイトの同じバッチに感染します。 注：レトロウイルスベクターの選択マーカーがある場合、薬物を使用して、ケラチノサイトを選択して、下流の分析や、器官培養などのアプリケーションで使用するために展開します。 </li></ol> 3.器官皮膚の文化を設定します<ol><li>ビルド一般的な実験で見つかった物質またはカセットから器官カセットは、カスタム金属加工工場（ - F図2A）を介して行うことができます。 3.5センチメートル組織培養プレートからこれらのカセットを作るために3.5センチの皿（ 図2A-B）の蓋の中心から1.0センチメートルX 1.0センチメートルの正方形を削除するには、焼灼を使用しています。無菌条件下でこれを行います。 <ol><li>明確なマニキュア（ 図2C）を使用して、カセット（3.5センチの皿の蓋）の底部に正方形のペグを取り付けます。マニキュアのための5分を乾燥し、それが正方形のペグ（ 図2D）に載っているように、カセットを裏返しすることができます。 6cm皿にカセットを置きます。 注：スクエアペグは、芸術品や工芸品店の様々なから購入することができます。 </li></ol></li><li> 10％FBS、2.67 / mlのアデニン、40 N、ストレプトマイシン100μg/ mlの、66％DMEM、22％ハムF12、100単位/ mlのペニシリンからなるケラチノサイト増殖培地（KGM）を準備しますグラム/ mlのヒドロコルチゾン、10 ngの/ mlのコレラ毒素、4.94 / mlのインスリン、5μg/ mlのトランスフェリン、1.36 ngの/ mlのトリヨード - L - チロニン、10 ngの/ mlのEGF、および10μg/ mlのシプロフロキサシン塩酸塩。使用する準備ができるまで4℃で0.22μmフィルターとストアを介してメディアをフィルタリングします。 </li><li> 4倍ペニシリン/ストレプトマイシン+ PBS溶液から真皮を取り、KGMで2回洗浄した後、使用前に2日間37℃でKGMでインキュベートします。 </li><li> 1.5センチメートルX 1.5センチメートルサイズの部分にメスを用いて真皮をカットして、器官カセットの上に置きます。上を向いて真皮の上部と真皮を置きます。真皮の上部には、ケラチノサイト（ 図1B）と接触する側になります。 </li><li> （ 図3A）を上に向け、真皮の上部側と器官カセットの角穴にプレカット真皮を置きます。 </li><li>鉗子を使用しての上に真皮を含む全体の器官カセットをフリップ（図3B）。氷上で細胞外マトリックス溶液を解凍します。カセットあたりの細胞外マトリックス溶液100μlを引き出すために、針と注射器を使用してください。真皮（光沢のある側）の底部に5滴を追加し、真皮（ 図3B）全体に均一な分布を確実にするために、わずかに振ります。 </li><li>商業細胞外マトリックス溶液で5分間は完全に（ 図3C）を固化することを許可します。固化した後、バックの上にカセットを反転するために鉗子を使用しています。 6cmディッシュにKGMの4ミリリットルを追加します。 </li><li>真皮（ 図3D）を含む器官カセット上に0.5から1000000遺伝子改変されたケラチノサイトを置きます。 <ol><li>トリプシン処理を、5分間、10cmのプレートに0.05％の4 mlのトリプシンを配置することにより、ケラチノサイトおよび完全DMEM培地4mlでクエンチしました。 </li><li>血球計数器を使用して、ケラチノサイトをカウントし、その後5分間200×gでスピンダウン。 90μで（利用可能なセルの数に応じて）0.5から1000000細胞を再懸濁しKGMのLと真皮にすべてのセルを配置します。 注：再生表皮の厚さに差が見られる任意の細胞数の開始の違いによるものではないことを保証するために、同じ実験内の真皮に同数の細胞を配置することが重要です。真皮に0.5未満万個の細胞を配置すると、貧しい階層と差別につながることができます。 </li></ol></li><li>一日おきに器官培養にKGMメディアを変更します。収穫組織真皮のケラチノサイトの配置後1-14日。表皮の完全な層化と分化は、通常は5日後に発生します。 </li></ol>

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開示するものは何もありません。

ヒト皮膚器官培養における遺伝子操作は、一般的に、2D培養細胞だけでなく、マウスモデルを研究するために多くの利点を提供します。 2D培養物は、無傷の組織および器官に見出される三次元の細胞 - 細胞および細胞 - 細胞外マトリックス相互作用を欠いています。最近の研究では、一次ヒト皮膚腫瘍16にはるかに遺伝子発現の類似性を示す3次元培養細胞を用いた2次元および3次元培養皮膚癌細胞との間の多大な違いを発見しました。ヒトの皮膚器官培養物はまた、マウスモデルを超えるいくつかの利点を有します。マウスモデルは、同様に、ヒトおよびマウスの皮膚との間のいくつかの顕著な違いを生成するために時間がかかり、高価です。これらは、異なる組織代謝回転速度、ならびにマウスおよびヒトの表皮8の間に、表皮の厚さがあります。このようなCRISPR-CAS等の新興新技術で、特定の遺伝子は、器官、皮膚culturを用いてヒトの皮膚病をモデル化するために変異さ/変更することができますエス23。さらに、遺伝子は、納入またはここに記載のレトロウイルス遺伝子導入に加えて多種多様な方法を介して、これらの細胞中でノックダウンす...

ヒト表皮基底膜zone.Theの表皮として知られている細胞外マトリックスは、水分の損失を防ぐために、不浸透性の障壁としてだけでなく、保護するための最初の防衛線として機能するだけでなく、を介して基礎となる真皮に接続重層上皮であります外国と有害物質1から体。表皮の最も深い層である基底層は、表皮2の残りの部分を形成する分化した子孫を生じさせる上皮幹細胞および前駆細胞が含まれています。上皮前駆細胞が分化するように、それらは有棘層3として知られている分化した細胞の第1の層を形成するために上方に移動します。棘層では、細胞は、その後、表皮の分化した層のための物理的ストレスに耐える強度を提供する、ケラチン1および10の発現をオンにします。有棘層細胞は、さらに分化するように、それらはのために、表皮中で上方に移動ケラトヒアリンおよびラメラ顆粒の形成と同様に、原形質膜の下に組み立てられている構造タンパク質によって特徴付けられる顆粒層をメートル。細胞は、分化過程に進むように、ラメラ顆粒が細胞から押し出されているが、原形質膜の下のタンパク質は、クロス脂質豊富な障壁を形成するように互いに連結された角質層4と呼ばれます 。 上皮細胞の増殖および分化への影響の変化を伴う疾患人口の5〜20％。したがって、このプロセスのメカニズムを理解することは非常に重要です。これらの疾患の多くの症状は、細胞-細胞または細胞-マトリックス接触時に偶発的であることから、ヒトの表皮は、3D環境で再構成された器官培養物は、6月10日に作成されています。これらの方法は、典型的には、失活ヒトなどの細胞外マトリックス上に播種し、一次または形質転換ケラチノサイトの使用を含みます真皮、マトリゲル、またはコラーゲン。 上皮細胞の増殖および分化において重要な遺伝子調節機構を理解するために、ケラチノサイトを遺伝的に、2D培養での遺伝子ノックダウンまたは過剰発現するようにレトロウイルスベクターを介して操作され、その後、3次元で再構成することができます。これらの方法は、新生物11-21に表皮幹細胞および前駆細胞の自己再生および分化ならびに進行に関与する遺伝子を特徴づけるために広く使用されています。ここでは、レトロウイルスの使用を介して表皮器官培養物中の遺伝子発現を変化させる方法についての詳細なプロトコルが提供されます。

<table><tbody><tr><td>ヒトの皮膚</td><td>ニューヨークの消防士 スキンバンク</td><td><a href="http://www.cornellsurgery.org/pro/services/burn-surgery/skin-bank.html">http://www.cornellsurgery.org/pro/services/burn-surgery/skin-bank.html</a></td><td></td></tr><tr><td>PEN/STREP</td><td>GIBCO</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>両親媒性フェニックス細胞株</td><td>ATCC</td><td>CRL-3213</td><td></td></tr><tr><td>FUGENE 6 トランスフェクション試薬</td><td>Promega</td><td>E2691</td><td></td></tr><tr><td>Keratinocyte Media (KCSFM)</td><td>Life Technologies</td><td>17005042</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO</td><td>11995</td><td></td></tr><tr><td>Ham's F12</td><td>Cambrex</td><td>12-615F</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>GIBCO</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>Adenine</td><td>Sigma</td><td>A-9795</td><td></td></tr><tr><td>Cholera Toxin Sigma</td><td></td><td>&nbsp;C-8052</td><td></td></tr><tr><td>ヒドロコルチゾン</td><td>Calbiochem</td><td>3896</td><td></td></tr><tr><td>インスリン</td><td>Sigma</td><td>I-1882</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Invitrogen</td><td>13247-051</td><td></td></tr><tr><td>トランスフェリン&nbsp;</td><td>シグマ</td><td>T-0665</td><td></td></tr><tr><td>シプロフロキサシン塩酸塩</td><td>血清学</td><td>89-001-1</td><td></td></tr><tr><td>焼灼</td><td>Bovie医療株式会社</td><td>AA01</td><td></td></tr>マ<tr><td>トリゲル</td><td>コーニング</td><td>354234</td><td></td></tr><tr><td>ケラチン1抗体</td><td>Biolegend</td><td>PRB-149P</td><td></td></tr><tr><td>四角い釘美術</td><td>工芸品店</td><td></td><td></td></tr><tr><td>人間新生児ケラチノサイト</td><td>ATCC</td><td>PCS-200-010</td><td></td></tr><tr><td>ヒト新生児ケラチノサイト</td><td>細胞アプリケーション</td><td>102K-05n</td><td></td></tr><tr><td>MSCV レトロウイルス ベクター</td><td>Clontech</td><td>634401</td><td></td></tr><tr><td>LZRS レトロウイルス ベクター</td><td>Addgene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pSuper.Retro.Puro レトロウイルス ベクター</td><td>Oligoengine</td><td>VEC-PRT-0002&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>臭化ヘキサジメトリン&nbsp;</td><td>シグマ</td><td>H9268-5G</td><td></td></tr></tbody></table>

失活ヒト真皮を用いて遺伝子組換え器官皮膚培養物の生成

Generation of Genetically Modified Organotypic Skin Cultures Using Devitalized Human Dermis

器官培養物は、それらのin vivoでの組織の対応の機能および生理学を模倣する細胞-細胞接触および細胞-マトリックス相互作用のための3D環境の再構成を可能にする重要な。これは、忠実に表皮分化と成層プログラムを再現する器官型皮膚培養が挙げられます。初代ヒト表皮角化細胞は、遺伝子が容易に過剰発現またはノックダウンすることができますレトロウイルスを介して遺伝的に操作可能です。これらの遺伝的に改変されたケラチノサイトは、次に遺伝的経路に衝突上皮細胞増殖、分化、および疾患の進行を研究するための強力なモデルを提供し、皮膚器官培養におけるヒト表皮を再生するために使用することができます。ここで紹介するプロトコルは、失活ヒト真皮を準備するだけでなく、と遺伝的に器官皮膚培養を生成するために、初代ヒトケラチノサイトを操作する方法を説明します。再生した人間の皮膚はdownstrに使用することができますこのような遺伝子発現プロファイリング、免疫染色、及びハイスループットシークエンシングに続いてクロマチン免疫沈降などのEAMアプリケーション。したがって、これらの遺伝的に改変された器官、皮膚培養物の生成は、皮膚恒常性を維持するために重要である遺伝子の決意を可能にします。

器官人間の皮膚を生成する最初のステップは、真皮から表皮を除去することです。 37°Cの4倍でペニシリン/ストレプトマイシン/ PBSの皮膚の2週間のインキュベーションは、表皮（ 図1A）から真皮の分離を可能にする必要があります。表皮と真皮を分離することは困難である場合には、別の週に4倍ペニシリン/ストレプトマイシン/ PBS中で37℃で組織を配置し、ピンセットを用いて再剥離してみてください。 失活真皮上のヒト表皮を再生するための鍵の一つは、ケラチノサイトが真皮の正しい側に配置されていることを確認することです。真皮は、頂部および底部を有しています。真皮の上部には、インビボで 、ならびに器官培養物でケラチノサイトと接触する側です。真皮の上部起因下部（ 図1B）の光沢度に真皮の下から区別することができます。ケラチノサイトは、底部に直接配置されている場合真皮の側（光沢）、表皮は差別か、正しく階層化しません。したがって、器官カセットに上向き真皮（非光沢）の頂部を有することが重要です。真皮は、器官カセット（ ...

この論文の目標は、表皮のケラチノサイトと非活性化されたヒトの真皮から遺伝子組み換えヒトの器官型皮膚を生成する方法について、包括的かつ詳細なプロトコルを提供することです。

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function ...

この手順の全体的な目的は、再生させたヒト真皮を用いて遺伝子改変した臓器様皮膚培養系を構築し、遺伝子発現の変化が表皮の増殖と分化に及ぼす影響を明らかにすることです。この手法は、どの遺伝子が表皮の増殖、分化、および疾患への進行に関与しているかを特定するなど、皮膚科学分野における重要な課題の解決に寄与します。本手法の主な利点は、遺伝子改変したヒト皮膚を数日で生成できるため、臨床的に関連性の高いヒトサンプルの研究が可能になることです。本手順のデモンストレーションは、私の研究室にて行います。凍結保存されたヒト皮膚組織を受け取った際は、組織培養用フード内に3〜5分間置いて融解させてください。融解後、組織のサイズに応じて、滅菌済みの50 mLコニカルチューブまたは125 mLボトルに移します。次に、容器の75%が満たされるまで、1x XPBSに4x ペニシリン・ストレプトマイシンを添加します。容器に蓋をし、5分間激しく振盪します。抗生物質溶液を取り除き、この操作を繰り返します。最後の洗浄後、さらに3回ステップし、組織を新しい容器に移して新しい抗生物質溶液を加えます。この混合液を組織培養インキュベーターにて37 °Cで2週間培養し、真皮と表皮を分離させます。2週間経過後、ピンセットを用いて真皮から表皮を剥離します。ヒト組織の取り扱いに関する施設のプロトコルに従って、表皮を廃棄します。真皮を抗生物質溶液の容器に入れ、前述と同様に激しく振盪して洗浄します。最後の洗浄後、真皮を新しい抗生物質溶液の容器に移し、使用するまで4 °Cで保存します。トランスフェクションの前日に、完全培地を用いてPhoenix細胞を6ウェルプレートに1ウェルあたり800,000個の密度で播種します。トランスフェクション当日、6 µLのトランスフェクション試薬を100 µLのdmmに混ぜ合わせます。トランスフェクションを行うウェルあたり、この混合液を室温で5分間インキュベートします。その後、ウェルあたり3 µgのレトロウイルスベクターを含むチューブに混合液を加え、室温で30分間インキュベートします。この混合液全体をPhoenix細胞の各ウェルに滴下して加え、一晩インキュベートします。トランスフェクションの翌日、Phoenix細胞から培地を除去し、同日に2 mLの新鮮な完全培地を加えます。初代ヒト角化細胞を、抗生物質添加の角化細胞無血清培地で再懸濁し、1ウェルあたり75,000細胞の密度で6ウェルプレートに播種します。翌日、トランスフェクションしたPhoenix細胞由来のウイルス粒子を含む培地を回収します。シリンジを用いて培地を0.45 µmフィルターでろ過し、混入した細胞を除去します。感染プロセスを促進させるため、ろ過したウイルス含有培地に5 µg/mLのヘキサジメチルブロミドを添加します。次に、2 mLの

generation-genetically-modified-organotypic-skin-cultures-using

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

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器官型フルスキン再構築物の生成:ヒト皮膚サンプルを用いた3次元皮膚モデルの構築法

このビデオでは、遺伝子組み換えヒトケラチノサイト組換えレトロウイルスを作製するための詳細なプロトコルについて説明しています。この方法は、ケラチノサイトにおける遺伝子発現の操作に用いることができます。...

初代ヒトケラチノサイトの遺伝子改変:組換えレトロウイルスを用いたケラチノサイトを遺伝子操作する方法

このビデオプロトコルは、表皮のケラチノサイトと非活性化されたヒト真皮を使用してヒトの器官型皮膚を生成するカセットベースのin vitro培養技術について説明しています。それらは、in...

器官型3D皮膚培養:無細胞真皮上にヒト表皮を再生するためのカセットベースのIn Vitro培養技術

このプロトコルの目標は、自然な肌に似た3次元の全厚の皮膚等価物を構築することです。特別に構築された自動創傷装置により、無菌状態を維持しながら、正確で再現性のある創傷を生成することができます。...

三次元の全層皮膚等価物と自動傷つけ処理の発生

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2Dと3Dの肌の改善<em&gt;インビトロ</em分子クラウディングの使用&gt;モデル

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ここで、両方のアーキテクチャを繰り返す 3 D...

黒色腫切片 3 D 回転楕円体の皮膚モデル

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臍帯血由来から 3 D 肌 Organoid の生成誘導多能性幹細胞

このプロトコルの目的は、長期的な培養のためのアクセス可能で簡単な技術を使用して、血管化されたヒトの皮膚同等物の生成および体積分析を記述することです。可能な限り、ステップの根拠は、研究者が研究ニーズに基づいてカスタマイズする能力を可能にするために記述されています。...

自己組み立て型血管化ヒト皮膚等価物の生成

ここでは、組織相互作用、4Dイメージング、タイムラプス動画(3Dプラス時間)、分子機能のグローバルまたはローカル摂動、およびシステム生物学の特性評価を調べるために使用できる3種類の鳥類胚性皮膚外植片培養のプロトコルについて説明します。...

鳥類の皮膚外植片を用いた組織パターン形成と器官形成の研究

このプロトコルは、皮膚の構造と機能を複製するために、平面の生理学的に関連する気液界面培養システムを使用して、ヒト人工多能性幹細胞から毛包を含む皮膚オルガノイドを製造する方法を概説します。...

気液界面培養システムを用いたヒト人工多能性幹細胞由来平面毛髪皮膚オルガノイドの作製

学ぶ 遺伝子組換え器官皮膚培養法。失活ヒト真皮と表皮角化細胞を用いて、遺伝子発現変化が表皮成長と分化に与える影響を解明する。数日で臨床的に関連性の高いヒト皮膚モデルを生成可能。

失活ヒト真皮を用いて遺伝子組換え器官皮膚培養物の生成

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