失活ヒト真皮を用いて遺伝子組換え器官皮膚培養物の生成

この手順の全体的な目標は、活性化されたヒト真皮を使用して遺伝子組み換え器官型の皮膚培養物を生成し、遺伝子発現の変化が表皮の成長と分化に与える影響を判断することです。この方法は、どの遺伝子がエピの成長、分化、および疾患への進行に関与しているかを判断するなど、皮膚科学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、遺伝子組み換えされたヒトの皮膚が数日以内に生成されるため、臨床的に関連する可能性のあるヒトサンプルの研究が可能になることです。

手順のデモンストレーションは、私の研究室から陽気に行われます。凍結したヒトの皮膚を受け取った場合は、組織を組織培養フードに3〜5分間置いて解凍します。解凍したら、サイズに応じて、組織を滅菌済みの50ミリリットルの円錐管または125ミリリットルのボトルに移します。

次に、容器が75%満たされるまで、1つのXPBSに4つのxペニシリンとストレプトマイシンを追加します。容器に蓋をし、5分間激しく振ってください。抗生物質溶液を取り除き、これを繰り返します。

最後の洗浄後、さらに3回ステップし、組織を新しい容器に移し、新鮮な抗生物質溶液を追加します。この混合物を組織培養インキュベーターで摂氏37度で2週間インキュベートし、真皮を表皮から分離できるようにします。2週間が経過したら、鉗子を使って真皮から表皮を剥がします。

人間の組織を扱うための機関のプロトコルに従って表皮を捨てます。真皮を抗生物質溶液の容器に入れ、以前と同様に激しく振って洗います。最後の洗浄後、真皮を抗生物質溶液の新しい容器に移し、完全な培地中のトランスフェクションシードフェニックス細胞をウェルあたり800,000細胞の密度で6ウェルプレートにトランスフェクションする前日に使用する準備ができるまで摂氏4度で保存します。

トランスフェクション当日は、6マイクロリットルのトランスフェクション試薬と100マイクロリットルのdmmを混合します。トランスフェクションする各ウェルについて、室温で5分間、トランスフェクトする各ウェルについて3マイクログラムのレトロウイルスベクターを含むチューブに混合物を加え、室温で30分間インキュベートし、この混合物全体をフェニックス細胞の各ウェルに滴下し、トランスフェクションの翌日に細胞を一晩インキュベートします。フェニックス細胞から培地を取り出し、同じ日に2ミリリットルの新鮮な完全培地を追加します。

ケラチノサイト血清遊離培地に初代ヒトケラチノサイトを再懸濁し、抗生物質とシードをウェルあたり75, 000細胞の密度で6つの壁プレートに播種します。翌日、トランスフェクションされたPhoenix細胞からウイルス粒子を含む培地を回収します。シリンジを使用してメディアを0.45ミクロンフィルターに通し、汚染された細胞を除去します。

ろ過したウイルス含有培地に1ミリリットルあたり5マイクログラムの臭化ヘキサジメチルを添加して、感染プロセスを媒介します。次に、前日に播種したケラチノサイトに2ミリリットルのウイルスをピペットで移します。次に、6枚のウォールプレートを遠心分離機で200Gで室温で1時間回転させます。

回転後、ウイルスを含むメディアを取り出して廃棄します。1つのXPBSで細胞を一度洗浄し、翌日に新しいK-C-S-F-Mを追加します。示した手順を使用して、同じバッチのケラチノサイトにウイルスを感染させます。

器官型カセットを作るため。焼灼器を使用して、3.5センチメートルの組織培養皿の蓋の中心から1センチメートル×1センチメートル四方を取り除きます。透明なマニキュアを使用してカセットの底に四角いペグを取り付け、マニキュアが乾くまで5分間待ちます。

最後に、カセットを裏返し、カセットをペグに載せた状態でカセットを6センチの皿に入れます。摂氏4度の貯蔵から真皮を取り出し、ケラチノサイト成長の容器に移します。ミディアムからウォッシュ。

洗浄を繰り返した後、真皮を新鮮なKGMに入れ、摂氏37度で2日間インキュベートします。インキュベーション後、メスを使って真皮を1.5cm×1.5cmの大きさに切ります。次に、真皮の上部を上にして器官型の正方形の穴に配置します。

鉗子を使用して、真皮を含む器官型カセット全体を反転させます。真皮の底に新鮮な細胞外マトリックスを5滴加え、真皮全体に均一に分布するようにわずかに振ってください。細胞外マトリックスを5分間固化させた後、鉗子を使用してカセットを裏返し、6cmの皿に4ミリリットルのKGMを追加します。

次に、遺伝子組み換えケラチノサイトを回収してカウントした後、Resusは90マイクロリットルのKGMに0.5〜100万個の細胞を懸濁し、細胞を真皮に分配します。共培養物を摂氏37度でインキュベートします。一日おきに文化のメディアを変えてください。

表皮の完全な層別化と分化は通常、5日目以降に起こります。ティッシュはめっき後14日まで採取可能です。この画像は、オルガノタイピックのヘマチンとエオシンの染色を示しています。

再生された人間の皮膚を再生した皮膚培養物には、表皮と真皮の両方が含まれています。表皮は完全に層状化されており、未分化基底層を含む4つの異なる層と、層、棘、ラナム、および角膜を含む3つの分化した層で分化しています。これらの免疫蛍光画像は、右に示すようなSNA i 2の過剰発現が、左に示す対照組織と比較して表皮分化を阻害することを示しています。

タンパク質ケラチン1またはKタンパク質は緑色で、核は青色でマークされています。コントロールの LAC Z および S NNA I の 2 つの発現組織における SNAI 2 の mRNA レベルを測定するための RTQ PCR R 分析は、コントロールと比較して SNAI 2 の 50 倍を超える発現を示しています。最後に、このRTQ PCR R解析は、SNA I 2の過剰発現がTGM1およびSPRR1などの分化誘導構造遺伝子の発現喪失をもたらすことを実証する。

硬膜外増殖および分化のメカニズムを決定するために、chipsy、免疫蛍光法、RN、ae、またはウェスタンブロッティングなどの他の方法を実施することができる。この技術は、皮膚科学の分野の研究者が、遺伝子の機能が皮膚の恒常性にどのように影響するかを探求する道を開きました。このビデオを見れば、ケラチノサイトとデビッドヒトの真皮を使用して遺伝子組み換え有機ヒト皮膚培養物を生成する方法についてよく理解できるはずです。