Name: 光血栓法を用いた外接莢梗塞モデル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: 学ぶ光血栓法による外接莢梗塞モデル作成法。ラットを用いて運動機能障害を再現し、神経科学的メカニズム解明と治療法開発への応用を目指す再現性の高い実験手法を確立する。

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この作品は、医療システム工学研究所（iMSE）＆GISTからGIST-カリフォルニア工科大学共同基金（K04592）からの助成金によっておよび未来創造科学部が資金を提供し、韓国のNRFを通して基礎科学研究開発プログラムによってサポートされていました（NRF-2013R1A2A2A01067890）。

すべての手順は、光州科学技術院（GIST）の機関のガイドラインに従って行われた、すべての手順は、GISTで施設内動物管理使用委員会によって承認されました。 1.事前lesioning手順<ol><li> AAV-GFPを使用した内部カプセル内前肢地域の同定 <ol><li>ハウスとSDラット（〜400グラム、11から13週間）を処理制度や国のガイドラインに準拠したこと。 </li><li>適切な滅菌（蒸気またはプラズマ滅菌器）を使用して、すべての手術器具および電極を滅菌します。殺菌、乾燥のために30分間、30分の設定として121℃の蒸気滅菌器を使用してください。 </li><li>筋肉内注射を介してケタミン塩酸塩の混合物（100mg / kg）およびキシラジン（7ミリグラム/キログラム）で動物を麻酔。足のピンチによって麻酔の深さを確認してください。下の加熱パッドを経由して37.5±0.5℃の体温を維持動物の体。 </li><li>耳のバーと口ホルダーを使用して、定位フレームに動物を置きます。 </li><li>クリーンと70％アルコールとポビドンヨード溶液で手術部位を消毒します。手術中の痛みを軽減することを意図し頭蓋切開領域には、頭皮の下に2％塩酸リドカインを浸潤します。 </li><li>目の乾燥を防ぐために獣医眼軟膏を適用します。手術部位への動物の上に滅菌ドレープを配置します。無菌状態ですべての手続きを維持しています。 </li><li>メスを用いて2センチメートルの正中線頭蓋骨切開を行い、ワイヤリトラクターとの二国間の皮膚を撤回。綿棒及び30％過酸化水素で頭蓋骨を乾燥させます。 </li><li> （2.5±正中線から：ML、ブレグマから2.5 AP）およびウイルス注入のためのマイクロcurretteで道をクリアする運動皮質の前肢領域の上にハンドピースのドリルを用いて穴を開けます。 </li><li>の氷と負荷1μlの上AAV-GFP（2×10 12ウイルス分子/ ml）を解凍10μlのシリンジ内のウイルス。定位フレームに注射器を置きます。 </li><li>既製の穴に針を移動し、硬膜深く針1ミリメートルを下げます。 </li><li>高精度マイクロポンプを使用して（0.1マイクロリットル/分）、ゆっくりとウイルスを注入し、ウイルスが外に拡散することを可能にするために、追加の10分間の場所に針を残します。 </li><li>生理食塩水による洗浄で手術部位を洗浄した後、3-0ナイロン縫合糸で傷口を確保。定位フレームからラットを解放し、回復室に転送します。術後疼痛管理のための筋肉内注射を介してケトプロフェン（2ミリグラム/キログラム）を管理します。 </li><li>加熱パッド付き体温（37℃）を維持し、必要に応じて皮下注射を介して筋肉内注射し、2％塩酸リドカインを経由して（0.1％、1ミリリットル）第二世代セフェムクラスの抗生物質を投与します。それは維持するのに十分な意識を取り戻したまで無人の動物を放置しないでください胸骨横臥位。完全復旧までのシングル家動物。 </li><li> 3週間の回復、深くフード内の筋肉内注射を介してケタミン塩酸塩（300 mgの/ kg）を過剰投与によりラットを麻酔 - 2を以下に示します。つま先ピンチ応答、パルス、および呼吸の欠如によって動物の死を確認してください。フードにラット仰向けに置きます。 </li><li>胸腔を開くには &#39;Y&#39;字型の切開により腹腔を開きます。しっかりと止血剤と下行大動脈をクランプし、血液の排水のためのラットの心臓の右心房を破裂。 30分（10ml /分）のために4％パラホルムアルデヒドに続く5分（10ml /分）、冷1％パラホルムアルデヒドで心臓の左心室に灌流を開始します。 </li><li>ハサミを使用して、カーカスから、ラットの頭を削除します。鼻に首から正中切開を行い、頭蓋骨が露出するようにはさみや骨鉗子を使用して、首の筋肉を取り除きます。静かに脳から頭蓋骨とデュラスを解剖します。 </li><li>脳を抽出し、一晩、4％パラホルムアルデヒドを充填した50ミリリットルコニカルチューブにラットの脳を置きます。次の日は、1×PBSで3回脳を洗浄し、30％ショ糖溶液に入れてください。 </li><li>脳が完全に30％スクロース溶液の底に沈む後、cryotomeで-20℃で10月化合物とcryomoldで脳を置きます。 40ミクロ​​ンの厚さと200μmの間隔で前頭面で脳をスライス。 </li><li>スライド法14を用いて、GFPの免疫組織化学染色を行います。 4℃で一晩脳切片に：一次抗体（抗緑色蛍光タンパク質、ウサギIgG画分の200 1）を適用します。 2 番目に日のTween-20（PBST）溶液を、1％リン酸緩衝生理食塩水で3回洗浄し、二次抗体を適用する：1時間（1ヤギ抗ウサギIgG（H + L）の500）。 1％のPBSTで3回スライドを洗浄します。脳切片上のカバーガラスを置きます。 </li><li>蛍光顕微鏡（励起波長を使用して470nmで、発光波長525nmで、倍率5倍）、内部のカプセル内のAAV-GFP形質導入された軸索を観察します。形質導入された軸索の定位座標を決定するために、ラット脳アトラス15で形質導入された軸索の位置を比較</li></ol></li><li> 莢膜梗塞モデル化するための適切な光強度の調整を事前にlesioning <ol><li> 光ニューラルインタフェースの構築 <ol><li>切削ドリルを使用して、内部スタイレットと27ゲージの脊椎針の適切な長さ（4センチ）カット。 注：カッティング脊椎針の先端を圧縮して潰してもよいです。スタイレットを除去し、脊髄針の破砕部分を除去し、脊髄針の内側の口径を維持するために、脊髄針の先端を磨きます。 </li><li>片側パッチコードの光ファイバ（62.5μmのコアと125ミクロン）のジャケットの適切な長さ（10センチメートル）を取り除きます。 </li><li> unjacked光学Fiのを挿入しますberの金属管（外径17ミリメートル：3.8ミリメートル、内径：3.3ミリメートル、長さ）に、次に繊維の周りにクランプされ、。金属管は、光ファイバや脊髄針のハブとの間の空間を充填すると便利です。二回押さえて金属管の1/2下を固定します。 </li><li>光ファイバ上に熱硬化性エポキシ樹脂を適用し、脊髄針に光ファイバを挿入します。ハブ内の空きスペースに追加のエポキシ樹脂を適用します。安定した固定のために100℃で20分間、エポキシ樹脂を硬化させます。 </li><li>脊髄針の外に突出する光ファイバを切断し、ダイヤモンドラッピング（研磨）のシートを使用して、脊髄針の先端に光ファイバを磨きます。 </li><li>緑色レーザシステムのカプラにパッチコードのFC / PCコネクタ部品を接続して、デジタル光パワーとエネルギーメーターを用いた光ファイバの先端から光強度を測定します。 </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Photothrom内部のカプセル内botic梗塞Lesioning <ol><li>適切な滅菌（蒸気またはプラズマ滅菌器）を使用して、すべての手術器具および電極を滅菌します。殺菌、乾燥のために30分間、30分の設定として121℃の蒸気滅菌器を使用してください。 </li><li>動物を麻酔（〜400グラム、11から13週間）の筋肉内注射を介して塩酸ケタミン（100mg / kg）およびキシラジン（7ミリグラム/キログラム）の混合物。足のピンチによって麻酔の深さを確認してください。動物の体の下に加熱パッドを経由して37.5±0.5℃の体温を維持。 </li><li>耳のバーと口ホルダーを使用して、定位フレームに動物を置きます。 </li><li>クリーンと70％アルコールとポビドンヨード溶液で手術部位を消毒します。手術中の痛みを軽減することを意図し頭蓋切開領域には、頭皮の下に2％塩酸リドカインを浸潤します。目の乾燥を防ぐために獣医眼軟膏を適用します。 </li><li> ANの上に滅菌ドレープを適用します。imalとは、手術部位を露出させます。無菌状態ですべての手続きを維持しています。 </li><li> 2センチメートルの正中線頭蓋骨切開を行い、ワイヤリトラクターとの二国間の皮膚を撤回。綿のスワップおよび過酸化水素で頭蓋骨を乾燥させます。 </li><li>ブレグマとラムダが同じレベルで整列されるまで、ノーズクランプの高さを調整します。重要なステップ：この位置合わせが正しく、主実験で内部カプセルに梗塞病変を行うのように、より深い構造にアプローチすることが重要です。 </li><li>光血栓を誘発するためにドリルを使って穴（3.0±正中線から：;：; MLブレグマから-2.04 AP直径2mm）を作成します。 </li><li>ポーランドと光インターフェイスの光ファイバ先端を清掃してください。曲げず定位フレームにONIを修正しました。 ONIの先端をチェックして、光インタフェースの挿入前と後に明らかにそれを一掃。 </li><li> opticaの挿入に先立って、光ファイバの先端からのレーザ強度​​を測定ラット脳の標的部位へのLインタフェース。光ファイバの先端に、手術前の手順によって確認されるように、3.5 mWのにレーザー強度を調整します。 </li><li>内部カプセルの標的領域にドリルスルーホール（手術前の段階から確認-7.8 mm）をONIを挿入します。 </li><li>光血栓中に37.5±0.5℃の体温を維持します。下半身の温度が梗塞の予想範囲を生成しないかもしれません。尾静脈からローズベンガル（2ミリリットル/キログラム）を注入します。 </li><li>ローズベンガル注射後90秒1分間の532nmのグリーンレーザをオンにします。照射後、静かに脳からONIを削除します。手術部位を洗浄した後、傷は3-0ナイロン縫合糸で傷口を確保確保。定位フレームからラットを解放し、回復室に転送します。 </li><li>偽手術群（SOG）の場合は、代わりにローズベンガルの生理食塩水の注入（0.2ミリリットル/ 100グラム）を除いて、同一の病変作りの手順を実行します。 </li><li>手術後の加熱パッドで、体温（37℃）を維持し、筋肉内注射を介して抗生物質（第2世代セファロスポリン、0.1％、1ミリリットル）を管理。それは胸骨横臥位を維持するのに十分な意識を取り戻したまで無人の動物を放置しないでください。完全に回復するまで、他の動物によって占有ケージに手術後の動物を返さないでください。 注：予備実験5ミリワット、1ミリワットから最適な光強度を見つけるために、同じ手順で行い、手順は異なる状態で病変の十分な範囲を取得するために必要とされ得ます。 </li></ol>莢膜梗塞Lesioning 3.評価<ol><li> 行動試験と動物のグループ化 <ol><li>ウィショーらによって記載されているように、単一のペレット到達タスクを実行します。14ストロークモデル化した後、1週間毎日前肢の運動障害を評価します。単一のペレットに達するのタスクを実行します1cm幅のスリットと前壁の真ん中の前に食品の棚に明確なプレキシグラス（30×15×35センチメートルの高さ）を使用した食品制限動物では（SPRT）（対照体重の90％）。 </li><li>好適な前肢の斜め反対側の食品棚にペレットを配置します。 3週間のセッションあたり20ペレットを管理します。 注：SPRTsの成功数は、動物が食物ペレットを把握し、それを落とすことなく、口の中にそれを置くているリーチとして定義されています。 </li><li>以下の式で定義される成功達するの百分率としてスコアを計算します。 <img alt="Equation1" src="/files/ftp_upload/53281/53281equation1.jpg" /> 注：偽手術群（SOG）、緩やかに回復グループ（MRG）、および不十分な回収・グループ（PRG）：私たちは3つのグループに動物を分けます。もし脳卒中後SPRTスコア&gt; 50％、我々は、実質的な病変の存在を示すMRG、としてラットを分類するが、TAのない完全な破壊目標確認。脳卒中後SPRTスコアが&lt;50％プレストロークSPRTスコアと比較している場合、我々は目標に完全lesioningを示しPRG、としてグループを分類します。 </li></ol></li><li> 梗塞LesioningのNeurohistological確認 <ol><li>前述のように4％パラホルムアルデヒドで心臓灌流を行います。脳が完全に30％ショ糖溶液に沈む後、10μmの厚さとミクロトームまたはcryotome 4を用いて、200μmの間隔で冠状切片を行います。 </li><li> H＆E、ニッスル、ルクソールファーストブルーPAS、ニューロフィラメントタンパク質、Lまたはグリア線維酸性タンパク質染色および組織学的所見を観察で染色は、染色を観察する対象領域内部のカプセルの全体幅をカバーすることができ、最適な光強度を決定します4,17。 </li><li> ImageJソフトウェアを使用して、脳のスライド上の内部カプセルの光血栓梗塞領域の体積を測定。<ol><li>梗塞領域の体積を測定するには、「ImageJの「ソフトウェアを起動します。 （ &#39;イメージ」→「スタック」→「イメージスタックに&#39;）を積層するファイルを開く」スタックへのイメージ」を選択します。編集ファイル名を選択し、スケールを編集する（→「スケールを設定します &#39;&#39;分析 &#39;）&#39;スケールを設定します」。 </li><li> 「プラグイン」で、選択した画像の容量や面積を計算するために「スタックを測定します」。 「スライス間隔」に2つの画像の距離間隔を挿入します。すべての画像のROI（関心領域）の描画を行い、「測定」をクリックします。 注：ソフトウェア「ImageJの」は、自動的に各画像およびそれらの全体積の面積や体積を計算します。 </li></ol></li></ol></li></ol>

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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

ここで提示莢梗塞モデルは、前肢の機能の著しいと持続的な運動障害を持つ対象となる病変を示しています。皮質下の莢ストロークの前のモデルは、運動障害と迅速なリカバリ処理の6,8,9の不十分な度合いを示しました。この意味で、このモデルは、長期的な機能障害を呈する臨床莢梗塞例に似ています。 外接莢梗塞モデルの開発において最も重要なステップは次のとおりです：1）が正しく内部カプセル内に機能を無効にすることを目的と身体部分の体部位表現を識別するために、 2）近隣の灰白質構造の最小限の侵略と内部カプセルの幅全体を破壊することができ、緑色レーザーの最適な強度を識別するために、 3）正確にターゲット構造の光ファイバを配置します。提示された技術は、外接を誘導することができるが、高複製率（&gt; 70％）とD莢梗塞モデルは、内部カプセルの幅全体をカバーする破壊の完全性のターゲティングおよび程度の小さな差は、異なる運動障害を説明することができます。 皮質脊髄路は、体部位、組織15の論争にもかかわらず、ヒトに...

最近まで、「灰白質ストローク（GMS）のモデルは、「排他的脳卒中の病態生理を理解するために、新しい治療法の開発を導くために使用されています。すべてのストローク1,2の25％ -しかし、15を構成している高齢者における皮質下白質に影響を与えるストロークの増加罹患率がありました。多くの研究は、白質ストローク（WMS）モデルを使用したいくつかの研究がある一方で、GMSモデルを使用に関するストロークを行われています。げっ歯類における白質は、ヒトまたは霊長類における白質よりも実質的に小さいです。これにより、選択白質3に標的領域にアクセスして破壊することはより困難です。さらに、全く効率的なツールを選択的に標的白質の計画範囲を破壊するためにこれまでに開発されていません。したがって、白質ストロークの研究のための適切なモデルの欠如がありました。 動物目rokeモデルは、多くの場合、新たなリハビリテーションや治療法の開発のための運動回復の進行を監視するために使用されます。人間のストローク4,5で実証解剖学的な変化と調和の長期神経学的欠損を示す動物モデルを利用することが理想的です。この点において、梗塞lesioning以下の運動障害や脳の広い関与の急速な回復は、脳卒中の研究を追求して現実的ではないかもしれません。前嚢梗塞モデルは内部のカプセル6-9にエンドセリン-1（ET-1）の内頸動脈または前部脈絡膜動脈と拡散の閉塞によってなされてきました。それにもかかわらず、動脈閉塞は、動脈の注意深い解剖が必要ですが、それは永続的な行動欠陥なしに、内部カプセルを含む梗塞病変の広い面積を、生成されます。また、ET-1は完全に内包後脚を破壊するために拡散していなかった、したがってより少ないとマークまたはBEHを持続しますavioral赤字。 光血栓梗塞モデルは広く皮質梗塞病変および皮質下構造10の様々なタイプを生成するために使用されています。技術は、小血管および梗塞病変の発生10で血小板凝集につながる焦点照明に続く静脈内投与が含まれます。ほとんどWMS病変5,11を生成するために使用されていないのに対し、光血栓技術が広く、GMS病変を作成するために使用されてきました。この技術については、ローズベンガル染料および光照射の組み合わせは、対応する機能障害を引き起こし、ターゲット構造の破壊に有用であることが実証されています。それは梗塞病変の大きさを決定するので、光血栓技術の重要な要素は、光照射です。灰白質および白質に異なる影響で光照射の結果、光の散乱が白ミリアンペアで4倍以上高くなっているので、灰白質12と比較してtter。光強度が十分に低い放射照度（&lt;1140ミリワット/ mm 2）とがある場合したがって、1は光血栓病変が白質（ すなわち 、内部カプセル）に範囲に影響を与えるように拡張機能を制限することができます。例えば、より高いエネルギーの光は、グレーと白の両方の問題に梗塞を誘導することができる、まだ低いエネルギーの光のみが白質に光血栓を誘発する可能性があります。また、光エネルギーの普及率は非常に限られていました。光エネルギーの約99％は、光13のソースから1ミリメートルを超えて失われました。したがって、より低いエネルギーの光が隣接灰白質の最小限の侵略と白質にのみ光血栓を誘発し、正確に標的にすることを期待されています。 ここでは、げっ歯類における内部カプセルの前肢の領域に梗塞病変を作成するための新規な方法を説明します。私たちは、内部CAに前肢領域の識別方法を説明しますpsule、調整、光の配信、および梗塞病変の生成を含む光照射の技術、。我々はまた、莢膜モデルの完全性を評価するために使用される行動試験を記載します。

<table><tbody><tr><td>DC温度コントローラー</td><td>WORLD PRECISION INSTRUMENTS, INC.</td><td></td><td></td>ATC1000</tr><tr><td>デジタル脳定位固定装置</td>(<td>株) ストールティング</td><td>51900</td><td></td></tr><tr><td>電気刺激装置</td><td>CyberMedic株式会社</td><td>EMGFES 2000</td><td></td></tr>エポキシ<tr><td>&nbsp;</td><td>精密繊維プロダクツ(株)</td><td>PFP-353ND1</td><td>配合比: 10(A):1(B硬化剤) 重量&nbsp; 硬化スケジュール: 1分 @150 >C 2 ~ 5 分 @120 >C 5 ~ 10 分 @100 >C 15 ~ 30 分 @80 >C</td></tr><tr><td>光ファイバースクライブ&nbsp;</td><td>THORLABS, INC</td><td>S90R</td><td></td></tr><tr><td>ファイバーパッチケーブル</td><td>KOREA OPTRON Corp.</td><td></td><td>外径:3 mm & Oslash;200 &micro;m 0.39 NA FC/PC-FC/PC 1 m</td></tr><tr><td>レーザー電源</td><td>長春新工業オプトエレクトロニクステック株式会社</td><td>MGL-FN-532nm-200mW-14010196</td><td></td></tr><tr><td>クリンプリング&nbsp;</td><td>ダウーテック(株)</td><td></td><td>長さ:19 mm 内径:3 mm 外径:3.8 mm 材質:SUS</td></tr><tr><td>Micro4-micro シリンジポンプコントローラー</td><td>WORLD PRECISION INSTRUMENTS, INC</td><td>95100</td><td></td></tr><tr><td>光パワーメーター</td><td>THOLABS, INC</td><td>PM100D</td><td></td></tr><tr><td>ダイヤモンドラッピング(研磨)シート</td><td>THORLABS, INC</td><td>LF3D</td><td>グリット: 3 & マイクロ;m</td></tr><tr><td>ダイヤモンドラッピング(研磨)シート</td><td>THORLABS, INC</td><td>LF6D</td><td>グリット : 6 & マイクロ;m</td></tr><tr><td>ローズベンガル</td><td>SIGMA-ALDRICH CO., LLC.</td><td>330000</td><td></td></tr><tr><td>ペンシルポイント先端付き脊椎麻酔用針(脊椎針)&nbsp;</td><td>B.ブラウン・メルズンゲンAG&nbsp;</td><td>4502027</td><td>サイズ:27 G 長さ:88 mm 針:0.40 mm</td></tr><tr><td>防水サンドペーパー&nbsp;</td><td>DEERFOS CO.,LTD</td><td>CC261</td><td>グリット : 1,000 & マイクロ;m</td></tr><tr><td>ナノフィル 10&nbsp;&マイクロ;l シリンジ</td><td>WORLD PRECISION INSTRUMENTS, INC</td><td>NANOFIL</td><td></td></tr><tr><td>Nanofil 33&nbsp;G BVLD針</td><td>WORLD PRECISION INSTRUMENTS, INC</td><td>NF33BV-2</td><td></td></tr><tr><td>AAV-GFP ウイルス</td><td>UNC ベクターコア</td><td>AAV2-CamKIIa-eYFP</td><td>2 x 1012 ウイルス分子/ml</td></tr><tr><td>抗緑色蛍光タンパク質、ウサギ IgG 画分</td><td>Life Technologies, INC</td><td>A11122</td><td>一次抗体 (1:200)</td></tr><tr><td>ヤギ 抗ウサギ IgG (H + L)</td><td>Life Technologies, INC</td><td>A11034</td><td>二次抗体抗体 (1:500)</td></tr><tr><td>セフテゾール</td><td>GUJU Pharma CO.,LTD.</td><td>A27802741</td><td>0.1%、1ml</td></tr><tr><td>リドカイン塩酸塩注射</td>剤 <td>ジェイル製薬(株)</td><td>A04900271</td><td>2%, 1 ml</td></tr><tr><td>ハンドピースドリル</td><td>セシン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>デジタル光パワー・エネルギーメーター</td><td>THORLABS, INC</td><td>PM100D</td><td></td></tr><tr><td>ケトプロフェン</td><td>ユニビオテック</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

光血栓法を用いた外接莢梗塞モデル

Circumscribed Capsular Infarct Modeling Using a Photothrombotic Technique

近年の白質脳卒中の有病率の増加は、この分野での特別な研究を必要としています。しかし、白質脳卒中の適切な動物モデルがないため、研究研究が妨げられています。ここでは、隣接する灰白質構造への損傷を最小限に抑える限局性被膜梗塞を作成するための新しい方法について説明します。手術前の神経トレース法を用いて、アデノ随伴ウイルス緑色蛍光タンパク質(AAV-GFP)を用いた神経トレースを行い、内包内の前肢領域の体性組織を同定した。灰白質と白質の異なる光学特性に基づく光強度の調整は、灰白質の相対的な保存とともに白質の選択的破壊に貢献します。光神経インターフェースの正確な位置決めにより、内部カプセル内の前肢領域全体の破壊が可能になり、それが顕著で持続的な運動障害につながります。したがって、この技術は、持続的な運動障害を伴う複製性の高い莢膜梗塞病変を引き起こします。このモデルは、行動レベル、回路レベル、および細胞レベルでの白質脳卒中(WMS)の研究だけでなく、新しい治療およびリハビリテーション介入の開発に対するその有用性を評価するのにも役立ちます。

ここに提示された方法は、永続的な運動障害で外接莢梗塞を作成することを意図しています。従って、正確に手術前の段階において内蔵カプセル内の標的を決定することが重要です。内部のカプセル内の錐体繊維の体部位マッピングは、現在までに決済されていません。正しく内部のカプセル内の標的を同定するために、前肢領域が描写されなければなりません。運動皮質の前肢領域にAAV-GFP注射を内包（図1）においてピラミッド繊維の軸索を追跡することができる。例えば、ビオチン化デキストランアミン（BDA）のような他の神経トレーサーを、同様に使用することができます目的。内部のカプセル内の標的の定位座標を内包する運動皮質の前肢領域に由来の軸索突起を追跡することによって明らかにすることができます。 <p class="jove_content" fo:keep-together.within-ページ= &quot;1&quot;&gt; <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53281/53281fi...

この原稿は、莢梗塞のモデリング技術が記載されています。ここでは、手術前のターゲット・マッピング後の光の低強度で変性された光血栓技術を利用しました。この技術を使用して、我々は永続的な運動障害を持つ外接莢梗塞モデルを作成しました。

Recent increase in the prevalence rate of white matter stroke demands specific research in the field. However, the lack of a pertinent animal model for ...

本手法の全体的な目的は、光血栓法を用いて、持続的な運動障害を伴う境界明瞭な内包梗塞モデルを作製することである。内包梗塞を作製する前に、運動皮質の前肢領域にGFPを発現するアデノ随伴ウイルスを導入し、内包における前肢領域を特定する必要がある。まず、麻酔をかけたラットを脳定位固定装置に設置することから始める。次に、ラットの頭部を剃毛し、70%アルコールとポビドンヨード溶液を用いて頭皮を滅菌します。術中の痛みを軽減するため、予定している頭皮切開部位の皮下に2%リドカイン塩酸塩を注射します。目の乾燥を防ぐため、眼軟膏を塗布します。そして、動物の上に滅菌ドレープを掛けます。頭皮に2 cmの中央切開を加えた後、ステレオタキシックアームを配置し、ステレオタキシック座標に従って運動皮質の前肢領域を特定します。この位置に穿孔します。針を穿孔部位まで移動させ、硬膜を貫いて運動皮質内へ1 mm下げます。高精度マイクロポンプを用いて、ウイルス1 µLをゆっくりと注入します。針の経路を介した逆流を防ぐため、そのまま10分間保持します。10分が経過した後、ゆっくりと針を抜きます。生理食塩水で手術部位を洗浄し、3-0ナイロン縫合糸で傷口を固定します。その後、ラットを脳定位固定装置から解放し、経過観察のため回復室に移動させます。術後の疼痛管理のため、鎮痛剤を投与します。2〜3週間後、承認された方法に従ってラットを安楽死させ、凍結保護した脳を切片化します。GFP染色後、蛍光顕微鏡を用いて内包におけるAAV-GFP導入軸索を観察します。蛍光画像で確認した導入済み軸索の位置をラット脳アトラスと比較し、導入済み軸索の定位座標を正確に決定します。光学神経インターフェースを準備するために、まずカッティングドリルを使用して、スタイレットが入った27ゲージの脊髄針を約4センチメートル切断します。次に、光ファイバーのジャケットを10センチメートル剥離します。被覆のない光ファイバーの部分を金属管に挿入します。そして、管をファイバーに沿ってクランプします。次に、プレス機を用いて金属管の下半分を2回クランプします。金属チューブが、光ファイバーと脊髄針のハブの間の隙間を埋めます。光ファイバーに熱硬化性エポキシ樹脂を塗布します。さらに、ハブの空隙にエポキシ樹脂を塗布します。そして、スピナル針に光ファイバーを挿入します。安定的に固定させるため、エポキシ樹脂を100 °Cで20分間硬化させます。硬化した後、スピナル針から突き出ている光ファイバーを切断し、ダイヤモンドラッピングシートを用いてスピナル針先端の光ファイバーを研磨します。最後に、パッチコードのFCPCコネクタ部分をグリーンレーザーシステムのカプラーに接続します。次に、デジタル光パワー・エネルギーメーターを使用して、光ファイバー先端からの光強度を測定し、光が正確に放出されているかを確認します。手術の間、動物の体温を37.5 °Cに維持するため、動物の体の下にヒートパッドを敷きます。前述と同様に、ラットに麻酔を施し、手術の準備を行います。2cmの中線切開を行った後、BregmaとLambdaが同一レベルに揃うまでノーズクランプの高さを調整します。内包を正確に標的とするためには、この適切なアライメントが極めて重要です。ステレオタキシスアームを調整し、光血栓症を誘導する部位を特定します。次に、この地点に2 mmの穴をドリルで開けます。続いて、ONIの光ファイバー先端を研磨および洗浄し、曲がらないようにステレオタキシスフレームに固定します。ONIのチップが清潔で損傷していないことを確認します。光学インターフェースをラット脳の標的部位に挿入する前に、光ファイバー先端からのレーザー強度を測定します。光ファイバー先端でのレーザー強度を3.5 milliwattsに調整します。次に、プロトコルの最初のセクションで決定した背腹座標を用いて、ONIを内包腔の標的領域まで下降させます。その後、ローズベンガルを2 mg/kgの用量で尾静脈から注射し、1分間に設定したカウントダウンタイマーを開始します。1分が経過したら、532 nmのグリーンレーザーを90秒間照射し、梗塞を作成します。照射後、ONIを脳からゆっくりと取り出します。手術部位を洗浄した後、3-0ナイロン縫合糸で創傷部を固定します。その後、ラットを脳定位固定装置から取り外し、回復室へ移動させます。この画像は、光血栓症による病変形成から2週間後における、2 mWから5 mWまでの異なるレーザー光強度における梗塞病変の範囲を示しています。矢印は梗塞病変を示しています。本実験設定において、光強度は3 mWから4 mWの間であると考えられます。続く2枚の画像は、光血栓症から3週間後の被膜梗塞の顕微鏡像を示しています。ラット脳のこの冠状断面において、矢印は視覚ファイバーを含む針の軌跡を、視床から内包まで指し示しています。これらの連続したニッスル染色切片は、内包における梗塞病変の範囲を示しています。矢印は梗塞病変を示しています。

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Research

JoVE Journal

Medicine

医学

このビデオは、感光性色素の投与後に無傷の頭蓋骨をレーザー照射することにより、マウスモデルで光血栓性脳卒中を生成する手順を示しています。...

マウスモデルにおける光血栓性脳卒中のモデリング:光血栓症を誘発するための感光性色素投与後のマウス頭蓋骨を介したレーザー照明技術

Photothrombosisは、再現性の高い方法で、興味のある分野での小よく区切り梗塞を誘発するための迅速、低侵襲技術です。これは、トランスジェニックマウスの脳の可塑性の根底にある細胞および分子応答を研究するために特に適している。...

Photothrombotic虚：マウス脳卒中研究のための低侵襲かつ再現性の光化学皮質病変モデル

ここでは、マウスの体性感覚皮質にRose Bengal光血栓をin vivoで誘導するための半侵襲的光学顕微鏡法のアプローチについて説明します。...

共焦点光学イメージングによるローズベンガル光血栓<em&gt;インビボ</em&gt;：単一の容器ストロークのモデル

光血栓症は、脊髄に限局性虚血を誘発する低侵襲で再現性の高い手順であり、マウスの脊髄損傷のモデルとして機能します。...

マウスの脊髄損傷のモデルとしての光血栓誘発性局所虚血

このプロトコルは、脳の血栓塞栓を可視化するための複合近赤外蛍光（NIRF）イメージングおよびマイクロコンピュータ断層撮影（マイクロCT）の適用を説明します。この技術は、血栓負担と進化の定量化を可能にします。 NIRFイメージング技術は、マイクロCT技術は、金ナノ粒子を用いた動物生体の内部に血栓を視覚化しながら、蛍光、切除した脳内の血栓標識可視化します。...

直接脳血栓塞栓を可視化するための複合近赤外蛍光イメージングおよびマイクロコンピュータ断層撮影

脳卒中は、最小限の治療オプションと失われた脳組織を再生するための現在の臨床療法のない世界的な問題です。ここでは、げっ歯類の運動皮質における正確な光血栓性脳卒中を作成し、その後のヒドロゲル生体材料の注入を行い、脳卒中後の組織再生に及ぼす影響を研究する方法を説明する。...

脳卒中後の脳へのヒドロゲルバイオマテリアル足場の注入

従来の光血栓性脳卒中(PTS)モデルは、主に組織プラスミノーゲンアクチベーター(tPA)溶解性治療に対して高い耐性の高密度血小板凝集体を誘導します。ここでは、光活性化のためにトロンビンと感光性色素を同時注入することにより、修正されたマウスPTSモデルが導入されています。トロンビン増強PTSモデルは、血小板:フィブリン血栓を混合し、tPA血栓溶解に対して非常に敏感です。...

フィブリン富化およびtPA感受性光血栓性脳卒中モデル

ここで説明するフォトトロンボミックストロークモデルは、感光性染料の投与後にレーザー照明を用いて永久的な微小血管閉塞を誘導することによって無傷の頭蓋骨を通してストロークが生成される。...

マウスにおける脳卒中のモデリング:光血栓症による焦点性皮質病変

全光学的アプローチを使用して、虚血性脳卒中を誘発すると同時に、覚醒して行動しているマウスの新たな脳卒中コアで蛍光バイオセンサーを使用してニューロンのCa2+...

行動マウスの虚血性脳卒中を誘発および監視するための同時光血栓症とファイバー測光法

このプロトコルは、ウイルスの送達、視球体の着床、光血栓誘導、アストロサイトおよびニューロン活動の同時記録、アストロサイトのオプトジェネティック刺激を含む統合的な手法を提供します。この統合手法は、虚血性脳卒中の急性期から慢性期にわたり、アストロサイトとニューロンの関係を同時に調査することを目的としています。...

振る舞うマウスの神経細胞およびアストロサイト活動の光血栓性脳卒中モデリングおよび in vivo 光学記録のための統合手法

学ぶ光血栓法による外接莢梗塞モデル作成法。ラットを用いて運動機能障害を再現し、神経科学的メカニズム解明と治療法開発への応用を目指す再現性の高い実験手法を確立する。

光血栓法を用いた外接莢梗塞モデル

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