Name: 神経の分析のための成体マウスのV-SVZにおける細胞の安定的かつ効率的な遺伝子改変幹細胞自律と非自律効果 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: 学ぶレンチウイルス粒子を用いた成体マウスV-SVZ神経幹細胞の長期遺伝子改変法。細胞自律性とニッチ依存性効果を解析し、神経発生メカニズムの解明と再生医療への応用を目指す。

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私たちは、MJパロップと大学・デ・バレンシアのSCSIEの技術支援の助けを認めます。我々はまた、有用なコメントや原稿の議論のためアントニアFollenziに感謝します。フンダシオンBotinのによってサポートされている場合は、そのサンタンデール大学グローバル部門を通じてバンコ・サンタンデールによると、Generalitatのバレンシア（PROGRAMAプロメテオ、ACOMP、およびISIC）とMINISTERIOデエコノミアのy Competitividad（：SAF2011-23331、CIBERNED及びRETICターセルMINECO）からの助成金によって、 。この作品は、また、（260511- MINECO と欧州研究評議会（ERC）2012-STGからBFU2010-21823とRETICターセル助成金によってサポートされていました AC BM-P へのPD-HUMMODEL）。 MINECOのスペインFPIの交わりの受信者です。

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<li>Kokovay, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VCAM1+is+essential+to+maintain+the+structure+of+the+SVZ+niche+and+acts+as+an+environmental+sensor+to+regulate+SVZ+lineage+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">VCAM1 is essential to maintain the structure of the SVZ niche and acts as an environmental sensor to regulate SVZ lineage progression.</a> Cell Stem Cell. 11 (2), 220-230 (2012).</li>
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<li>Yamashita, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subventricular+zone-derived+neuroblasts+migrate+and+differentiate+into+mature+neurons+in+the+post-stroke+adult+striatum%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Subventricular zone-derived neuroblasts migrate and differentiate into mature neurons in the post-stroke adult striatum.</a> J Neurosci. 26 (24), 6627-6636 (2006).</li>
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</ol>

すべての操作はバイオセーフティーレベル2部屋で行われました。動物プロトコルは、バレンシア大学の倫理委員会によって承認され、すべての欧州指令63分の2010 / EUに準拠してありました。

LVSは大人のNSC 16,18の遺伝的改変のための他のウイルスシステムに比べて重要な利点を提供します。 V-SVZニッチへのレンチウイルスの定位配信は、ラベルを付け、そのような複数の細胞分裂後に希釈されたBrdU、またはレトロウイルスなどの他の一般的に使用される方法の限界を克服B1-のNSCを分割まれにトレースし、細胞のみを標的とするための効率的な方法を表し、それは、アプリケーションの瞬間に増殖しています。 LVSは、一緒にアデノウイルスで、独立して自分のサイクリング状態の細胞に感染することができ、これは大人のNSC 16,18のように、このような上衣細胞としてではなく、サイクルを行う、又は比較的静止状態であるので、めったに分裂しない細胞に特に関連しています。導入遺伝子は安定して高効率形質導入された細胞およびその子孫の形態学的特徴を可能と統合し、表現になります。 NSCは、隣接細胞と専門性の高いニッチに抱いていますこのような上衣または血管細胞、ならびに独自の細胞の子孫は、このように厳密に調節された環境2を作成します</su...

マウス心室脳室下帯（V-SVZ）、線条体に面した側脳室の壁には、嗅球の持続的な生産における前駆細胞の複製と分化の結果の中で継続的なプロセス（OB非常にアクティブな胚領域であり、 ）介在ニューロンと脳梁オリゴデンドロサイト1。 、星状細胞抗原グリア線維性酸性タンパク質（GFAP）を発現し、このようなネスチン、Id1のような細胞マーカー幹;これらの細胞の生涯の生成は、神経幹細胞（別名B1細胞のNSC）のこの領域に存在することによってサポートされているように見えます及びSox2の2。 GFAP発現B1細胞は、トランジット増幅前駆細胞転写がDLX2（遠位レスホメオボックス2）及びASCL1（哺乳類achaete-schuteホモログ1）を係数表現（TAP）細胞（C細胞）を、生成し、それらが生じる前に、急速に数回を分割神経芽細胞（A細胞）またはoligodendroblasts 3を移行します。新たに生成されたproliferative神経芽細胞は、彼らが粒状と差別化抑制性などの糸球体層に統合OBへの吻側渡り鳥ストリーム（RMS）を形成し、前方に移行します。移行若いoligodendroblastsは、彼らが局所的に分割または成熟ミエリン形成オリゴデンドロサイト1,4に分化していき未熟NG2陽性細胞となるCC、に移動。 胎児の放射状グリア細胞に由来B1細胞は、前任者の細長い偏光形態を保持し、それらのニッチで専門性の高い関係を示します。彼らはどのラインアップ心室とV-SVZニッチを灌漑血管のネットワークを上衣の間にまたがります。 multiciliated ependymocytes間のB1細胞のインターカレーションの小さな頂端プロセスおよび単一の非運動性の一次繊毛で終了し、その基礎プロセスはb。で、このニッチな結末を灌漑平面血管叢に近づくために長い距離を拡張し、一方、叢毛細血管2,5-8のASALラミナ。 無傷のV-SVZニッチでも、GFAP +である非神経性アストロサイトからB1-のNSCを区別するための最も確実な方法は、全マウント心室側壁の準備と3次元共焦点顕微鏡によるそれらの分析の後に基づいています各繊毛5,8の程度を標識するcilial基礎体またはアセチル化αチューブリンのマーカーとして細胞膜を描写するために、βカテニンを薄B1-NSC頂端プロセスにラベルを付け、およびγチューブリンのいずれかのためにGFAPの免疫染色。心室の表面からこれらの全マウントの観察は、B1及び上衣細胞は、1つまたは複数のGFAP + B1細胞の頂端uniciliatedプロセスはmulticiliated上衣細胞のロゼットで囲まれている中で「風車」5に配置されていることが示されています。 B1細胞の特徴的な形態は、実験的証拠と相関する私NSCを2,6,9-11に作用する可溶性シグナルの調節源を構成している血管/内皮細胞ndicatingおよび脳脊髄液（CSF）を心室。心室表面では、上衣とB1細胞が関与する同型と異apico-横相互作用がタイトジャンクションが含まれており、接合部5,12をアドヘレン。また、例えば、N-カドヘリン及びV-CAMとしてB1と上衣細胞との間の接合部複合体に関与する接着分子は、高度に組織化されたV-SVZニッチにおけるB1の位置決めだけでなく、それらの静止12だけでなく、調節することが示されています、13。上衣-B1細胞単層は、CSFから水および小分子の調節されたフラックスを可能にする拡散バリアとして機能するように見えますが、大きなタンパク質10,11の間の通路を制限します。実験的証拠は、一意に位置付けB1細胞頂端繊毛は、CSF 2に存在するポリペプチドシグナリングのセンサーとしての役割を果たし得ることを示しています5-7。上衣細胞はまた、それ自体が、NSCの挙動14,15の調節における役割と可溶性および膜結合信号の源です。 例えばブロモデオキシウリジン（BrdUの）、またはレトロウイルスなどの追跡可能なヌクレオシドは、広くインビボでのNSCを含む前駆細胞を標識するために使用されてきました。 BrdUの信号が繰り返される細胞分裂およびレトロウイルスを介して希薄しかし、これらの方法は、長期的な運命のトレースには最適ではない優先的に一過性に形質導入16,17のための細胞増殖のそれらの要件のために増幅する細胞を標的とするように見えます。 B1-NSCのは、主に静止状態であり、その近隣の上衣細胞は、生理的条件3の下で分裂したことがないようにニッチなコンポーネントとの相互作用を含む、in vivoで NSCの生理機能を調べるために、稀に分割していない細胞を標識し、追跡する方法を確立することが重要です。ここでは、レンチウイルスベクター（LVの）は、高効率遺伝子マークを可能にすることを示していまする最も合理形質導入すると、細胞周期に依存しない方法で標的細胞のゲノム中に統合するそれらの能力のために、成体のNSCおよび非分裂上衣細胞の長期的修飾、。さらに、私達は配達、特に上衣細胞を形質導入するウイルス力価のヘルプのルートが、B1ない細胞は、それによってのNSCにニッチに依存し、上衣効果の分析を可能にする方法を示しています。

<table><tbody><tr><td>パート1:in vivo送達用のLVの生成</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>機器:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>超遠心分離機</td><td>ベックマン・コールター</td><td>オプティマXL-100K</td><td></td></tr><tr><td>超遠心ローター</td><td>ベックマン・コール</td><td>ターSW-28</td><td></td></tr><tr><td>超遠心分離機ローター</td><td>ベックマン・コールター</td><td>SW-55</td><td></td></tr><tr><td>超遠心チューブ&nbsp;</td><td>ベックマン・コールター</td><td>358126</td><td>25 mm x 89 mm</td></tr><tr><td>超遠心チューブ&nbsp;</td><td>ベックマン・コールター</td><td>326819</td><td>13 mm x 51 mm</td></tr><tr><td>超遠心分離機用アダプター</td><td>ベックマン・コールター</td><td>358156</td><td></td></tr><tr><td>6 ウェルプレート</td><td>SPL</td><td>PLC-30006</td><td></td></tr><tr><td>24 ウェルプレート</td><td>SPL</td><td>PLC-30024</td><td></td></tr><tr><td>10 cm ディッシュ</td><td>SPL</td><td>PLC-20101</td><td>100 x 20 スタイル</td></tr><tr><td>FACS チューブ</td><td>アフォラ</td><td>DE400800</td><td>12 mm x 75 mm、5 ml</td></tr><tr><td>カップ滅菌FACS</td><td>フィルターBD</td><td>340626</td><td>30 &micro;m</td></tr><tr><td>ニトロセルロースフィルター</td><td>ミリポア</td><td>SCGPU05RE</td><td>0.22 &mu;m&nbsp;</td></tr><tr><td>フローサイトメーター</td><td>BD</td><td>LSR Fortessa</td><td>Blue laser 488 nm</td></tr><tr><td>Steritop filter</td><td>Biofil</td><td>FPE-204-500&nbsp;</td><td>0.22 以上m</td></tr><tr><td>試薬:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pMDLg/pRRE plasmid&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>#12251</td><td>コアパッケージングプラスミド</td></tr><tr><td>pRSV.REV プラスミド&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>#12253</td><td>コアパッケージングプラスミド</td></tr><tr><td>pMD2G プラスミド&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>#12259</td><td>エンベローププラスミド</td></tr><tr><td>pRRL-SIN-PPT.PGK.EGFP.Wpre プラスミド&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>#12252</td><td>トランスファーベクタープラスミド</td></tr><tr><td>ダルベッコ改変イーグル培地&nbsp;</td><td>Biowest</td><td>L0101-500</td><td>HeLa細胞培養用</td></tr><tr><td>Iscove's Modified Dulbecco's Medium&nbsp;</td><td>Life technologies</td><td>12440-053</td><td>293T細胞培養用</td></tr><tr><td>Tris-EDTA (TE)</td><td></td><td></td><td>Tris-HCl (sigma, T5941), 0.1 mM EDTA (sigma, E5134), pH 7.6,&nbsp;DNAse/RNAseフリー、0.2 &micro;m滅菌ろ過された</td></tr><tr><td>2x HBS</td><td></td><td></td><td>0.28 M NaCl(Sigma、S7653)、0.05 M HEPES(Sigma、H7523)、1.5 mM無水Na2HPO4 (Sigma、S7907)のdH2O(できればMilliQではない)でろ過します。NaOH溶液(Calbiochem, 567530)でpHを7.0に調整します。</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清(FBS)</td><td>Biowest</td><td>S181B-500</td><td>100倍のストック溶液で、最終濃度10倍のHeLaおよび293T培地を調製するために使用されます。</td></tr><tr><td>Glutamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513-100</td><td>200 mM のストック溶液で、最終濃度 6 mM の HeLa および 293T 培地の調製に使用されます。</td></tr><tr><td>ピルビン酸ナトリウム</td><td>ライフテクノロジー</td><td>11360-039</td><td>100 mMのストック溶液で、最終濃度1 mMのHeLaおよび293T培地を調製するために使用されます。</td></tr><tr><td>GlutaMAX Supplement</td><td>Life technologies</td><td>35050-061</td><td>最終濃度1%の293T培地の調製に使用。</td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4458</td><td>ストック溶液には、5,000 単位/ml のペニシリンと 5 mg/ml のストレプトマイシンが含まれています。HeLaおよび293T培地の最終濃度1%で調製するために使用されます。</td></tr><tr><td>トリプシン-EDTA</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ25200-056</td>フェ<td>ノールレッドと、2.5gの豚トリプシンと0.2gのEDTA 4Na/L HBSSが含まれています。</td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水&nbsp;(PBSの)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1408</td><td>塩化カルシウムおよび塩化マグネシウム不使用、10倍、液体、滅菌ろ過済み、細胞培養に適しています。細胞培養グレードの水で1x PBSを調製するために使用したストック溶液。</td></tr><tr><td>ポリブレン(臭化ヘキサジメトリン)&nbsp;</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>H9268</td><td>パウダー。dH<sub2O</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒドEMグレード16%</td><td>EMサイエンス</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company<</td><td>strong>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>パート2:SEZ固有または側脳室へのLVのステロタキシック注射.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>機器:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vernier定位固定装置</td><td>NeuroLab、ライカ</td><td>39463001</td><td></td></tr> <tr><td>http://www.leicabiosystems.com/ カニンガムマウスおよび新生児ラット</td><td>アダプターNeuroLab、ライカ</td><td>39462950</td><td></td></tr><tr><td>シリンジ</td><td>ホルダーKDサイエンティフィック</td><td>KDS-311-CE</td><td></td></tr><tr><td>33ゲージシリンジ</td><td>ハミルトン</td><td>P / N&nbsp;&nbsp;&nbsp;84851/00</td> <td>#85RN</td></tr><tr><td>電動ドリル</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>98096</td><td></td></tr><tr><td>サーマルブランケット</td><td>Ufesa</td><td>AL5512 / 01</td><td>230-240 V、100-110 W、タイプC_AL01</td></tr><tr><td>シェーバー&nbsp;</td><td>Jata</td><td>MP373N</td><td>モデル:美しさ、3 V、300 mA、タイプHT-03。</td></tr><tr><td>試薬:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>メデトミジン</td><td>エステベ</td><td>DOMTOR&nbsp;</td><td>1 mg / mlの商業溶液。</td></tr><tr><td>ケタミン</td><td>メリアル</td><td>イマルゲン 500&nbsp;</td><td>50 mg / mlの商業溶液</td></tr><tr><td>メデトミジン/ケタミン混合物</td><td></td><td></td><td>生理食塩水中に、最終濃度0.2 mg / ml希釈のメデトミジンと最終濃度15 mg / mlのケタミンの作業混合物を準備します。.体重1kgあたり0.5-1mgのメデトミジンと体重1kgあたり50-75mgのケタミンの最終濃度を得るために、容量を注入する麻酔として使用します</td></tr><tr><td>ブトルファノール</td><td>ファイザー</td><td>トルブゲシック</td><td>10mg/mlのストック溶液 生理食塩水で1mg/mlの鎮痛剤として使用されます。</td></tr><tr><td>アティパメゾール</td><td>エステベ</td><td>アンチセダン</td><td>ストック溶液を5 mg / mlで、生理食塩水の最終濃度0.5 mg / mlで麻酔から出ます。.</td></tr><tr><td>0.9%生理食塩水</td><td>ブラウン</td><td>13465412</td><td></td></tr><tr><td>Histoacryl</td><td>Braun</td><td>1050052</td><td>局所皮膚接着剤</td></tr><tr><td>ハイドロゲル</td><td>クリア H2O</td><td>70-01-5022</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34120</td><td>11 cm x 21 cm</td></tr><tr><td>漂白剤/Virkon</td><td>デュポン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>サージカルマーカーペン</td><td>Staedler</td><td>313-9</td><td>パーマネント ルモカラー</td></tr><tr><td>オックスルミック ローション &nbsp;</td><td></td><td>SICCAFLUID</td><td>0.5 g /ドーシス、カルボマー974P</td></tr><tr><td>ポビドンヨードベ</td><td>タジン</td><td>694109.6</td><td>10%ポビドンヨード</td></tr><tr><td>名前</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>パート3:組織学的分析.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>設備:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>自動蠕動ポンプ</td><td>Cole-Parmer Inst. Co.</td><td>HV-07524-55</td><td>Masterflex L/S 可変速エコノミードライブ、1.6-100 rpm、230 V</td></tr><tr><td>ポンプヘッド</td><td>Cole-Parmer Inst. Co.</td><td>HV-07518-00</td><td>Masterflex L / S Easy-Loadポンプヘッド(精密チューブ用)。PSFハウジング、CRSローター</td></tr>、<tr><td>シリコンチューブ、</td><td>コールパーマー研究所</td><td>HV-96410-16</td><td>プラチナ L/S 16</td></tr><tr><td>頭皮静脈セット</td><td>Vygon V-green</td><td>70246.05T</td><td>25 G, 30 cm チューブ長</td></tr><tr><td>ビブラトーム</td><td>ライカ</td><td>VT1000</td><td></td></tr><tr><td>共焦点顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td>FluoView FV10i</td><td></td></tr><tr><td>ホットプレート</td><td>Tehtnica</td><td>SHP-10</td><td></td></tr><tr><td>試薬:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝液 (PB)</td><td></td><td></td> <td>0.2 M PB: 0.2 M Na2HPO4 (Sigma, S7907) および 0.2 M NaH2PO4 (Panreac, 141965.1211) in dH2O, pHを7.2-7.4に調整</td></tr>します <tr><td>パラホルムアルデヒド(PFA)</td><td>Panreac</td><td>141451.1211</td><td>毎回新鮮に準備します。dH2Oを最大55＆ndashまで加熱します。60度;Cは、ヒュームフードに設置したホットプレートを用いて、攪拌しながらPFA粉末を注ぎ、8%溶液を得る。溶液は白く濁り、PFAは溶けにくいです。溶液が透明になるまで、1N NaOHを一滴ずつ加えます。冷まし、Whatman紙でろ過し、0.2 M PB相当の量を追加します。</td></tr><tr><td>食塩水</td><td></td><td></td><td>0.9% NaCl dH2O</td></tr><tr><td>瞬間接着剤</td><td>LOCTITE</td><td>767547</td><td></td></tr><tr><td>アジ化ナトリウム</td><td>Panreac</td><td>122712.1608</td><td></td></tr><tr><td>グリシン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7126-100</td><td></td></tr><tr><td>正常なヤギ血清</td><td>ミリポア</td><td>S30-100</td><td></td></tr><tr><td>トリトン X-100</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>T9284</td><td>洗剤</td></tr><tr><td>抗GFPウサギ抗体</td><td>ROCKLAND</td><td>600-401-215</td><td>1:500希釈で使用</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Donkey 抗ウサギIgG(H+L)抗体</td><td>分子プローブ</td><td>A-21206</td><td>1:750希釈で使用</td></tr><tr><td>6-Diamindino-2-phenylindole dihydrochloride hydrate (DAPI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td>蛍光核染色。ddH2Oで2 mg/mlで使用し、4°Cの暗所に保管してください。</td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>EM Sciences</td><td>17984-25</td><td>蛍光製剤用封入剤</td></tr></tbody></table>

神経の分析のための成体マウスのv-svzにおける細胞の安定的かつ効率的な遺伝子改変幹細胞自律と非自律効果

Stable and Efficient Genetic Modification of Cells in the Adult Mouse V-SVZ for the Analysis of Neural Stem Cell Autonomous and Non-autonomous Effects

比較的静止体性幹細胞は、大部分の成体組織における生涯細胞の再生をサポートしています。成人の哺乳類の脳内の神経幹細胞は、2つの特定の神経因性ニッチに制限されている：海馬における歯状回および心室-脳室下帯の顆粒下ゾーン（V-SVZを、また、上衣ゾーンまたはSEZと呼ばれる）の横の壁に心室。長期幹細胞における所望の導入遺伝子の発現およびそれらの派生子孫を生じる（ すなわち、哺乳動物の脳のもの）成体幹細胞集団のためのin vivo遺伝子導入戦略の開発は、現在、生物医学及びバイオテクノロジー研究において重要なツールです。ここでは、直接in vivo法は、LVのによる細胞周期に依存しない感染症およびV-SVZニッチの専門性の高い細胞構築を活用して成体マウスV-SVZ細胞の安定な遺伝的改変のために提示されています。具体的には、現在のプロトコルが関与しますV-SVZ自体のいずれかに特異的な導入遺伝子発現カセットをコードする空のLV（対照）またはのLVの注入は、上衣のターゲティングのために、in vivoでのニッチ内の細胞のすべてのタイプのターゲティングのために、または側脳室の内腔に、よ細胞のみ。発現カセットは、次にできるよう、またのLVによってコード導入された細胞と蛍光タンパク質のゲノムに組み込まれている標識された細胞とにおける細胞自律非自律、ニッチ依存効果の分析のための形質導入された細胞の検出、それら子孫。

LV媒介遺伝子送達系は、増殖、遊走および分化の間にそれらの追跡及び遺伝的改変を可能にする、成体マウスのV-SVZにおける細胞の in vivo形質導入の長期に使用することができます。感染および発現は、非常に有効であり、含まれるレポーターの発現により他の非感染細胞の間で容易に区別することができる多数の細胞を得ました。我々は、これまで広範に発現ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーターにより駆動されるGFP蛍光レポーターで形質導入された細胞を可視化しているが、他のレポーターまたはタンパク質タグを使用することもできます。私たちは日常的にGFPに対する抗体を使用する代わりに、それはより強い蛍光シグナルを生成するようなレポーター発光の直接検出に依存します。また、脳は、新鮮な解剖し、固定液に浸漬するがはるかに良い結果がtranscardial灌流することによって得られることができます。 精製、濃縮されたベクターストックはゆっくりと私です線条体とその限界にV-SVZに定位指導の下njected（ 図2a、b）に 。二ヶ月注入後、...

ここでは、神経幹細胞および/またはそれらに隣接する上衣細胞の長期的な遺伝子改変のためのレンチウイルス粒子の使用に基づく手順を、成体の心室-心室下神経原性ニッチにおける長期的な遺伝子組み換えのために説明すると、神経幹細胞に対する細胞の自律的および非自律的な、ニッチ依存性の影響を別々に分析することができます。

神経の分析のための成体マウスのV-SVZにおける細胞の安定的かつ効率的な遺伝子改変幹細胞自律と非自律効果

Relatively quiescent somatic stem cells support life-long cell renewal in most adult tissues. Neural stem cells in the adult mammalian brain are ...

この手順の全体的な目的は、特定のDNAコンストラクトを担う高タイターのレンチウイルス粒子を少量、成マウスの脳室下帯（ventricular-subventricular zone）に導入してすべての細胞種に感染させるか、あるいは側脳室に導入して上衣細胞のみに影響を与えることです。この手法は、成体脳室下帯ニッチの神経幹細胞と、その隣接する上衣細胞との相互作用に関する重要な疑問を解決するのに役立ちます。この技術の主な利点は、レンチウイルスベクターが細胞周期に依存せず標的細胞のゲノムに組み込まれるため、ほとんど分裂しない細胞においても長期的な発現が可能であることです。本手順の実演を補助するのは、大学院生のBeatriz Martです。

stable-efficient-genetic-modification-cells-adult-mouse-v-svz-for

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

体性幹細胞の増殖を制御することは、彼らの研​​究と治療における使用を妨げる大きな要因となっている。ここでは、一時的にマウス脳で生成されたニューロンの数を増やすために使用することができます開発と成人期における神経幹細胞の膨張を制御するためのシステムを説明します。...

によって胚および成体神経幹細胞の拡大<em&gt;子宮内</em&gt;エレクトロポレーションまたはウイルス定位注射

出典: Porlan, E., et al.神経幹細胞の自律的および非自律的効果の解析のための成体マウスV‐SVZの細胞の安定的で効率的な遺伝子改変。J. Vis.

マウスモデルにおける安定した遺伝子組み換えのためのウイルスの定位注射

ウイルスベクターは、標的遺伝子操作が可能になります。我々は、脊髄後角へのウイルスベクターの定位注射、一次体性感覚求心性および中枢神経系の神経細胞間のシナプスの接触の著名なサイトを使って、条件付き遺伝子発現やマウス脊髄におけるアブレーションのための方法を示しています。...

マウス脊髄における条件遺伝子操作のためのウイルスベクターの定位注射

ここでは、脳室下帯と個々の成体マウスの歯状回から、付着性単層またはニューロスフェアのいずれかとして、神経前駆細胞培養を同時に生成するための詳細なプロトコルを記述します。...

マウスを一回、二つの文化：個々のマウスの二つの神経原性のゾーンから成体神経幹細胞の単離および培養

私たちは、成体マウスの脳の脳室下ゾーン(SVZ)から神経幹細胞(NSC)とその子孫を単離するための蛍光活性化細胞選別(FACS)ベースの方法を報告します。蛍光ユビキチン化細胞周期インジケーター(FUCCI)トランスジェニックマウスに適用することで、ライブイメージングによる細胞周期の進行を研究することができます。...

セル成体マウス脳室下帯から神経幹細胞および前駆細胞の選別とその細胞周期ダイナミクスのライブイメージング

新生児マウス脳の線条体にマイクロインジェクション試薬は自家製頭固定デバイスに定位手術のプロトコルについて述べる。この手法では、新生児マウス脳の特定の領域の神経細胞で遺伝子操作ことができます。...

新生児マウス脳の線条体細胞の遺伝的操作の定位手術

ここでは、胚性幹細胞を用いた遺伝子改変マウスモデル、特に大型DNAノックイン(KI)の開発のためのプロトコルを紹介します。このプロトコルは、CRISPR/Cas9ゲノム編集を使用して調整されているため、従来の相同組換えを介した直鎖状DNAターゲティング法と比較して、KI効率が大幅に向上します。...

CRISPR/Cas9を介した胚性幹細胞における高効率遺伝子ターゲティングによる遺伝子操作マウスモデルの開発

ここでは、生きたラットの脳から神経幹細胞およびオリゴデンドロサイト前駆細胞を単離する方法について、実験的に詳細に紹介します。これにより、健康を損なうことなく、同じ動物からこれらの細胞を複数回収集できます。...

生きたラットからの神経幹細胞およびオリゴデンドロサイト前駆細胞の単離のための「脳搾乳」法

ここでは、成体マウス脳室下ゾーンから単離された拡大神経幹細胞(NSC)における遺伝子導入効率を高めるように設計されたヌクレオフェクションシステムについて説明します。この知見は、この方法が神経幹細胞における遺伝子摂動を大幅に改善し、従来のトランスフェクションプロトコルの有効性を上回り、細胞の生存率を向上させることを示しています。...

成体マウス脳室下領域からの神経幹細胞の単離、増殖、およびヌクレオフェクション

ここでは、化学的に再プログラムされた幹細胞をドーパミン作動性前駆細胞に分化させ、パーキンソン病のマウスモデルに移植し、移植された細胞の成功した統合と機能的有効性を確認するために、これらの細胞を正確なニューロン調節を達成するためのプロトコルについて説明します。...

神経変性疾患の治療における再プログラム幹細胞由来前駆細胞における化学遺伝学的制御

学ぶレンチウイルス粒子を用いた成体マウスV-SVZ神経幹細胞の長期遺伝子改変法。細胞自律性とニッチ依存性効果を解析し、神経発生メカニズムの解明と再生医療への応用を目指す。

神経の分析のための成体マウスのV-SVZにおける細胞の安定的かつ効率的な遺伝子改変幹細胞自律と非自律効果

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