地磁気（Gmfと）と植物の進化：Gmfと逆転の影響に関する調査を

本手順の全体的な目的は、電源で制御されるホルツコイルを用いて、地磁気（GMF）の逆転を再現することです。最終的に、GMFの逆転が植物の形態と遺伝子発現に影響を与えることが示されます。この手法は、地球磁場の逆転が植物の進化と適応に役割を果たした可能性があるかなど、植物進化分野における重要な疑問に答えるのに役立ちます。

本手法の主な利点は、多くの反復試行が可能で、かつすべての条件を精密に制御して育成できる単純なモデル生物を用いて、弱磁場による潜在的な生物学的影響を試験できることです。本手順の実演は、私の研究室の指導学生であるAlberto Bocco、および私の研究室の博士課程学生であるKiara aa、そして私のグループの准教授であるCIA Berteaが行います。

まず、3組のヘルムホルツコイルに接続されている3台のDC電源をオンにし、3軸コイル内にプローブが挿入されている3軸磁力計の電源を入れます。コンピューターを起動し、3軸磁力計からデータを収集するための磁力計ソフトウェアを立ち上げます。また、電源装置は制御のためにAGPIB接続経由でコンピューターに接続されています。

テキストプロトコルに従い、磁場ベクトルを反転させて目的の磁場を発生させるように電源の電圧を設定します。カルシウムヒポクロライト溶液を用いて、25～28 °Cで10～12分間、連続的に振盪しながら滅菌処理した Arabidopsis thaliana ecotype Columbia-0 の種子を1.5 mLチューブに入れます。その後、種子を80% ethanolで2回すすぎ、続いて100% ethanolで洗浄します。

最後に、滅菌蒸留水で洗浄します。テキストのプロトコルに従い、凝固させる前にMurrah ShigaおよびSCOG改変培地を1リットル調製します。四角形ペトリ皿1枚あたりに培地80 millilitersを注ぎ、1枚のプレートに30粒の滅菌種子を播種します。

次に、プレートをパラフィンフィルムで密封します。発芽を促進し同期させるため、プレートを暗所、4 °Cで2日間水平に置いた状態で春化させます。春化後、ナトリウムランプのスポットライトに青色のゼラチンフィルムを被せ、ランプの赤色成分を低減させる準備をします。

ペトリ皿を通常または反転したGMFに曝露させる準備をします。22 °Cに制御された環境下で、種子を垂直方向に配置して曝露させます。並行して、三軸コイルの外側および内側の両方で実験を行います。

8時間の暗期と16時間の明期の光周期条件下で管理します。処理後、シャーレの写真を撮影し、根の長さと葉面積を算出します。まず、シャーレの一辺を測定します。

次に、Image Jソフトウェアでシャーレの画像を開き、直線オプションを使用して、シャーレの端を正確に横切る線を描きます。「Analyze」メニューから「Set Scale」を選択し、「Known distance」ボックスに実際の距離を入力します。その後、長さの単位を入力してください。

最後に、グローバルオプションをクリックし、根の長さのすべての測定で設定を有効にします。フリーハンドツールを使用して、根の形状に沿って慎重にトレースしてください。「analyze」メニューの「measure」オプションを使用して、長さを測定します。

写真内のすべての根の測定を継続し、後の統計分析のためにファイルを保存します。画像メニューの葉面積測定については、「調整（adjust）」オプションを使用し、続いて「カラーしきい値（color threshold）」で個々の葉を選択します。その後、解析メニューで「粒子の解析（analyze particles）」を選択し、個別の測定値を統計分析用に保存します。地上部30本と根30本をそれぞれ回収し、直ちに液体窒素で凍結させます。

その後、乳鉢と乳棒を用いて液体窒素中で摩砕し、テキストプロトコルに記載されている手順に従って全RNAを単離します。すべての実験は、内部ローディング標準としてROXを含むCyber Green Oneを用いたリアルタイムシステムで実施し、反応は25 µLの混合液で行います。テキストプロトコルに記載されているプライマーを使用し、ゲノムDNAの混入を監視するための逆転写なしコントロール（non-reverse transcription controls）およびテンプレートなしコントロール（non-template controls）を含めてください。各アニーリングおよび伸長相の後に蛍光を測定します。

2つの虫眼鏡のアイコンは、解離曲線などの収集されたデータを表しています。解析および設定画面に移動し、実験の解離セグメント中に収集されたデータセットが選択されていることを確認してください。すべてのランの解析において、サーマルプロファイルに解離セグメントを含めることで、55から95 degrees Celsiusまでの融解曲線解析を実行します。

結果タブからアクセスできる解離曲線スクリーンを使用します。これにより、解離プロファイルを確認できます。すべての増幅プロットは、リアルタイムPCR装置のソフトウェアで解析してください。

CT値を算出するため、最適なハウスキーピング遺伝子のレベルを用いて、相対的なRNAレベルのキャリブレーションと標準化を行います。結果タブから増幅プロット画面にアクセスしてください。解析、選択、およびセットアップ画面を使用して、データを解析するランプ部またはプラトー部を選択します。

次に、コマンドパネルの蛍光メニューから、ベースライン補正済みの正規化蛍光（baseline corrected normalized fluorescence）を選択します。結果タブからプレートサンプル値画面にアクセスし、サンプリングされたウェルのCT値を表示します。

4種類の異なるリファレンス遺伝子を用いて、リアルタイムPCRの結果を標準化します。解析ソフトウェアを使用して上位にランクされた遺伝子を選択し、最も安定した遺伝子を標準化に使用してください。入力データをExcelシートに簡潔にまとめ、最初の列に遺伝子名を、最初の行にサンプル名を記載してください。

次に、メニューバーから解析ソフトウェアを選択します。ダイアログボックスを使用して、入力データを選択してください。続いて、「sample names」、「gene names」、「simple output only」のフィールドにチェックを入れます。

「go」ボタンをクリックします。解析を実行し、最も上位にランクされた遺伝子を、最も安定的に発現している候補遺伝子として選択します。10日間の曝露後、対照植物は、GMF反転条件下に10日間曝露された植物と比較して、根の長さが有意に長く、小葉の展開が進んでいることが示されました。GMFの反転による影響は、CRUCIFER IN THREE COPPER TRANSPORT PROTEIN 1およびREDOX RESPONSIVE TRANSCRIPTION FACTOR 1を含む、すべての試験対象遺伝子の遺伝子発現の劇的な変化でした。バーは標準誤差を示し、アスタリスクは反転GMF条件および通常GMF条件に曝露された植物間の有意差を示しています。

GMF（地磁場）の反転による影響では、シュートの遺伝子発現に有意な変化は見られませんでした。しかし、栽培した植物の根の遺伝子発現においては、劇的なダウンレギュレーションが観察されました。逆GMF条件下で、これらの遺伝子にはthal、aate peroxidase、aate peroxidase、鉄スーパーオキシドディスムターゼ1種、N-A-D-P-H 1種、呼吸バーストオキシダーゼタンパク質、およびカタラーゼ3が含まれます。

この手法を習得すれば、適切に実施することで、必要な実験に応じて数分から数日単位で操作することが可能です。このビデオを視聴することで、地磁気の反転または変更の方法、および曝露させた植物に対する形態学的・遺伝学的研究の実施方法について十分な理解が得られるはずです。この手順を行う際は、ヘルメットコイルで囲まれた領域からあらゆる磁場発生源を取り除くことが重要です。

ヘルメットコイルおよびそのジェネレーターが熱や振動を発生させないことが重要です。最終的なデータが記録されるまで、研究者は磁場曝露条件について盲検化される必要があります。この手法により、磁気受容の研究者は、磁場が植物の進化、動物の行動およびナビゲーション、ならびにヒト細胞株に及ぼす影響を探索することが可能になりました。

将来的には、磁場の変化が宇宙環境における植物の成長にどのような影響を与えるかを評価するため、微小重力下で同様の研究を行うことを希望しています。弱磁場を発生させるシステムを用いた作業に危険はないと考えられています。しかし、通常の予防措置を講じる必要があり、ヘルムホルツコイル対用の電源装置などの機器を使用する際は、有資格の電気技師に助言を求めてください。