Name: 地磁気（Gmfと）と植物の進化：Gmfと逆転の影響に関する調査をシロイヌナズナ開発と遺伝子発現 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-30T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 4 s
Description: 学ぼう、ヘルムホルツコイルを用いて地磁気を逆転させ、シロイヌナズナの形態と遺伝子発現を解析する方法。植物の進化と適応における磁場の役割を解明する実験手法です。

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この研究は、イタリアのトリノ大学の生命科学・システム生物学部からのMEMへの助成金によって支援されました。著者らは、いくつかの実験における技術支援について、G. Gnaviに感謝しています。CTRは、ウェルカムトラストと王立協会(助成金番号098436/Z/12/Z)から資金提供を受けています。

三軸コイルの1設定 メモ ：図1は、GMFを逆転するために使用される三軸コイルを示しています。 <ol><li>そのプローブ三軸コイルに挿入された3軸磁力計、オンにします。 </li><li>コンピュータの電源をオンにし、データが3軸磁気センサから収集することを可能にする磁力計のソフトウェアを起動します。 </li><li> GMFの大きさを計算するために、磁力によって報告された部品の値を使用してください。例えば、磁力計値で：BXは6.39μTを=で= 36.08μT、Bzが= 20.40は、以下の式を使用して、μT41.94の電界強度を計算するμT：B = B GMF + B の追加 、ここでB の追加 =（Bxを2 + 2 +のBz 2）1/2（ すなわち、この例では 41.9μT。） </li><li> 3 couplに接続された各1：（0-8V / 5Aおよび0-20V / 2.5A、50Wのデュアルレンジ）3つのDC電源をオンにしますヘルムホルツコイルのESとGPIB接続（ 図1B）を介してコンピュータに接続されています。 </li><li>電源のセ​​ット電圧が反転磁界ベクトルと所望の磁場を発生させます。例えば、ステップ1.3で、ここでは説明計装のコイルサイズであるB GMFと、V新しい結果Bを生成するために、X = 0.00 V、V yを= 30.52 V、VのZ = 0.00 Vに電圧を設定します= B GMF + B 三軸コイル =（6.38、-36.08、20.39）μTは。 すなわち、BのGMFと同じ大きさで新しいフィールドが、異なる方向を指しています。 </li><li> 1.3で説明した手順を使用して、磁力計ソフトウェアで新しいフィールドを確認してください。 </li><li>通常の両方に植物をさらすと、セクション2で説明したようにペトリ皿を使用して、GMF条件を逆転させました。 </li><li>等しいフィールドの大きさを維持することによって、偽曝露実験を行います| B GMF |そして、維持垂直GMFと同等のフィールドの構成要素が、フィールド反転状態に比べて三軸コイル内の等しい電流と磁場の水平成分の方向（ すなわち、「北、東または西」）を変更します。 1.5で説明したように、コイルの電圧を変更することによってこれを行います。 注：この偽の露出は、潜在的な微妙な加熱またはいずれかのコイル自体またはコイルを制御するために使用される電子機器からの振動の影響を除外。 </li><li>人員実験の残りの部分を実行し、および/またはデータを解釈するから盲目にフィールド条件を適用することにより、二重盲検試験を実行します。 </li></ol>植物材料と植物生育の条件の作製<ol><li> 5％（w / v）の次亜塩素酸カルシウム溶液および0.02％（v / v）のトリトンX-で処理することによって滅菌1.5 mlのチューブ表面にその後シロイヌナズナ 、コロンビア生態型0（COL 0）の種、場所を使用連続振とうしながら25〜28℃で10〜12分間、80％エタノール（エタノール）、100。その後、100％エタノールで洗浄し、80％EtOHで二回洗浄し、最終的に滅菌蒸留水で洗い流してください。 </li><li>追加することで、メディアを変更しムラシゲ・スクーグ22（MS）の1リットルを準備し、MSの2.297グラム（0.5×MS基礎塩混合物）、10gのスクロース、1 L、KOHでpH調整5.8から6.0への脱イオン水を上に。 20分、120℃のために寒天、オートクレーブの16グラムを追加します。 </li><li>固化する前に、各（120×120ミリメートル2）正方形のペトリ皿に培地80ミリリットルを注ぎます。プレートに30無菌種をまく、その後、ワックス状フィルムでプレートを密封します。 </li><li>発芽を増強し、同期させるために4℃で2日間暗闇に水平プレートを開花結実を促進する、その後、正常またはGMFを逆のいずれかにペトリ皿を公開します。 </li><li>三軸コイル内部の3軸コイルの外側の両方の並行実験で垂直位置で22℃の気候制御された環境で種子を公開ナトリウム蒸気ランプを使用して、8時間の闇と16時間の光の光周期スケジュール、下の（220×10 -6のEメートル-2秒-1）。ランプの赤色成分を低減するためにスポットライトの青のゼラチンフィルムを使用してください。 </li><li>通常の（コントロール）と逆転（治療）の両方GMF条件にRNA抽出前に10日間の植物を公開します。 </li><li>露光後、ペトリ皿の写真を撮ります。 </li><li>根長と葉面積を計算するためにImageJソフトウェアを使用してください。 <ol><li>簡単に言うと、その後、ペトリプレートの画像を開いて、正確にプレート側を横切る線を引くための「ストレート」ラインオプションを使用して、ペトリプレートの側面を測定します。 </li><li> 「分析」メニューの「設定スケール」を選択し、「既知の距離」ボックス（例えば、120ミリメートル）は、長さ（mm）の単位を挿入実際の距離を挿入します。最終的にはすべての測定の設定が利用できるようにする「グローバル」オプションをクリックします。 </li><li>カンガルーのためにトン長、フリーハンドツールを使用して慎重にルートの形状に従ってください。 「分析」メニューの「測定」オプションを使用して長さを測定します。画像内のすべての根を測定し、さらに統計分析のために、ファイルを保存し続けます。 </li><li>葉面積については、「イメージ」メニューから調整オプションし、「カラーしきい値」を使用します。個々の葉を選択し、「分析」メニューの「粒子を分析する」を選択します。統計分析のための個々の測定値を保存します。 </li></ol></li></ol> 3. シロイヌナズナ全RNA抽出、定量的リアルタイムPCR（定量PCR）反応条件とシロイヌナズナのためのプライマー<ol><li>別途30芽や根30を収集し、直ちに液体窒素中で凍結します。その後、乳鉢と乳棒を用いて液体窒素中で粉砕します。 </li><li>機械製造を使用して精製キットおよびRNaseフリーDNase処理キットを用いて全RNAを単離しますERの指示。 </li><li>製造業者の指示に従ってRNAナノキットおよびキャピラリーゲル電気泳動を使用して、サンプルの質と量を確認してください。分光光度法でRNAの定量を確認してください。 </li><li>製造業者の推奨に従って、第一鎖cDNAを得るために、cDNAを逆転写キットを用いて全RNAおよびランダムプライマーを2μgを使用してください。 </li><li>内部の負荷標準としてROXとサイバーグリーンを用いたリアルタイムシステム上のすべての実験を行います。 </li><li> 2X SYBRグリーン定量PCRマスターミックス12.5μlの、cDNAの0.5μlの100 nMのプライマーからなる混合物を25μlで反応を実行します。 表1に列挙されたプライマーを使用してください。（ゲノムDNA汚染を監視するために逆転写することなく、全RNAを使用して）コントロール非RTコントロールと非テンプレートコントロール（水の代わりに、テンプレート）に含めます。 </li><li>標準を使用して全てのプライマー対のためのプライマーの効率を計算します曲線法23。 </li><li> CRU3、COTP1、RRTF1：以下のPCR条件を使用してください。 95℃で10分間、95℃、58℃で30秒間、および72℃で30秒で15秒を40サイクル; UBP6、eEF1Balpha2、ACT1、GAPC2、CAT3、TAPX、APX1、RbohD、FeSOD1 10分95℃で、95°C、57°Cで20秒間、および72℃で30秒で15秒の40サイクル。 </li><li>各アニーリングおよび伸長段階の後、蛍光をお読みください。すべての実行のために、熱プロファイルで解離セグメントを含むことにより、55〜95℃の融解曲線分析を行います。解離プロファイル（温度の関数としての蛍光のプロット）を表示するには、[結果]タブを介してアクセス解離曲線画面を使用します。実験の解離セグメント間に収集されたデータセットが分析/セットアップ画面を使用して、分析のために選択されていることを確認します。 </li><li> Lを決定します3つの技術反復24,25で分析三つの独立したRNA抽出物からのcDNAを用いて10倍希釈系列（1〜3〜10倍）を行うことにより、閾値サイクル値（Ct値）に鋳型濃度の範囲inear。 </li><li> Ct値を得るために、リアルタイムPCR機器ソフトウェアですべての増幅プロットを分析します。キャリブレーションとしては、次の最高のハウスキーピング遺伝子のレベルと相対的RNAレベルを正常化：3.11.1）[結果]タブを介してプロット画面で増幅にアクセスし、データを分析選択/設定画面を使用して分析する必要のあるランプや高原を選択し、してから、コマンドパネルの蛍光メニューからDRN（ベースライン補正された正規化された蛍光）を選択します。サンプル値は、サンプリングされたウェルについてのCt値を表示するには、[結果]タブを介してスクリーンプレートにアクセスします。 </li><li>四つの異なる参照遺伝子を使用して[例えば、 細胞質のグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ、（GAPC2）、ユビキチンspecifICプロテアーゼ6（UBP6）、Actin1（ACT1）と伸長因子1（b）のαサブユニット2（eEF1Balpha2）]は、リアルタイムPCRの結果を正規化します。解析ソフトウェア26を用いたトップランクの遺伝子を選択します。そして、標準化のために最も安定した遺伝子を使用しています。 <ol><li>簡単に言えば、遺伝子名およびサンプル名を含む最初の行を含む最初の列でExcelシート上の入力データを整理します。次に、メニューバーから解析ソフトウェアを選択します。入力データを選択するためのダイアログボックスを使用します。 </li><li>次に、フィールドにサンプル名、遺伝子名と簡単な出力だけをチェックします。解析を実行するGoボタンをクリックします。最も安定に発現候補遺伝子として（最小安定性値を有する）トップランクの遺伝子を選択します。 </li></ol></li><li>芽と根の両方の差動倍数変化の発現を示すことにより、プロットデータ。 </li></ol> 4.統計分析<ol><li> ±標準誤差平均値などのデータを表現。共同の比較ntrolと分散分析（ANOVA）およびボンフェローニとダン・シダック調整確率検定（0.95パーセントの信頼）とTukeyのテストの分析を行うことで、治療群。 </li></ol>

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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

我々は最近、驚くべき相関がGMFの反転および家族被子植物の系統のほとんどの転換が2に発生した時間の間に存在することを示しました。しかし、刺激仮説多様GMF強度の効果に関する研究の過多にもかかわらず、GMF反転自体が植物遺伝子発現および形態に有意な変化を誘導する可能性があるという仮定が実証されていません。ここでは、初めて我々の研究室でGMFを逆にする三軸八角形のヘルムホルツコイルを使用し、周囲の磁場の反転が表現型の変化や植物における遺伝子発現の調節を引き起こす可能性があることを方法を示しています。 植物成長実験（2×2×2 m 3で）のに十分な量の上GMF反転（または変更）を得るために、我々は、八角形のヘルムホルツコイルシステムを構築しました。このシステムは、（通常、ヘルムホルツコイルがリング状であり、小さい方）市販されていませんそして、建設のためのコストがかなりありました。重要なことは、このシステムが変更された磁場中で例外的な時間の安定性と均一性で、堅牢なフィールドの変更を実現します。 システムは正常な状態の千にGMFの値を小さくしたり、磁場の3次元のいずれかを逆転させるために設計され、構築されています。しかしながら、コイルの設計は、高い磁場強度を生成することはできません。したがって、本形態では、この器具は、植物または他の生物に高磁場強度の効果を評価するために設計した実験には適していません。 研究室では、この方法に記載したものと同様のGMFの変化は、磁場を外れると、金属自体の中でそれらを濃縮する高透磁率を有する強磁性金属板によって実験ゾーンを囲むことによりシールドを含む、様々な方法によって得られました。目ヘルムホルツコイルを使用しての電子の利点は、システムは、このようにそれだけでなく、in vitro試験のための（ペトリ皿の使用と同様に）理想的なだけでなくなって、植物がより自然条件（光、空気循環等 ）にさらされることを可能にすることですインビボでの植物の成長及び発達実験のため。我々のシステムの寸法は、このようにいくつかのペトリ皿またはいくつかの小さなをホストできるように、（ 図1Aを参照してください ）25×25×25 cm 3の球状の体積全体の自然GMFの&lt;1 /第千まで抑制することができるスペースを作成植物の成長のためのポット。 ここに提示される方法は、生物学の研究を植物に適用されてきました。しかし、このシステムは、ウイルス学や微生物学だけでなく、線虫の研究（例えば、 線虫（Caenorhabditis elegans））、（マウスおよびラットを含む）節足動物や小動物などの実験の広い範囲を、可能にします。 GMFの反転が可能であるという仮説のため、テスト形態学的および転写の変化を誘発することもあっても、ヒトの細胞に、おそらく最終的に、多くの他の生体系に拡張することができます。 GMFは、常に変化と変動しています。したがって、我々の実験で一つの主要な課題は、所望の新しいGMF値を得るために、GMFの一定の補償を提供することにあります。これは、磁力値及び電圧補償の読み取りを介して磁界値を連続的に制御することによって達成することができます。したがって、システムはGMFのゆっくりと変化する部​​分を補うことができますが、それは、より高い周波数の変動を何もしません。 結論として、GMFベクトルを逆にする三軸コイルの使用は、GMFベクトルのこの逆転は、植物形態学的変化と差動遺伝子発現を誘導することができることを実証するために尽力しました。提示される方法を用いて得られた結果は、仮説GMF再を支持する説得力のある証拠を提供しますversalsは、地質学的時間スケール2の上に植物の進化のための原動力の一つとなっている可能性があります。

地球の磁場（または同等地磁気、GMF）は植物を含む地球に住むすべての生物のための避けられない環境因子です。 GMFは、常に地球の自然の特徴となっているので、進化の過程で、すべての生物は、その作用を経験しました。証拠の増加体は、GMFは、多くの生物学的プロセスを1に影響を与えることができることを示しています。 GMFは、一様ではなく、地球の表面で、その大きさと方向を大幅に地元の違いがあります。地球の表面のGMFは30未満、μTから約70μTに至るまで、大きさの広い範囲を示しています。 GMFは、磁気圏2を介して 、その荷電粒子の大部分を偏向させることにより太陽風の致死効果から、地球とその生物圏を保護します。 植物は環境刺激に応答します。そして、このような光や重力などの非生物的要因への古典的な応答は、トンでしたhoroughlyいわゆる屈光性​​や重力屈性応答を定義することによって説明。非常に少ない、または何も、このトピックに公開され、最近では1件の論文の過多にもかかわらず、知覚と磁場に対する植物の応答のメカニズムに知られています。重力場とは違って、GMFは、それによって、最近、最終的に植物の多様化と分化2に貢献する潜在的な駆動力と考えられてきた重要な非生物的ストレス要因を表す植物進化の間に一貫して変化しました。地磁気逆転（またはエクスカーション）はGMFの極性が変化しています。地球の生命を歴史の中で、GMFの反転は数回発生しました。これらは、すべての極性遷移の間に減少GMF強度の期間に惑星を露呈しました。一部の著者は、低GMF強度のこれらの遷移期間は、それによってAを誘導する、太陽風からの電離放射線は地球の表面に到達させたかもしれないという仮説を立てています最終的には植物の進化2につながる遺伝子変化を誘導するのに十分な強されている可能性が生物への一貫したストレス、。 植物における磁場の効果を説明した実験の詳細な分析は、妥当な生物物理学的相互作用機構の不足により特徴付けられる相反する多数のレポートを示します。他の人は最終的に、3を説得している、検証可能な仮説を欠き、一方で多くの実験は、単に非現実的です。過去数年にわたり、植物の磁場の影響に関する研究の進捗状況とステータスが2,4-11を検討されています。最近では、両方の低域と高磁場の影響を完全に植物の進化2のGMF反転イベントの関与に特に焦点を当てて、1を検討されています。 GMFの反転は、植物の進化に影響を与えるという仮説を実証するための最も直接的な手段GMFを合成することです正常な、逆磁場条件に対する植物の応答を試験することにより実験室で逆転。仮説を検証するために、我々は、したがって、正確に通常のGMF条件を逆転させることができる三軸八角ヘルムホルツコイル対の磁場補償制度（三軸コイル）を、構築されました。 我々は、モデル植物としてシロイヌナズナを用いて、我々はいくつかの重要な遺伝子の遺伝子発現に対する逆GMFの効果テスト： ルシフェリン3（CRU3）、チロシンリン酸化され、そのリン酸化状態が対応して変調された12S種子貯蔵タンパク質をコードしますシロイヌナズナの種子 12,13におけるABAへ。土壌Cuの取得と花粉の開発14において支配的な機能を持つ重金属輸送/解毒スーパーファミリータンパク質をコードしている銅交通Protein1（COTP1）;そして、 レドックス応答性転写Factor1（RRTF1）、すなわち、ERF（エチレン応答因子）サブファミリーB-3遺伝子発現経路の相乗的な共活性化を促進し、非生物的および生物15の応力に交差耐性を与える1 AP2ドメインを含むERF / AP2転写因子ファミリーのメンバーをコードします。 （O 2 - ）と水（H 2 O）、過酸化水素（H酵素的に、迅速にスーパーオキシドアニオンに変換する細胞質酵素をコードしたFeスーパーオキシドDismutase1、（FSD1）：また、我々はまた、酸化ストレス応答に関与する5つの遺伝子を分析しました水と酸素17,18へのH 2 O 2分解を触媒 Catalase3（すなわち、コードすることCAT3）、および酵素; 2 O 2）、酸素分子（O 2）16 Thylakoidalアスコルビン酸ペルオキシダーゼ（TAPX）、符号化しH 2 Oを捕捉する葉緑体チラコイドペルオキシダーゼ2 19; H 2 O 2を捕捉すると、NO-20由来の分子によって媒介される翻訳後修飾の潜在的な標的の一つを表すサイトゾルペルオキシダーゼをコードしているアスコルビン酸Peroxidase1（APX1）は 、 O 2を生成する酵素エンコードNADPH- 呼吸バーストオキシダーゼタンパク質D（RbohD） -とシロイヌナズナ21の成長、開発、ストレス応答の調節に重要な役割を果たしているが。 我々のフィールド反転方法はGMF反転がAの形態および遺伝子発現の有意な変化を誘導し得るという最初の証拠を提供しますシロイヌナズナの根と芽。このプロトコルは、植物形態学および遺伝子発現に対するGMF反転の効果を評価するための革新的な方法を提供し、プラントの動作の他の側面にGMF反転の潜在的な影響を評価するために使用することができ、それによりROの議論を導きます植物の進化のGMF逆転のル。

<table><tbody><tr><td>3軸磁力計</td><td>バーティントン&nbsp;</td><td>Mag-03MC</td><td>三軸フラックスゲート磁力計</td></tr><tr><td>磁力計</td><td>電源 バーティントン&nbsp;</td><td>Mag-03PSU</td><td>三軸フラックスゲート磁力計</td></tr><tr><td>磁力計ソフトウェア</td><td>バーティントン&nbsp;</td><td>Mag03DAM</td><td>三軸フラックスゲート磁力計</td></tr><tr><td>直流電源&nbsp;</td><td>Agilent Technologies</td><td>E3642A</td><td></td></tr><tr><td>次亜塩素酸カルシウム&nbsp;</td><td>シグマ</td><td>211389</td><td></td></tr><tr><td>トリトンX-100&nbsp;</td><td>シグマ</td><td>X100&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>エタノール&nbsp;</td><td>シグマ</td><td>2860</td><td></td></tr><tr><td>GroLuxナトリウム蒸気ランプ&nbsp;</td><td>OSRAM Sylvania</td><td>600W</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Plant RNAキット&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>74903</td><td></td></tr><tr><td>RNaseフリーDNase&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 2100 バイオアナライザー</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2938B</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop ND-1000&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>はご利用いただけません</td><td></td></tr><tr><td>大容量cDNA逆転写キット&nbsp;</td><td>Applied Biosystems</td><td>4368813</td><td></td></tr><tr><td>Mx3000P</td><td>Agilent Technologies</td><td>401512</td><td></td></tr><tr><td>2x MaximaTM SYBR Green qPCR Master Mix&nbsp;</td><td>Fermentas International, Inc</td><td>K0221</td><td></td></tr><tr><td>パラフィルム</td><td>シグマ</td><td>P7793-1EA</td><td></td></tr><tr><td>ムラシゲ&スクーグ 基礎ミディアム</td><td>シグ</td><td>M5519&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>シャーレスクエア(120 x120 mm2)</td><td>シグマ</td><td>Z692344&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

地磁気（gmfと）と植物の進化：gmfと逆転の影響に関する調査を<em&gt;シロイヌナズナ</em&gt;開発と遺伝子発現

Geomagnetic Field (Gmf) and Plant Evolution: Investigating the Effects of Gmf Reversal on Arabidopsis thaliana Development and Gene Expression

植物の進化の中で最も刺激的な観察の一つは、地球磁場の発生（GMF）逆転（またはエクスカーション）と被子植物の放射の瞬間との間の相関です。これは、GMFの極性の変化が植物の進化において役割を果たし得るという仮説につながりました。ここでは、人工的にGMF条件を逆にするシロイヌナズナを暴露することによって、この仮説を検証する方法を説明します。我々は、三軸磁力計を使用し、収集されたデータは、GMFの大きさを計算するために使用しました。 3つのDC電源装置は、3つのヘルムホルツコイル対に接続され、GMF条件を変更するために、コンピュータによって制御しました。ペトリプレートで生育した植物は、通常の両方に暴露し、GMF条件を逆転しました。シャム曝露実験も行いました。露出された植物は、実験中に撮影され、画像は、根長と葉の面積を計算するために分析しました。シロイヌナズナ全RNAを抽出し、定量しましたリアルタイムPCR（定量PCR）は、 ルシフェリン3（CRU3）、銅輸送protein1（COTP1）、レドックス応答性転写Factor1（RRTF1）、鉄スーパーオキシドジスムターゼ1（FSD1）、Catalase3（CAT3）、Thylakoidalの遺伝子発現分析を行いましたアスコルビン酸ペルオキシダーゼ（TAPX）、細胞質ゾルアスコルビン酸Peroxidase1（APX1）、および NADPH /呼吸バーストオキシダーゼタンパク質D（RbohD）。四つの異なる参照遺伝子は、定量PCRの結果を標準化するために分析しました。 4つの遺伝子の最良を選択し、正規化のための最も安定した遺伝子を使用しました。我々のデータは、三軸コイルを用いGMFの極性を反転することは、植物の成長および遺伝子発現に対する有意な効果を有することを初めて示しています。これは、最終的にはPにつながる、より高い選択圧を正当化する可能性がGMF反転が植物の発育の変化を誘導することに貢献するという仮説を支持しますLANT進化。

このプロトコルの目的は、時セットGMFを逆転するために使用され、図1（a）に示すように地球磁場（GMF）の反転は、植物発育及びシロイヌナズナ生態型コル0三軸コイルの遺伝子発現に影響を及ぼし得るかどうかを評価する方法を提供することにありますプロトコールのステップ1.5で説明したように適切な駆動電圧（ 図1B）と、得られます。三軸コイルの寸法は、いくつかのペトリ皿をホストする逆GMF条件に十分なスペースを可能にした〜2×2×2メートル3、です。コントロールは、同じ環境条件で、通常のGMF値で増殖させました。 GMF条件ノーマルへの曝露の10日後に、逆に、植物の表現型は明らかに形態変化を示しました。 図2に示すように 、（通常のGMF条件下で増殖させ、すなわち 、）コントロール植物は、有意（ダン-シダック及びボンフェローニの調整度Prob &lt;0.001で根の長さを示しました。逆GMFにさらされる植物に対する（17.53ミリメートルで、N = 32）;スチューデントのt = 10.68、DF = 31）より高い値（29.41ミリメートル; SEM = 1.04、S​​EM = 0.58; N = 36）。 GMF-逆転植物では、芽の形態はまた、リーフレット拡大の減少発展を示すことによって変更されました。スチューデントのt = 31.32、DFを、逆GMF条件にさらされる植物は度Prob = &lt;0.001を調整ダン・シダックとボンフェローニ（大幅に示したのに対し、正常な状態にさらされた植物は、4.95ミリメートル2（SEM 0.025、N = 54）の平均葉面積を示しました= 53）下葉面積値（3.71ミリメートル2、SEM = 0.032; N = 54）。したがって、逆GMF条件にシロイヌナズナの露出は根長と葉面積の両方の減少を誘導しました。 葉の拡大と根の成長は、分裂、細胞27の伸びの両方に依存しています。したがって、植物の開発、生産性と全体的なフィットネスは、最適なshoot-とルートシステムアーキテクチャに依存しています&lt;SUP&gt; 28。縮小根長と逆GMF条件にさらされる植物の葉の大きさは、磁場強度の変動を認識するだけでなく、重力に比べて磁界の変化を「方向」に応答することができる検出システムの存在を示します。 GMF反転が植物の成長に影響を与える可能性があるという仮説は、GMF反転条件が大幅に植物の発育に影響を与えることができることを実証する実験において、説得力のある証拠を見つけます。 形態学的変化は、遺伝子発現の変化を伴っていました。ハウスキーピング遺伝子の中で、最も安定した遺伝子は、 伸長因子1（b）のアルファサブユニット2であった 。遺伝子の最初のグループ（CRU3、COTP1、RRTF1）は 、遺伝子発現（ 図3）の劇的な変化を示しました。すべての3つの遺伝子の発現が有意に準備にさらされる植物では約2.5倍（P &lt;0.05）増加したシュートD GMF条件。 CRU3のルート式は逆GMF条件においてダウンレギュレートした（P &lt;0.05）、通常のGMFの条件にさらされた植物で根においてアップレギュレートされ、有意でした。反対は、通常の状態でダウンレギュレートし、GMFの逆転（ 図3）の存在下でアップレギュレートされたCOTP1とRRTF1、見つかりました。 ルシフェリン（12 Sグロブリン）は、Aの種子中で最も豊富な貯蔵タンパク質でありますシロイヌナズナや他のアブラナとは、粗面小胞体内の前駆体として合成されます。次いで、これをタンパク質貯蔵液胞13に搬送されます。苗の発芽は、窒素の初期ソースとして使用されるルシフェリンの内訳を、必要とします。ダウンレギュレーション劣化をルシフェリンの細胞構造や細胞成分の開発29,30を損なうことにより、胚の発生を低減します。我々の結果は、CRU3のアップレギュレーションはと相関することを示していますこのようにして下葉の拡大と縮小根長、G​​MF反転に敏感で、この遺伝子れ、その過剰発現が植物の発育の低減に寄与し得ることを示しています。また、GMF反転が減少根の長さと相関根におけるCRU3の大幅なダウンレギュレーションを誘導します。銅は植物中の主要プロセスに不可欠な補因子であるが、それは過剰に有害な効果を発揮します。したがって、銅の輸送を過剰発現する植物の成長を損ないます。 GMFの逆転の効果は、このように減少し、植物の成長を説明する、シュートおよび根の両方におけるCOTP1の有意な過剰発現がありました。イオン応力がしっかり細胞の酸化還元状態にリンクされている葉緑体の代謝を損ないます。シロイヌナズナで転写因子RRTF1は、酸化還元に調整する能力31を変更するには、関連する遺伝子の発現のために重要です。したがって、植物は、その生理学的および開発を変えることができる外部刺激にさらされているときアルプログラムは、この重要な転写因子の過剰発現が期​​待されます。 GMFの逆転は、このように逆GMF条件に対する植物の高い酸化ストレス応答を示し、芽と根の両方でRRTF1の大幅な過剰発現を誘導しました。 興味深い結果は、酸化ストレスに関与する5つの遺伝子を解析することにより得られます。植物が正常に成長又はGMF条件（ 図4、図5）を逆転したときに一般的には、芽で抽出し、分析した全ての遺伝子が有意差（P&gt; 0.05）を示さありませんでした。しかし、かなりのダウンレギュレーションは、常に逆GMF条件にさらされる植物の根において観察されました。特に、CAT3が最高のダウンレギュレーション（ 図5）を示した （ 図4）APX1、FSD1、RBOHDとTAPXによってダウンレギュレーションのために続きます。 にクロス寛容生物的および生物的ストレスは、いくつかの生化学的経路に関与する種々の遺伝子の活性化によって提供される。RRTF1転写因子は、これらの経路15,31の遺伝子発現の相乗的な共活性化を促進し、そして潜在的に酸化ストレス32に関与することができます。脱酸素が ​​減少したときしたがって、RRTF1のアップレギュレーションが期待されます。ルート捕捉酵素のダウンレギュレーションは、増加した酸化ストレスに応答して作用するRRTF1のアップレギュレーションと相関します。 CAT3、APX1とTAPXの劇的なルートダウンレギュレーションは、FSD1のダウンレギュレーションにより、スーパーオキシドアニオンをdismutate能力の低下を伴って、H 2 O 2を 、捕捉する根細胞の減少能力を示します。酸化ストレス応答は逆GMF知覚の主要な部位であると思われるルーツが高いです。 図1.地磁気補償システム 。 （A）三軸コイル（3直交軸のそれぞれに八角形のコイル対を含む）は、地磁気ベクトルを逆にするために使用されます。 （B）は、コンピュータ制御された電源は、ヘルムホルツコイルの各対に接続されています。 （図中の電圧は任意である<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53286/53286fig1large.jpg" target="_blank">）、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53286/53286fig2.jpg" /> 図シロイヌナズナの形態の地磁気逆転の2影響 。曝露の10日後、対照植物（ すなわち 、通常のGMF条件に暴露されたもの）は、著しく大きな根長、よりEXPANを表示逆GMF条件に曝露した植物と比較DEDリーフレット。メトリックバー= 18ミリメートル。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53286/53286fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/53286/53286fig3.jpg" /> 図シロイヌナズナ遺伝子発現に対する地磁気逆転の3影響 。曝露の10日後、対照および処理した植物の総RNAを抽出し、発現分析のためにリアルタイムPCRによって分析しました。 GMFの逆転の効果を試験した全ての遺伝子の遺伝子発現の急激な変化を誘導することであったCRU3、ルシフェリン3;。COTP1、銅輸送Protein1; RRTF1、レドックス応答性転写Factor1。バーは標準誤差を示します。アスタリスクは、PLとの間に有意な（P &lt;0.05）の違いを示し、逆および通常のGMF条件に暴露アリ。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53286/53286fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/53286/53286fig4.jpg" /> 図シロイヌナズナ抗酸化関連遺伝子の発現に地球磁場逆転の4影響 。曝露の10日後、対照および処理した植物の総RNAを単離し、リアルタイムPCRを用いた遺伝子発現解析のために用いられます。 GMFの反転の効果がシュート遺伝子発現に有意な変化を誘発しないことでした。しかし、大幅なダウンレギュレーションが逆転GMF条件の下で栽培された植物の根の遺伝子発現で観察されたTAPX、Thylakoidalアスコルビン酸ペルオキシダーゼ ; APX1、アスコルビン酸Peroxidase1; FSD1、鉄スーパーオキシドDismutase1; RbohD、NADPH /呼吸バーストオキシダーゼタンパク質Dバーは標準誤差を示します。アスタリスクは逆に、通常のGMF条件にさらされた植物との間に有意な（P &lt;0.05）の違いを示している。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53286/53286fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/53286/53286fig5.jpg" /> 図シロイヌナズナカタラーゼ3（CAT3）遺伝子発現に対する地磁気逆転の5影響 。曝露の10日後、対照および処理した植物の総RNAを単離し、リアルタイムPCRを用いた遺伝子発現解析のために用いられます。 GMFの反転の効果がシュート遺伝子発現に有意な変化を誘発しないことでした。しかしながら、急激なダウンレギュレーションが逆GMF条件下で成長した植物の根の遺伝子発現で観察されました。バーは標準ERROを示しますR;アスタリスクは逆に、通常のGMF条件にさらされた植物との間に有意な（P &lt;0.05）の違いを示している。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53286/53286fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

このプロトコルは、有効地球磁場（GMF）の逆転がシロイヌナズナの遺伝子発現を誘発し、形態を変化させるという仮説を検証する方法を説明しています。ヘルムホルツコイルペアの三軸八角形システムを使用して、植物成長チャンバー内で逆GMF条件を人工的に生成しました。

地磁気（Gmfと）と植物の進化：Gmfと逆転の影響に関する調査を<em&gt;シロイヌナズナ</em&gt;開発と遺伝子発現

One of the most stimulating observations in plant evolution is a correlation between the occurrence of geomagnetic field (GMF) reversals (or excursions) ...

本手順の全体的な目的は、電源で制御されるホルツコイルを用いて、地磁気（GMF）の逆転を再現することです。最終的に、GMFの逆転が植物の形態と遺伝子発現に影響を与えることが示されます。この手法は、地球磁場の逆転が植物の進化と適応に役割を果たした可能性があるかなど、植物進化分野における重要な疑問に答えるのに役立ちます。本手法の主な利点は、多くの反復試行が可能で、かつすべての条件を精密に制御して育成できる単純なモデル生物を用いて、弱磁場による潜在的な生物学的影響を試験できることです。本手順の実演は、私の研究室の指導学生であるAlberto Bocco、および私の研究室の博士課程学生であるKiara aa、そして私のグループの准教授であるCIA Berteaが行います。まず、3組のヘルムホルツコイルに接続されている3台のDC電源をオンにし、3軸コイル内にプローブが挿入されている3軸磁力計の電源を入れます。コンピューターを起動し、3軸磁力計からデータを収集するための磁力計ソフトウェアを立ち上げます。また、電源装置は制御のためにAGPIB接続経由でコンピューターに接続されています。テキストプロトコルに従い、磁場ベクトルを反転させて目的の磁場を発生させるように電源の電圧を設定します。カルシウムヒポクロライト溶液を用いて、25～28 °Cで10～12分間、連続的に振盪しながら滅菌処理した Arabidopsis thaliana ecotype Columbia-0 の種子を1.5 mLチューブに入れます。その後、種子を80% ethanolで2回すすぎ、続いて100% ethanolで洗浄します。最後に、滅菌蒸留水で洗浄します。テキストのプロトコルに従い、凝固させる前にMurrah ShigaおよびSCOG改変培地を1リットル調製します。四角形ペトリ皿1枚あたりに培地80 millilitersを注ぎ、1枚のプレートに30粒の滅菌種子を播種します。次に、プレートをパラフィンフィルムで密封します。発芽を促進し同期させるため、プレートを暗所、4 °Cで2日間水平に置いた状態で春化させます。春化後、ナトリウムランプのスポットライトに青色のゼラチンフィルムを被せ、ランプの赤色成分を低減させる準備をします。ペトリ皿を通常または反転したGMFに曝露させる準備をします。22 °Cに制御された環境下で、種子を垂直方向に配置して曝露させます。並行して、三軸コイルの外側および内側の両方で実験を行います。8時間の暗期と16時間の明期の光周期条件下で管理します。処理後、シャーレの写真を撮影し、根の長さと葉面積を算出します。まず、シャーレの一辺を測定します。次に、Image Jソフトウェアでシャーレの画像を開き、直線オプションを使用して、シャーレの端を正確に横切る線を描きます。「Analyze」メニューから「Set Scale」を選択し、「Known distance」ボックスに実際の距離を入力します。その後、長さの単位を入力してください。最後に、グローバルオプションをクリックし、根の長さのすべての測定で設定を有効にします。フリーハンドツールを使用して、根の形状に沿って慎重にトレースしてください。「analyze」メニューの「measure」オプションを使用して、長さを測定します。写真内のすべての根の測定を継続し、後の統計分析のためにファイルを保存します。画像メニューの葉面積測定については、「調整（adjust）」オプションを使用し、続いて「カラーしきい値（color threshold）」で個々の葉を選択します。その後、解析メニューで「粒子の解析（analyze particles）」を選択し、個別の測定値を統計分析用に保存します。地上部30本と根30本をそれぞれ回収し、直ちに液体窒素で凍結させます。その後、乳鉢と乳棒を用いて液体窒素中で摩砕し、テキストプロトコルに記載されている手順に従って全RNAを単離します。すべての実験は、内部ローディング標準としてROXを含むCyber Green Oneを用いたリアルタイムシステムで実施し、反応は25 µLの混合液で行います。テキストプロトコルに記載されているプライマーを使用し、ゲノムDNAの混入を監視するための逆転写なしコントロール（non-reverse transcription controls）およびテンプレートなしコントロール（non-template controls）を含めてください。各アニーリングおよび伸長相の後に蛍光を測定します。2つの虫眼鏡のアイコンは、解離曲線などの収集されたデータを表しています。解析および設定画面に移動し、実験の解離セグメント中に収集されたデータセットが選択されていることを確認してください。すべてのランの解析において、サーマルプロファイルに解離セグメントを含めることで、55から95 degrees Celsiusまでの融解曲線解析を実行します。結果タブからアクセスできる解離曲線スクリーンを使用します。これにより、解離プロファイルを確認できます。すべての増幅プロットは、リアルタイムPCR装置のソフトウェアで解析してください。CT値を算出するため、最適なハウスキーピング遺伝子のレベルを用いて、相対的なRNAレベルのキャリブレーションと標準化を行います。結果タブから増幅プロット画面にアクセスしてください。解析、選択、およびセットアップ画面を使用して、データを解析するランプ部またはプラトー部を選択します。次に、コマンドパネルの蛍光メニューから、ベースライン補正済みの正規化蛍光（baseline corrected normalized fluorescence）を選択します。結果タブからプレートサンプル値画面にアクセスし、サンプリングされたウェルのCT値を表示します。4種類の異なるリファレンス遺伝子を用いて、リアルタイムPCRの結果を標準化します。解析ソフトウェアを使用して上位にランクされた遺伝子を選択し、最も安定した遺伝子を標準化に使用してください。入力データをExcelシートに簡潔にまとめ、最初の列に遺伝子名を、最初の行にサンプル名を記載してください。次に、メニューバーから解析ソフトウェアを選択します。ダイアログボックスを使用して、入力データを選択してください。続いて、「sample names」、「gene names」、「simple output only」のフィールドにチェックを入れます。「go」ボタンをクリックします。解析を実行し、最も上位にランクされた遺伝子を、最も安定的に発現している候補遺伝子として選択します。10日間の曝露後、対照植物は、GMF反転条件下に10日間曝露された植物と比較して、根の長さが有意に長く、小葉の展開が進んでいることが示されました。GMFの反転による影響は、CRUCIFER IN THREE COPPER TRANSPORT PROTEIN 1およびREDOX RESPONSIVE TRANSCRIPTION FACTOR 1を含む、すべての試験対象遺伝子の遺伝子発現の劇的な変化でした。バーは標準誤差を示し、アスタリスクは反転GMF条件および通常GMF条件に曝露された植物間の有意差を示しています。GMF（地磁場）の反転による影響では、シュートの遺伝子発現に有意な変化は見られませんでした。しかし、栽培した植物の根の遺伝子発現においては、劇的なダウンレギュレーションが観察されました。逆GMF条件下で、これらの遺伝子にはthal、aate peroxidase、aate peroxidase、鉄スーパーオキシドディスムターゼ1種、N-A-D-P-H 1種、呼吸バーストオキシダーゼタンパク質、およびカタラーゼ3が含まれます。この手法を習得すれば、適切に実施することで、必要な実験に応じて数分から数日単位で操作することが可能です。このビデオを視聴することで、地磁気の反転または変更の方法、および曝露させた植物に対する形態学的・遺伝学的研究の実施方法について十分な理解が得られるはずです。この手順を行う際は、ヘルメットコイルで囲まれた領域からあらゆる磁場発生源を取り除くことが重要です。ヘルメットコイルおよびそのジェネレーターが熱や振動を発生させないことが重要です。最終的なデータが記録されるまで、研究者は磁場曝露条件について盲検化される必要があります。この手法により、磁気受容の研究者は、磁場が植物の進化、動物の行動およびナビゲーション、ならびにヒト細胞株に及ぼす影響を探索することが可能になりました。将来的には、磁場の変化が宇宙環境における植物の成長にどのような影響を与えるかを評価するため、微小重力下で同様の研究を行うことを希望しています。弱磁場を発生させるシステムを用いた作業に危険はないと考えられています。しかし、通常の予防措置を講じる必要があり、ヘルムホルツコイル対用の電源装置などの機器を使用する際は、有資格の電気技師に助言を求めてください。

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Developmental Biology

発生生物学

空間固有のフィトクロム応答の分子基盤は、組織および器官特異的フィトクロムの欠陥を示すトランスジェニック植物を用いて検討されている。マイクロアレイ解析に続いてソート蛍光活性化細胞により誘導されるフィトクロム発色団の枯渇を示す特定の細胞の単離は、空間的な固有のフィトクロム反応に関与する遺伝子を同定するために活用されています。...

でFACSアシスト細胞型特異的発現プロファイリングを使用して組織と器官特異フィトクロム応答を調査シロイヌナズナ</em

細胞生物学の基本的なクエストは、真核生物の細胞を作る細胞内小器官のアイデンティティの根底にあるメカニズムを定義することです。ここでは、蛍光顕微鏡と次世代シーケンシングツールを用いた植物オルガネラの形態と機能の整合性の責任遺伝子を同定する手法を提案する。...

蛍光顕微鏡スクリーニングと次世代シーケンシング：オルガネラの整合性に関与する遺伝子の同定のための有用なツール

我々は、気孔の分化を文書化、開発の数日間にわたって表皮の共焦点イメージングのための植物の子葉を固定化するためにチャンバースライドやメディアを使用してプロトコルを記述します。フルオロフォアタグ付きタンパク質は、細胞分裂や細胞型分化の過程でそれらの可能な役割の理解を深め、表現と細胞内局在によって動的に追跡することができます。...

の長期、高分解能共焦点タイムラプスイメージング<em&gt;シロイヌナズナ子葉</em発芽過程&gt;表皮

私たちは、 シロイヌナズナの種子から種皮寝具アッセイ（SCBA）を構築する手順を紹介します。 SCBAは、遺伝的およびin vitroで探索する強力なツールであることが示されたか休眠種子中の光の合図に応答して、胚乳を制御し種子の発芽。 SCBAは胚乳が胚の成長に影響を与えることが疑われるあらゆる状況下で適用可能な原則です。...

遺伝的に探索するために種皮寝具アッセイ<em&gt;体外</em&gt;どのように胚乳コントロール種子発芽<em&gt;シロイヌナズナ</em

クロマチン免疫沈降は、DNAは、インビボでのシロイヌナズナのタンパク質の結合部位を同定するための強力な技術です。この手順は、クロマチン架橋および断片化、目的のタンパク質に対する選択的な抗体を用いた免疫沈降、および結合したDNAの定量PCR分析を含みます。私たちは、シロイヌナズナ植物用に最適化され、単純なChIPアッセイを説明します。...

シロイヌナズナタンパク質-DNA相互作用の同定のための免疫沈降アッセイクロマチン<em&gt;インビボ</em

このプロトコルの目標は、外部エネルギーなしで静磁場を印加することにより、植物の初期成長速度の加速を実証することです。...

静磁場を利用した農業植物の初期の成長率の向上

このプロトコルでは、顕微鏡下で胚パターン形成の検査続く胚珠クリアランスを介してシロイヌナズナの胚発生を観察するためのメソッドについて説明します。...

シロイヌナズナの胚発生の特性評価法

このプロトコルは、アブラムシなどの半翅目昆虫の摂食によって生成される植物のカルシウム信号の分析のための簡単な方法をについて説明します。シロイヌナズナを用いたGFP カルシウム センサー GCaMP3...

リアルタイム体内シロイヌナズナカルシウム信号の間に記録して蛍光バイオ センサーを用いた昆虫の餌

ジベレリン認識センサー 1 (GPS1) は最初蛍光共鳴エネルギー移動に基づくバイオ センサー ジベレリン植物生長ホルモン高時空間解像度の携帯電話のレベルを測定するため。このプロトコルは視覚化し、シロイヌナズナの胚軸と根の遺伝的コード化 nlsGPS1 バイオ センサーを用いた細胞ジベレリン...

NlsGPS1 蛍光共鳴エネルギーを使用して可視化、細胞ジベレリン レベル移動 (FRET) バイオ センサー

穏やかなタッチフォースローディングマシンは、人間のヘアブラシ、ロボットアーム、コントローラーから構築されています。ヘアブラシは、機械に取り付けられたロボットアームによって駆動され、植物にタッチフォースを適用するために定期的に移動します。機械駆動のヘアタッチの強さは、手動で適用されたタッチの強度に匹敵します。...

モデル植物アラビドプシスタリアナのチグモ形態形成の研究のための省力と反復可能なタッチフォースシグナル伝達変異スクリーンプロトコル

細胞外グルタミン酸誘発全身カルシウムシグナル伝達は、植物における機械的創傷および草食動物攻撃に対する植物防御応答の誘導にとって極めて重要である。本稿では、カルシウムとグルタミン酸に敏感な蛍光バイオセンサーを発現する シロイヌナズナ植物...

シロイヌナズナにおける局所および全身創傷信号の広視野、リアルタイムイメージング

学ぼう、ヘルムホルツコイルを用いて地磁気を逆転させ、シロイヌナズナの形態と遺伝子発現を解析する方法。植物の進化と適応における磁場の役割を解明する実験手法です。

地磁気（Gmfと）と植物の進化：Gmfと逆転の影響に関する調査を

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