神経膠芽腫のための免疫担当動物モデルの生物発光イメージング

GL261神経膠腫細胞は、神経膠芽腫の有用な免疫適格動物モデルを提供します。このプロトコルの目標は、in vivo 生物発光イメージングを使用して頭蓋内腫瘍の成長を監視するための適切な技術を実証し、腫瘍免疫学および神経膠芽腫を治療するための免疫療法アプローチを研究するためのルシフェラーゼ修飾 GL261 細胞の有用性を検証することです。

このプロトコルの全体的な目標は、GL261マウス腫瘍細胞のルシフェラーゼ修飾の有用性を検証するために、in vivo生物発光イメージングを使用して腫瘍細胞および頭蓋内腫瘍増殖を監視するための適切な技術を実証することです。この方法は、腫瘍免疫学および免疫療法アプローチの研究における重要な質問に答えるのに役立ちます。例えば、ストレス修飾がGL261細胞の増殖に影響を与え、生体内で増殖するかどうかなどです。

この技術の主な利点は、GL261腫瘍細胞のルシフェラーゼ修飾が、その増殖と治療に対する反応の非侵襲的モニタリングを容易にすることです。GL261ルシフェラーゼ細胞培養物がT75フラスコで70%のコンフルエント度に達したら、トリプシン処理によって細胞を回収します。細胞をカウントし、段階的な密度で24ウェルプレートに移します。

細胞培養インキュベーターで3時間過ごした後、生物発光イメージングソフトウェアを開き、イメージングシステムを初期化します。カメラがマイナス90°Cに冷却されたら、イメージングソフトウェアを発光に設定し、露光時間を10秒、ビニングを中程度にします。次に、ウェルあたり25マイクロリットルのルシフェリンで細胞を室温で1分間インキュベートし、プレートをイメージングステーションに置きます。

[取得] を選択してイメージングを開始します。画像が正常に取得されると、画像ウィンドウとツールパレットが表示されます。[Regions of Interest Tools] をクリックし、スリット アイコンから [6 x 4] を選択します。

信号の領域を6 x 4のスリットで覆い、[測定]タブの鉛筆アイコンを選択します。関心領域の測定値のテーブルが、ステラジアン/平方センチメートルあたり1秒あたりの光子の単位として表示されるウィンドウが表示されます。in vitro増殖アッセイを行うには、示したように細胞培養物が70%の密度に達したときに

そして、マルチチャンネルピペットを使用して、96ウェルプレートのそれぞれ20ウェルに腫瘍細胞を1.5倍10〜1ウェルあたり80マイクロリットルのRPMI培地あたり3番目の細胞で配置します。細胞培養物の蒸発を制限するために、周囲の空のウェルに100マイクロリットルの新鮮なRPMI培地を充填します。次に、細胞増殖を評価するために、細胞の各ウェルに20マイクロリットルのMTS試薬を添加します。

そして、プレートを摂氏37度と二酸化炭素5%でインキュベートします。3時間後、マイクロプレートリーダーを使用して、490ナノメートルの吸光度を測定します。吸光度値を正規化するには、各日の値を初日に得られた対応する読み取り値で除算します。

移植の日に、70%コンフルエントな腫瘍細胞培養物からのカルシウムとマグネシウムを含まないHBSSで、1マイクロリットルあたり10〜5番目の細胞を1回懸濁します。次に、つま先をつまむことで適切な鎮静量を確認した後、各実験動物の頭頂部を剃ります。綿の先端を使用して、2%クロルヘキシジンで各頭蓋骨をきれいにします。

次に、各マウスの目に潤滑剤を塗ります。次に、滅菌メスを使用して、最初の動物の頭頂後頭骨に約1センチメートルの長さの矢状切開を行います。そして、3%の過酸化水素で頭蓋骨の表面を再度清掃し、見かけのブレグマに注意してください。

次に、滅菌済みの25ゲージの針を使用して、ブレグマの右側、冠状縫合糸のすぐ後ろにある頭蓋骨に3ミリメートルの穴を開けます。適切な注入深さを確保するには、はさみを使用して20マイクロリットルのピペットチップの尖った端から3ミリメートルを切り取り、26ゲージのハミルトンシリンジをチップの端から3ミリメートル突き出すまでチップにスライドさせます。頭蓋骨の穴に針を差し込み、腫瘍細胞の5分の1に3×10の3マイクロリットルを1分間かけてゆっくりと注入します。

針をさらに1分間そのままにしてから、ゆっくりと引き抜きます。露出した骨を3%過酸化水素と2%クロルヘキシジン溶液と交換します。次に、新しい綿の先端アプリケーターで頭蓋骨を乾燥させた後、3平方ミリメートルの滅菌骨ワックスを切り取り、綿の先端アプリケーターの裸の端にワックスを取り付けます。

注入部位を骨ワックスで覆います。次に、鉗子を使用して、頭皮の両側をワックスの上に引きます。傷口を塞ぎ、適切な術後鎮痛剤を投与した後、各実験動物に対してこの手順を繰り返します。

頭蓋内腫瘍の成長を画像化するには、まず、先ほど示したようにイメージングステーションを初期化します。次に、テールピンチによる適切な鎮静レベルを確認した後、先ほど示したようにイメージングシステムのパラメータを設定します。ただし、露光時間に[自動]を選択する場合は例外です。

イメージングシステムの準備ができたら、マウスをイメージングステーションに置き、[取得]を選択してルシフェラーゼ発現の画像を取得します。画像が正常に取得されたら、ツールパレットから関心領域ツールを選択し、円のアイコンから自動を選択します。信号の領域を囲んで関心領域を定義し、その領域の測定値を光子/秒の単位(ステラジアン/平方センチメートルあたり)として取得します。

最後に、マウスをイメージングチャンバーから取り出し、腫瘍担体動物が完全に回復するまで監視します。ルシフェラーゼ含有レンチウイルスに感染したGL261細胞のin vitro生物発光イメージングは、ポジティブコントロールU87MGルシフェラーゼ発現ヒト神経膠芽腫細胞株によって発現されるルシフェラーゼレベルと同様の強力なルシフェラーゼ発現を示します。予想通り、感染していないGL261細胞はバックグラウンドルシフェラーゼの発現を示さなかった。

頭蓋内移植前は、GL261ルシフェラーゼ細胞株とGL261細胞株のin vitro増殖速度に差は観察されませんでした。頭蓋内腫瘍注射動物の連続生物発光イメージングが示すように、GL261ルシフェラーゼ発現腫瘍細胞もin vivoで急速かつ一貫した増殖速度を示し、観察された実験担体グループ間で生存率に大きな差はありません。この手法を習得すると、適切に実行すれば、1時間あたり最大25匹のマウスを画像化するために使用できます。

開発後、この技術は、生体内GL261腫瘍増殖のモニタリングに役立つ生物発光イメージングの能力を高め、免疫適格マウスモデルにおける免疫療法応答の研究をさらに進めます。