Name: 神経膠芽腫のための免疫担当動物モデルの生物発光イメージング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: 学ぶ、生体内バイオルミネセンスイメージングを用いてGL261細胞の脳内腫瘍成長をモニタリングする手法。免疫担当マウスモデルで神経膠芽腫の免疫治療応答を非侵襲的に評価できる。

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技術支援を提供してくださったRajwant Kaurに感謝いたします。マックスウェル・トムには、レンチウイルスの調製にご協力いただき、誠にありがとうございます。この研究は、UCSFのReza and Georgianna Khatib Endowed Chair in Skull Base Tumor Surgeryと、ノースウェスタン大学のMichael J. Marchese教授兼教授の支援を受けました。

以下で説明するすべての手順を見直し、ノースウェスタン大学の施設内動物の使用およびケア委員会によって承認され、滅菌条件下で実施されているされています。 ホタルルシフェラーゼを発現するレポーターでGL261細胞の1変更注：HIV-1ベースのレンチウイルスベクターは、脾臓フォーカス形成ウイルス（SFFV）プロモーターの制御下でホタルルシフェラーゼ（Fluc細胞）を発現します。光学レポーター遺伝子は、ベクタープラスミドpHRSIN-CSGW-dlNotIにクローニングされています。 <ol><li> 95を含有する加湿雰囲気中、37℃で、10％FBSおよび1％ペニシリン - ストレプトマイシンを補充したRPMI培地中で、10％ウシ胎児血清（FBS）およびGL261細胞を補充したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）中で293-T細胞を維持します％の空気と5％の二酸化炭素（CO 2）。 </li><li> 293-T細胞培養物は、T-75フラスコ中で80％コンフルエントに達したときに、pHが一度細胞を洗浄Ca2 +およびMg2 +をなしosphate緩衝生理食塩水（PBS）、フラスコを保持することにより、5 mlのピペットで粉砕物がわずかに傾斜し、5分間37℃でトリプシン3mlの（0.05％）で細胞をインキュベートし、すべての細胞を回収フラスコの底から。 15 mlのコニカルチューブにトリプシン処理細胞懸濁液を3mlの転送、及び肉の7 mlのRPMI培地（細胞懸濁液を10mlの合計）を加えます。 </li><li> 5ミリリットルピペットでよく細胞懸濁液を混ぜます。チューブからの100μlの細胞懸濁液を取り、血球計数器を用いて細胞の数を数えます。これを行うには、トリパンブルー溶液300μlの細胞懸濁液100μlを混合し、血球計数器に混合物を2μlを挿入します。顕微鏡下で4つの別々のビューからブルー染色することなく、細胞数をカウントします。この数は、10 4細胞/ mlを表すように、各ビューからの細胞数を平均化します。 </li><li>一方、30で細胞懸濁液の入ったチューブを遠心分離7分間0 XG。培地を吸引し、1.0×10 6 / mlの密度でGL261細胞懸濁液を作製するために、新鮮なRPMI培地で細胞ペレットを再懸濁します。 27.5ミリリットルのDMEM（1日目）とT-175フラスコにRPMI培地の2.5 mlの種子2.5×10 6 GL261細胞。 </li><li> 24時間後、20ミリリットル新鮮なDMEM（2日目）で培地を交換してください。 </li><li>レンチウイルスベクターを製造するために、5分間の2ミリリットルの無血清DMEMで54μlのトランスフェクション試薬を混ぜます。トランスフェクション試薬を含むDMEMにギャグ-POLの3μgの、水疱性口内炎ウイルスGエンベロープ（VSV-G）の3μgの、およびFluc細胞の4.5μgの（PSIN-Fluc細胞）を追加し、室温で20分間インキュベートします。 293-Tフラスコ（T-175）に全体のDNAの混合物を落とし、48時間（2日目）、95％空気および5％CO 2を含む加湿チャンバー中、37℃でインキュベートします。 </li><li> （3日目）（約30 mlであるべきである293-T細胞培養培地の全体積）トランスフェクション後24時間で新鮮なDMEMを10mlを加えます。 </li><li> GL261細胞を分割するには24ウェルプレート、フラスコを保持することにより、5 mlのピペットで粉砕物がわずかに傾斜し、5分間37℃でトリプシン5mlの（0.05％）で細胞をインキュベートし、のCa2 +およびMg2 +を含まないPBSで細胞を1回洗浄、フラスコの底からすべての細胞を採取し、ステップ1.2のように血球計数器を介して細胞をカウントします。一方、7分間300×gでチューブを遠心します。培地を吸引し、2.5×10 4 / mlの密度でGL261細胞懸濁液を作製するために、新鮮なRPMI培地で細胞ペレットを再懸濁します。シード2.5×10 24ウェルプレート（3日目）でRPMI培地1mlの4 GL261細胞。 </li><li> 48時間後、トランスフェクションで293-Tフラスコ（T-175）から10 mlピペットでレンチウイルス上清の30ミリリットルを収集し、50mlコニカルチューブに上清を移します。吸引し、50mLの注射器を経由して30ミリリットルレンチウイルス上清、0.22μmのシリンジフィルターを通して、及び1mlアリコート（4日目）にウイルス上清を分取します。 </li><li> Rの1ミリリットルを交換PMIのレンチウイルス上清1mlでGL261細胞プレート（24ウェル）中の培地と加湿チャンバー（4日目）に、37℃でインキュベートします。 </li><li>レンチウイルス感染の48時間後、新鮮なRPMI（6日目）の1mlで培地を交換してください。 </li><li> 24時間後、GL261細胞（7日目）のレンチウイルス感染を繰り返します。 </li><li>レンチウイルス感染の2 番目の 48時間後、新鮮なRPMI（9日目）1mlの培地を交換してください。 </li><li>修飾されたルシフェラーゼGL261細胞を成長し続ける（GL261.lucセルと呼ぶことにする）と、T-75フラスコに細胞培養物を拡張します。 </li><li> GL261.luc細胞培養物は、T-75フラスコ中で70％コンフルエントに達したとき、トリプシン処理により細胞を回収し、工程1.2と同様に血球計数器によりカウントします。卒業密度で24ウェルプレートにGL261.luc細胞をプレート（1.0×10 6 5.0×10 5、2.5×10 5、1.0×10 5、5.0×10 4、2.5×10 4細胞 /ウェル）、 humidiで37℃でインキュベート3時間、95％空気および5％CO 2を含む fiedがチャンバ。 </li><li>細胞のルシフェラーゼ活性の相対測定は、生物発光イメージング（ 図1）を使用して、U-87 MG（U87.luc）細胞を改変ルシフェラーゼします。 <ol><li> （デスクトップ上のアイコンをクリック）画像ソフトウェアを起動し（「初期化」ボタンをクリックします）イメージング・システムを初期化します。初期化が自動的に開始され、システムチェックアップと-90℃に冷却するカメラのいくつかの分かかる場合があります。 </li><li>各ウェルにルシフェリン25μlの（D-ルシフェリンカリウム塩、150mgの/キログラム）を追加します。 </li><li> 10秒間、プレートを室温で1分間、ルシフェリンと画像で細胞をインキュベートします。イメージング・システムを設定するには、「発光」、「10秒」の露光時間、および「中」ビニングを選択します。イメージングステーションの24ウェルプレートを配置し、画像を開始するには、「取得」ボタンをクリックします。 </li><li>画像が正常に取得されたら、画像ウィンドウとツールPAが表示されます画面上レット。 「ROI（関心領域）ツール」をクリックして、スリットのアイコンから6×4を選択します。 24ウェルプレートの画像上の信号の領域をカバーし、測定タブ（鉛筆のアイコン）をクリックし、6×4のスリットを作成します。平方cm当たりステラジアンあたり毎秒光子（フォトン/秒/ SR / cm 2）での単位として、ROIの測定値のテーブルと窓を観察します。 </li><li>以前GL261ためにここで使用したものと同じで修飾されたレンチウイルスの使用U87.luc細胞は、形質導入GL261.luc細胞におけるルシフェラーゼ活性を評価するための対照として、11を変形しました。 </li></ol></li></ol> インビトロ増殖アッセイ2. <ol><li> GL261とGL261.luc細胞培養物は、T-75フラスコ中で70％コンフルエントに達したとき、トリプシン処理により細胞株の両方を収穫し、ステップ1.2のように数え、1500細胞の密度で96ウェルプレートにプレート細胞よく時間ピペッティング誤差を最小化するためにマルチチャンネルピペットを使用してあたりRPMI培地80μlの。セED 20ウェルの合計に各細胞株。細胞によって取り込まウェル中の蒸発を制限するために、新鮮なRPMI培地100μlの空のウェルを埋めます。 </li><li>比色細胞増殖アッセイを使用して細胞増殖を評価します。ここでは、MTS細胞増殖アッセイを使用しています。マルチチャンネルピペットを使用して、細胞を含む96ウェルプレートの各ウェルに20μlのMTS試薬を加えます。 </li><li> 3時間、95％空気および5％CO 2を含む加湿チャンバー中、37℃でプレートをインキュベートします。マイクロプレートリーダーを用いて490nmで吸光度を測定します。これはプレーティング後、1日目、2、4、および7で繰り返されます。吸光度値を正規化するために、毎日の値は、1日目（ 図2）で得られた対応する測定値で割ます。 </li></ol> 3.腫瘍細胞移植注：すべての機器をオートクレーブ。消毒剤（2％クロルヘキシジン溶液）を噴霧することにより、手術領域を準備し、absorbenでカバートンのカーテン。 、無菌状態を維持する手術中に無菌手術用手袋を着用し、色のテープで2つの領域に手術領域を分割するために。エリア1は、「クリーン」と表示された、滅菌供給を含んでいます。エリア2は、「ダーティ」と表示されたと使用される材料が含まれています。 <ol><li>動物の手術の前に、頭蓋内注射用の細胞懸濁液を準備します。 70％コンフルエントのT-75フラスコをトリプシン処理することにより、ステップ1.2のように血球計数器を介して細胞をカウントし、Ca 2+をすることなく、ハンクス平衡塩溶液中に1.0×10 5細胞 /μLの濃度で細胞懸濁液を作り、から収穫細胞Mg 2+を（HBSS）。 </li><li> 0.9％生理食塩水でキシラジンのケタミンを100mg / kgおよび10mg / kgを含む200μlの混合物の腹腔内注射でマウスを麻酔。適切な麻酔を確認するために、マウスのつま先をつまみます。マウスが完全に麻酔下であれば、マウスが刺激に応答すべきでありません。 </li><li> 0.1メートルの管理皮下注射によりグラム/ kgのブプレノルフィンは、術後の痛みを緩和します。 </li><li>バリカンを使用して、動物の頭の上を剃る、2％クロルヘキシジン溶液に浸漬綿チップアプリケーターで清掃してください。手術中に適切な潤滑を維持するために、眼軟膏を適用します。 </li><li>滅菌メスを用いて、頭頂後頭部の骨の上に約1cmの長矢状切開を行います。ブレグマを視覚化するために、3％過酸化水素水に浸した綿チップアプリケーターで頭蓋骨の表面を拭きます。 </li><li>ブレグマの右に、ちょうど冠状縫合の後ろに小さな穴3ミリメートルを作るために、無菌の25-G針で頭蓋骨をドリル。 </li><li>頭蓋内注射部位は頭蓋骨から3mmの深さにあることを確実にするために、はさみを使用して、20μlのピペットチップの先端から3ミリメートルをカットし、ピペット先端に注射器を挿入します。 </li><li>以前に作成した穴に垂直に注射器を挿入し、ゆっくりと腫瘍細胞のSUSを注入1分間かけて3μlのHBSS中3.0×10 5個の細胞を含む年金。別の分の場所にある針のままにして、ゆっくりと針を引き抜きます。 </li><li> 3％過酸化水素と2％クロルヘキシジン溶液に浸した綿先端アプリケーターで頭蓋骨を綿棒。綿チップアプリケーターで頭蓋骨の表面を乾燥させます。サイズは3約3ミリメートル無菌骨ワックスを切り出し、綿先端アプリケーターの端側の骨ろうを添付します。綿チップアプリケーターで穴をカバーするために、骨のワックスを適用します。 </li><li>ピンセットを用いて頭蓋骨の上に一緒に頭皮の各側面を描き、ステープルは、創傷を閉鎖します。 2％クロルヘキシジン溶液に浸漬綿チップで傷をきれいにしてください。 </li><li>彼らは歩行になるまで手術後、すべてのマウスを監視し、正常な活性を保持しています。典型的には、回復時間は約30分です。彼らは完全に麻酔から回復するまで、他の動物とのケージにマウスを返しません。 </li></ol><ol><li>清潔なペーパータオル上の消毒剤の寛大な量（0.05％ジメチル塩化アンモニウム溶液）をスプレーしてください。徹底的に動物がデバイスと接触するイメージング室内の黒いシート、ノーズコーンと分周器を拭くために消毒剤に浸したペーパータオルを使用してください。徹底的にきれいな乾いたペーパータオルですべての表面を拭いてください。もう一度これを繰り返し、5分間待ってください。 </li><li>ステップ1.14.1のように画像形成ステーションを初期化します。 </li><li>腹腔内注射によって、ケタミン/キシラジン200μlのルシフェリン100μlの（D-ルシフェリンカリウム塩、150mgの/キログラム）を含む300μlの混合物を用いて、マウスを麻酔。 </li><li>注射後10分待ってからマウスが尾をつまんで麻酔下で完全にされているかどうかを確認。イメージング・システムを設定するには、「発光」、「オート」、露光時間、および「中」ビニングを選択します。イメージングstatiにマウスを置きますで、画像を開始するには、「取得」ボタンをクリックします。注射後の時間は、各撮像セッションと一致していることを確認してください。 </li><li>画像が正常に取得した後、画像ウィンドウとツールパレットが表示されます。 「ROIツール」をクリックして、サークルのアイコンから「自動」を選択します。関心領域を定義するには、画像上の信号の面積を取り囲む、その後SR光子/秒/ / cm 2の単位として、ROIの測定を行います。 </li><li>画像化チャンバの外にマウスを取り、彼らは歩行になるまでマウスを監視し、正常な活性を保持しています。典型的には、回復時間は約15分です。彼らは完全に麻酔から回復するまで、他の動物とのケージにマウスを返しません。 </li><li>体重減少（移植前の重量に対して20％以上の損失が相対的）、食欲不振（24時間のための完全な拒食症）、および持続的なpurposefuの欠如：動物は、以下の症状を提示するまで、週に二回生物発光イメージングによって腫瘍の成長を監視彼らは安楽死させるべき時に穏やかな刺激（最大得るために弱い試み）にL応答。頸椎脱臼に続いてCO 2チャンバーを用いて、これらの症状を有する動物を安楽死させます。 <ol><li>場所の安楽死室へのマウス（過密ないチャンバーを行う）と流入は5-6分間のCO 2を圧縮しました。すべての動物は、約5分後に呼吸無意識とではないことを確認します。 </li><li>チャンバからマウスを取ります。心臓は親指と人差し指の間に胸を感じによって暴行されていないことを確認し、全く点滅反射がないことを確認してください。 </li><li>平らな面に発生しやすい位置にマウスを拘束し、親指と他の手の人差し指と尾の片手と塩基と頭蓋骨の基部に首の後ろを把握します。 </li><li>頭部を拘束し、素早く後方尾を引きます。頭蓋骨は、親指と人差し指を使用して第1頸椎から分離されていることを確認してください。 </li></ol></li><li>ノームステップ2.3（ 図3A）のように生物発光イメージングの最初の日で得られた対応する測定値に対する毎日のアリゼの発光値。 </li><li>統計分析のために、カプラン-マイヤー推定量12を用いて、生存曲線を生成し、ログランク検定を使用して、13生存曲線間の差を比較します。 </li></ol>

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</ol>

開示すべき利益相反はありません。

同系の免疫応答性C57BL / 6マウスに頭蓋内に移植された場合のGL261マウス神経膠腫細胞は、ヒト神経膠腫異種移植動物モデルと比べていくつかの利点を提供します。異種移植腫瘍の多くは正確に浸潤性ヒト疾患を再現しないカプセル化された病変として成長。これとは対照的に、GL261腫瘍は、隣接する脳内に侵入するのを示しているだけでなく、血管新生、有糸分裂像、そして深い壊死7。腫瘍免疫学や免疫療法15、16を研究するとき最も重要なのは、C57BL / 6マウスは、完全な免疫系8を保持しています。以前の研究では、ヒト膠芽腫9、10に類似の免疫抑制T制御細胞を含む免疫抑制サイトカインTGF-βおよび頭蓋内腫瘍の強い発現を示しています。 ここで説明する簡単な方法は、GL261細胞によるルシフェラーゼの安定な発現を可能にします。我々は最近、シミを報告していますin vitroおよび GL261細胞と比較GL261.luc細胞の in vivoでの成長のLARは、同様の腫瘍の組織学的特性および免疫細胞に加えて17を浸透させます。 GL261.luc細胞を安定光子、従って検出可能な光に化学エネルギーに変換する基質ルシフェリンの酸化を触媒するルシフェラーゼを発現します。ルシフェリンは、安全に動物に投与し、腹腔内または静脈内注射後に血液脳関門を通過することができます。マウスのような小型の研究動物において、生物発光は、非侵襲的な方法11で外部から検知することができます。したがって、腫瘍増殖が直列動物の犠牲または高価なMRIまたはCT撮影を必要とせずに評価することができます。 プロトコルにおける重要なステップは、レンチウイルス形質導入だけでなく、任意のin vivo実験を開始する前に、in vitroでのルシフェラーゼの安定な発現の検証だけでなく、を含みます。伝達の損失がrequiがありリピートレンチウイルス感染の再。発現ベクターへの抗生物質耐性遺伝子の導入はまた、ルシフェラーゼ発現について選択するために使用することができます。細心の技術は、再現性の異なる治療群の比較を可能にするために正確な解剖学的位置における細胞の一貫した数を配置するために頭蓋内注入のために必要とされます。現在の研究およびルシフェラーゼを発現するGL261細胞の以前の研究の主な違いは、定位フレーム18の使用と比較して細胞を移植するためのフリーハンドの技術を使用することです。我々は以前フリーハンドテクニック19と整合注入の結果を示しました。フリーハンド技術の利点は、異なる治療薬のハイスループット分析を実行する能力です。私たちの手では、1時間で約60匹の動物を移植することができます。 技術を習得した後、技術の将来のアプリケーションは無限です。 GL261 demonstrとして有糸分裂のATE上昇し、ヒト膠芽腫に類似の腫瘍の急速な成長は、抗増殖治療を評価することができます。 GL261腫瘍は浸潤性及び血管形成であると同様に、抗浸潤および抗血管新生療法を使用することができます。人間のターゲットに向けた化学療法剤の効果を評価する際には注意が必要です。ルシフェラーゼ20を発現するヒト神経膠芽腫異種移植片を用いた以前の研究と比較すると、これは我々のモデルの限界と考えられます。また、腫瘍増殖の免疫療法戦略の効果は、GL261異種移植モデルで試験することができます。

悪性神経膠腫は、最も一般的で最も致死的なヒト脳腫瘍です。 最大限に外科的切除、放射線療法、および化学療法で治療した場合でも、主要な脳腫瘍紹介センター1、2、3では生存期間中央値が15〜20ヵ月のままである。 悪性神経膠腫の最も侵攻性の高い形態である膠芽腫は、有糸分裂体、血管新生、隣接する脳への浸潤、および偽パリサダ性壊死を特徴とする。 ヒト脳腫瘍細胞を用いた同所性脳腫瘍異種移植片は、神経腫瘍学研究において重要な機能を果たしており、ヒト臨床試験に先立って、新薬の試験のための前臨床翻訳を促進しました。ほとんどのヒト異種移植モデルは、ヒト疾患の多くの特徴を再現していますが、すべてのヒトベースの異種移植モデルシステムの基本的な制限は、免疫不全動物の使用です4。
無傷の宿主応答がないことは、腫瘍の形態と生着の効率の両方において、腫瘍の成長を明確に変化させます。異種移植モデルの結果の解釈には一定の仮定が許容されますが、治療評価の分野で適切な結論を得ることは困難です。特定の基本的な生物学的特徴は、免疫不全動物と免疫能力動物で類似している可能性がありますが、腫瘍関連の炎症、組織浸潤、損傷に対する反応などの他の特徴はおそらく非常に異なります。 対照的に、GL261は化学的に誘導されたマウス神経膠腫細胞株であり、免疫適格な同系C57BL/6マウスの脳に移植すると神経膠腫を正確に再現します5。 ヒトの疾患と同様に、頭蓋内腫瘍の増殖は急速かつ再現性よく神経学的症状を引き起こし、動物の死亡を引き起こします6-10。 
皮下腫瘍の成長を直接測定することができます。頭蓋内腫瘍の成長は、動物を犠牲にするか、費用のかかる画像検査によってのみ測定できます。 酵素ルシフェラーゼの安定した発現により、非侵襲的で費用対効果の高い頭蓋内生物発光イメージングが可能になります11。 ルシフェラーゼトランスフェクトされたGL261細胞の生物発光は、頭蓋内腫瘍の増殖とよく相関しています。最近、GL261 をルシフェラーゼ修飾 GL261 細胞と直接比較し、in vitro 増殖と浸潤、免疫学的サイトカイン プロファイル、C57BL/6 マウスを持つ頭蓋内腫瘍の in vivo 生存、または免疫細胞浸潤に差がないことを示しました。この手法は、腫瘍増殖の非侵襲的モニタリングを含む膠芽腫の前臨床試験に適用できます。

<table><tbody><tr><td>D-ルシフェリン、カリウムソルト、</td><td>ゴールド、バイオテクノロジー、</td><td>LUCK-100</td>、<td>光から離れて保管</td></tr>、<tr><td>リビングイメージソフトウェア</td><td>、キャリパー、ライフサイエンス</td><td>、引用の連絡先</td><td>、なし</td></tr>、<tr><td>Xenogen Lumina</td><td>キャリパー、ライフサイエンス</td>、<td>引用の連絡先</td><td>、なし</td></tr>、<tr><td>24ウェル;標準的な組織培養;平底</td><td>Falcon</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay&nbsp;</td><td>Promega</td><td>G3582</td><td>none</td></tr><tr><td>Synergy 2 Multi-Mode Reader</td><td>BioTek</td><td>Contact for Quote</td><td>none</td></tr><tr><td>96ウェル アッセイプレート、ブラックプレート、蓋付き透明底、組織培養 Tretaed</td><td>Coster</td><td>3603</td><td>none</td></tr><tr><td>Ketaset</td><td>ファイザー</td><td>NDC 0856-2013-01</td><td>コントロール物質</td></tr><tr><td>キシラジン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>23076-35-9</td><td>なし</td></tr><tr><td>28Gニードル(シリンジ付き)&nbsp;</td><td>フィッシャー&nbsp;&nbsp;</td><td>22-004-270</td><td>別名インスリン注射器</td></tr><tr><td>2% クロルヘキシジン</td><td>フィッシャー</td><td>NC9756995</td><td>別名 "ノルバサン"</td></tr><tr><td>3%過酸化水素</td><td>フィ</td><td>ッシャーH312P-4</td><td></td></tr>軽い<tr><td>眼科軟膏</td>カー<td>ディナルヘルス</td><td>1272830</td><td>別名」から離れて保管アクワの涙」</td></tr><tr><td>25G 1 1/2 針</td><td>BD ベクトン ディキンソン</td><td>305127</td><td>なし</td></tr><tr><td>使い捨てメス</td><td>フェザー</td><td>2975</td><td>No. 21</td></tr><tr><td>ガーゼ</td><td>フィッシャー</td><td>22028563</td><td>オートクレーブ 使用前に</td></tr><tr><td>加熱パッド</td><td>ダンラップ</td><td>HP950</td><td>なし</td></tr><tr><td>スキン ホッチキス、ステープル、リムーバー</td><td>ストールティング</td><td>59020</td><td>なし</td></tr><tr><td>PDI アルコール 準備パッド</td><td>フィッシャー</td><td>23-501-711</td><td>なし</td></tr><tr><td>反射 7 mm 傷口クリップ 100 パック</td><td>ブレインツリー サイエンティフィック、INC</td><td>203 1000</td><td>使用前のオートクレーブ</td></tr><tr><td>反射 7 mm 傷口クリップ アプライヤー</td><td>ブレインツリーサイエンティフィック、INC</td><td>204 1000</td><td>使用前のオートクレーブ</td></tr><tr><td>反射 7 mm 傷口クリップリムーバー</td><td>ブレインツリーサイエンティフィック、INC</td><td>205 1000</td><td>なし</td></tr><tr><td>シングルエンド ラウンドチップ スワブ ウッドハンドル付き</td><td>Qosmedix</td><td>10107</td><td>オートクレーブ使用前</td></tr><tr><td>Ca2+およびMg2+を含まないハンクス平衡塩溶液(HBSS)</td><td>Gibco</td><td>14170-112</td><td>なし</td></tr><tr><td>Hamilton Syringe</td><td>Hamilton</td><td>80300</td><td>なし</td></tr><tr><td>FuGENE 6 トランスフェクション試薬</td><td>Promega</td><td>E2961</td><td>なし</td></tr><tr><td>Bone Wax</td><td>Harvard Apparatus</td><td>599864</td><td>なし</td></tr></tbody></table>

神経膠芽腫のための免疫担当動物モデルの生物発光イメージング

Bioluminescence Imaging of an Immunocompetent Animal Model for Glioblastoma

一般的に報告されているヒト神経膠腫異種移植動物モデルとは対照的に、GL261マウス神経膠腫異種移植片は、ヒト疾患のほぼすべての関連する臨床的および組織病理学的特徴を再現しています。 GL261細胞を同系C57BL/6マウスに頭蓋内に移植すると、このモデルには無傷の免疫微小環境を維持するという追加の利点があります。 GL261細胞におけるルシフェラーゼの安定発現により、頭蓋内腫瘍増殖の非侵襲的で費用対効果の高い生物発光モニタリングが可能になります。私たちは最近、GL261細胞におけるルシフェラーゼの発現が、腫瘍の増殖特性、腫瘍細胞の免疫調節性サイトカインの発現、免疫細胞の腫瘍への浸潤、または頭蓋内腫瘍を持つ動物の全生存に影響を与えないことを実証しました。したがって、GL261ルシフェラーゼ神経膠腫モデルは、新規の化学療法および免疫療法モダリティの研究に役立つようです。 本稿では、GL261細胞において安定的にルシフェラーゼを発現させる技術と、生物発光イメージングによる腫瘍細胞のin vitroおよびin vivo増殖の検討方法について報告する。

インビトロでの生物発光イメージングのステップ 1で上述したようGL261細胞は、レンチウイルスを含むルシフェラーゼに感染させたヒト神経膠芽腫細胞株U87.luc陽性対照（ 図1）におけるレベルに類似ロバストルシフェラーゼ発現を示しています。予想されたように、非感染GL261細胞は、バックグラウンドのルシフェラーゼ発現を示さありません。このステップは、前の安定したルシフェラーゼ発現を確認するために、感染した細胞株を用いてさらに研究するために実行する、シンプルでありながら非常に重要です。 頭蓋内注入後のルシフェラーゼ発現。 頭蓋内注入前に、GL261細胞（ 図2）に比べGL261.luc の in vitroでの成長率に差を示さありませんでした。頭蓋内の増殖および生存分析のために、細胞を、BRに注入しましたGL261.luc腫瘍を有するマウスのステップ3腫瘍の増殖プロトコルに従ってC57BL / 6マウスのAINSはシリアルプロトコル手順4を用いて、生物発光イメージングのために分析し、検出可能な腫瘍増殖（ 図3A）を実証しました。迅速かつ一貫GL261.luc腫瘍を有するマウスは、瀕死状態になり、安楽死させました。重要なことには、GL261.luc動物軸受GL261腫瘍（ 図3B）との間の全体的な生存率の差はない。 インビボでの生物発光イメージングは、それ故、実験神経膠芽腫の治療に対する応答をモニターするために使用することができます。迅速な信頼性の腫瘍増殖及び短い全生存期間は、比較的短い時間で大量のデータを得ることができます。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53287/53287fig1.jpg" /> GL261.luc細胞図1.ルシフェラーゼ活性。U87.luc、GL261.lucとGL261（ネガティブコントロール）細胞はの密度でプレーティングしました1.0×10 6、5.0×10 5、2.5×10 5、1.0×10 5、5.0×10 4、2.5×10 4細胞/ウェル、左から右へ。発光（光子/秒/ SR / cm 2）とルミナイメージングステーションで測定した。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53287/53287fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53287/53287fig2.jpg" /> 図2.ルシフェラーゼ発現は、GL261細胞の増殖には影響を与えません。GL261.luc細胞は発生しません MTS細胞増殖アッセイによって実証されるように、増殖の差。平均吸光度値を比較することによって決定されるように、グラフは、1日目に比べて倍の増加を示し、（1日目での平均値にthespecified時点の比較のための不対のt検定値（平均±SEM）各細胞株の間で：P = 0.7796）、14。エラーバーは、それぞれの日に四連のサンプルの平均値（平均±SEM）を表す。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53287/53287fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/53287/53287fig3.jpg" /> 図3.ルシフェラーゼ発現は 、in vivoでの 腫瘍増殖および動物の生存 に影響を与えない用量 。 （A）生物発光の監視、C57BL / 6マウスにおける頭蓋内GL261.luc腫瘍の進行成長を示している。（B）のカプラン・マイヤー生存分析は、GL261（実線）またはGL261.luc細胞のいずれかで頭蓋内に移植したマウスの全体的な生存率に差は示さありません（破線）。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

GL261神経膠腫細胞は、神経膠芽腫の有用な免疫適格動物モデルを提供します。このプロトコルの目標は、in vivo 生物発光イメージングを使用して頭蓋内腫瘍の成長を監視するための適切な技術を実証し、腫瘍免疫学および神経膠芽腫を治療するための免疫療法アプローチを研究するためのルシフェラーゼ修飾 GL261 細胞の有用性を検証することです。

In contrast to commonly reported human glioma xenograft animal models, GL261 murine glioma xenografts recapitulate nearly all relevant clinical and ...

このプロトコルの全体的な目的は、GL261マウス腫瘍細胞のルシフェラーゼ修飾の有用性を検証するため、生体内生物発光イメージングを用いて腫瘍細胞および頭蓋内腫瘍の増殖をモニタリングする適切な手法を提示することです。この手法は、腫瘍免疫学および免疫療法的アプローチの研究における重要な疑問、例えば、ストレス修飾がGL261細胞の増殖や生体内での成長に影響を与えるかといった問いに答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、GL261腫瘍細胞にルシフェラーゼを導入することで、in situにおける腫瘍の増殖および治療への反応を非侵襲的にモニタリングできることです。T75フラスコ内のGL261ルシフェラーゼ細胞のコンフルエンシーが70%に達したら、トリプシン処理により細胞を回収します。細胞数をカウントした後、段階的な密度で24ウェルプレートに播種します。細胞培養インキュベーターで3時間静置した後、バイオルミネッセンスイメージングソフトウェアを起動し、イメージングシステムを初期化します。カメラが-90°Cまで冷却されたら、イメージングソフトウェアの設定をLuminescentに、露光時間を10秒、ビニングをMediumに設定します。次に、ウェルあたり25 µLのルシフェリンを加え、室温で1分間インキュベートした後、プレートをイメージングステーションに設置します。Acquireを選択してイメージングを開始します。画像が正常に取得されると、画像ウィンドウとツールパレットが表示されます。Regions of Interest Toolsをクリックし、スリットアイコンから6 by 4を選択してください。信号領域を6×4のスリットで覆い、「Measurements」タブの鉛筆アイコンを選択します。関心領域の測定値が、1秒間・1ステラジアン・1平方センチメートルあたりの光子数として表形式で表示されるウィンドウが現れます。in vitro増殖アッセイを行うには、細胞培養が70%コンフルエンシーに達した時点で、先ほど示した方法で細胞を回収してください。マルチチャンネルピペットを使用して、96ウェルプレートの20ウェルに、1ウェルあたり80 µLのRPMI培地に1.5 × 10³個の腫瘍細胞を分注します。細胞培養液の蒸発を抑えるため、周囲の空きウェルに100 µLの新鮮なRPMI培地を満たします。その後、細胞増殖能を評価するため、各細胞ウェルに20 µLのMTS試薬を添加します。プレートを37°C、5% CO₂でインキュベートします。3時間後、マイクロプレートリーダーを用いて490 nmでの吸光度を測定します。吸光度を標準化するため、各日の値を1日目に得られた対応する測定値で除します。移植当日、70%コンフルエントに達した腫瘍細胞培養液から、カルシウムおよびマグネシウムを含まないHBSSを用いて1×10⁵ cells/µLに懸濁します。次に、足指へのピンチ刺激により適切な鎮静レベルにあることを確認した後、各実験動物の頭頂部を剃毛します。綿棒を用いて、各頭蓋骨を2%クロルヘキシジンで洗浄してください。次に、各マウスの眼に潤滑剤を塗布します。続いて、滅菌メスを用いて、1匹目の動物の頭頂後頭骨上に約1 cmの正中切開を加えます。そして、ブレグマの位置を確認しながら、3%過酸化水素で頭蓋骨の表面を再度洗浄します。次に、滅菌済みの25ゲージ針を使用し、ブレグマの右側で冠状縫合線の直後に3 mmの孔を頭蓋骨に開けます。適切な注入深度を確保するため、ハサミで20 µLピペットチップの先端から3 mmを切り落とし、26ゲージのHamiltonシリンジを、針先がチップの端から3 mm出るまでチップの中にスライドさせて挿入します。針を頭蓋骨の孔に挿入し、3 × 10⁵個の腫瘍細胞 3 µLを1分間かけてゆっくりと注入します。針をそのまま1分間保持し、その後ゆっくりと抜去します。露出した骨を3%過酸化水素溶液と2%クロルヘキシジン溶液で洗浄します。次に、新しい綿棒で頭蓋骨を乾燥させ、滅菌済み骨ワックスを3平方ミリメートルの大きさに切り出し、綿棒の先端に取り付けます。注入部位をボーンワックスで覆います。次に、ピンセットを使用して、頭皮の両側をワックスの上に引き寄せます。創部を閉鎖し、適切な術後鎮痛剤を投与した後、各実験動物に対してこの手順を繰り返します。頭蓋内腫瘍の成長を画像化するには、まず、先ほど示した通りにイメージングステーションを初期化します。次に、テイルピンチで適切な鎮静レベルを確認した後、先ほど示した通りにイメージングシステムのパラメータを設定します。ただし、露光時間はAutoを選択してください。イメージングシステムの準備が整ったら、マウスをイメージングステーションに配置し、[Acquire]を選択してルシフェラーゼ発現の画像を取得します。画像の取得に成功したら、ツールパレットから[Region of Interest Tool]を選択し、円形アイコンから[Auto]を選択します。シグナル領域を囲って関心領域（ROI）を定義し、その領域の測定値をphotons per second, per steradian per square centimeterの単位で取得します。最後に、マウスをイメージングチャンバーから取り出し、腫瘍を担有する動物が完全に回復するまで観察します。ルシフェラーゼ含有レンチウイルスを感染させたGL261細胞のin vitro生物発光イメージングでは、陽性対照であるルシフェラーゼ発現U87MGヒト神経膠芽腫細胞株で発現するルシフェラーゼレベルと同等の、強力なルシフェラーゼ発現が認められます。予想通り、非感染のGL261細胞では背景となるルシフェラーゼ発現は見られません。頭蓋内移植の前では、GL261ルシフェラーゼ細胞株とGL261細胞株のin vitroにおける増殖率に差は見られません。頭蓋内に腫瘍を注入した動物の連続的なバイオルミネッセンスイメージングで示されるように、GL261ルシフェラーゼ発現腫瘍細胞もin vivoで迅速かつ一貫した増殖率を示し、実験的な腫瘍担がん群間で生存率に有意な差は観察されませんでした。この手法を習得し適切に実施すれば、1時間あたり最大25匹のマウスをイメージングすることが可能です。本技術の開発により、生体内でGL261腫瘍の増殖をモニタリングする際の生物発光イメージングの有用性が向上し、免疫能を有するマウスモデルにおける免疫療法の反応に関するさらなる研究が可能になります。

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Research

JoVE Journal

Medicine

医学

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蛍光分子断層撮影法:マウスモデルにおける蛍光タンパク質タグ付き神経膠芽腫異種移植片のIn vivoイメージングのためのイメージング技術

出典: Clark, AJ, et al. 神経膠芽腫に対する免疫担当動物モデルの生物ルミネセンスイメージングJ. Vis.

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神経膠芽腫のための免疫担当動物モデルの生物発光イメージング

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