イメージング免疫学的シナプスダイナミクス内皮平面内細胞モデル

この技術の全体的な目標は、内皮細胞を新しいタイプの平面抗原提示細胞モデルとして利用し、基本的な抗原シグナル伝達プロセスを調査することです。この方法は、免疫学的シナプス内で細胞内および分子のリモデリングダイナミクスが空間的および時間的にどのように調整されているかなど、適応免疫の分野における重要な問題に対処するのに役立ちます。この技術の主な利点は、内皮がPC表面を仮想的に平面化して形成することです。

これにより、生理学的に複雑で成形可能な細胞表面のコンテキスト内で、最適な時空間分解能でのイメージングが可能になります。この方法は、CDの4つの陽性TH1つのエフェクターメモリー細胞の活性化に焦点を当てていますが、さまざまなT細胞タイプの抗原およびシグナル伝達プロセスの研究にも適用できます。今日は、クリスと私が、メンブレンYFPとNU核愛情を介して可溶性DS redで初代ヒト肺または真皮微小血管内皮細胞をコードトランスセクトし、トランスフェクションされた細胞をライブセルイメージング培養プレートにプレートすることで、2番目のBeginを実行する方法をご紹介します。

翌日、細胞培養培地をインターフェロンガンマを添加した新鮮な培地に交換して、内皮細胞にM MHC 2の発現を誘導し、続いて24時間後の3日目に30〜60分後にTNFαのミリリットルあたり20ナノグラムで細胞を刺激する。実験を開始する前に、内皮を1ミリリットルあたり1マイクログラムでインキュベートし、細菌のスーパー抗原ブドウ球菌エンテロトキシンBと毒素ショック症候群毒素をそれぞれ摂氏37度でインキュベートします。インキュベーション中に、目的のリンパ球培養物からの生存細胞の数を数え、細胞の10倍から6分の1を2倍にして15ミリリットルの円錐管に移します。

次に、細胞をスピンダウンし、ペレットを新たに調製したバッファーAの2ミリリットルに再懸濁して、細胞クラスターが残らないようにします。次に、2マイクロモルのRA 2をT細胞サンプルに加え、チューブにキャップをして、すぐに均一に反転させます。細胞懸濁液全体に色素を分布させます。

摂氏37度で30分間のインキュベーション後、標識リンパ球をスピンダウンし、細胞を20〜40マイクロリットルの新鮮なバッファーAに穏やかに、しかし完全に再懸濁して生画像にすると、細胞は顕微鏡システムをオンにし、適切な画像キャプチャソフトウェアを開きます。自動マルチチャンネルタイムラプスイメージング、および取得間隔を10〜30秒、合計約20〜60分に適切なパラメータを設定します。次に、目的に新鮮なオイルを追加します。

0.5ミリリットルのバッファーAが入った顕微鏡皿を加熱ステージアダプターに取り付け、以前に摂氏37度に設定したアダプターをすぐにオンにします。2〜3分間の平衡化後、20マイクロリットルのピペットを使用して、静止しているRAの2つの装填されたリンパ球を取り付けられた顕微鏡ディッシュチャンバーに追加し、明視野イメージングをオンにします。接眼レンズへの光路を選択し、コースフォーカスノブを使用して対物レンズを顕微鏡皿の底に接触させます。

次に、接眼レンズとファインフォーカスノブを使用して、ディッシュの底に沈殿したT細胞を特定し、適切な細胞が見つかったらXYステージコントロールを使用して、少なくとも10個の細胞を含むフィールドを選択します。明視野光源から蛍光光源へ、IPイメージングからCCDカメラへ切り替えます。取得パラメータを最適化してから、静止している Fira 2 3 40 および FIRA 2 3 80 の画像を取得します。

良好な結果を生成するための重要なステップの1つは、蛍光取得パラメータを慎重に最適化し、十分なシグナルが収集されるようにし、fira twoの場合はベースライン3 43 80比が1に近くなるようにすることです。FIRAの2つの露光時間が設定されたら、T細胞の皿を内皮細胞の顕微鏡皿に交換し、使い捨ての移送ピペットを使用して、培地を迅速に取り出し、細胞を1ミリリットルの予熱緩衝液Aで一度すすぎ、次に洗浄液を0.5ミリリットルの新鮮な緩衝液Aと交換します。次に、fira 2で示したように、メンブレンYFPとDS REDの取得パラメータを調整します。

各チャンネルの平均蛍光シグナル強度が検出器のダイナミックレンジの25〜75%の間に収まるように注意してください。ライブセルイメージング実験を行う前に、内皮細胞のみの画像を数間隔で取得し、自動化されたソフトウェアでベースラインを確立します。次に、対物レンズの中心に近いメディアに少量の先端を挿入します。

5マイクロリットルの濃縮フィラ、2つのロードされたリンパ球を顕微鏡ディッシュイメージングフィールドの中心にゆっくりと分配します。リンパ球が落ち着いたら、T細胞内皮細胞インターフェースが焦点面に維持されるように、焦点を微調整します。40倍と63倍の対物レンズでは、フィールドあたり10〜20個のセルが最適です。

所望の観察間隔の後、イメージングを続行し、直ちにCINを顕微鏡皿に直接ピペットで注入し、最終濃度を2マイクロモルにして、最大のカルシウムフラックススフェラを誘導します。2つの信号。細胞に治療を適用するときは、免疫シナプスリモデリングの最適な解像度を確保するために、内皮の頂端膜YFP標識表面に鋭く焦点を合わせ続けるように注意してください。

内皮スーパー抗原特異的CD上にスーパー抗原がない場合、4つの陽性TH1リンパ球は急速に広がり、分極し、内皮細胞上を横方向に移動します。この過程で、リンパ球は短寿命の突起またはILPを内皮表面に伸ばし、これはスーパー抗原の存在下での足跡に類似した膜YFP蛍光のリングとして明らかであり、ILPによって駆動される細胞間の近接接触は、カルシウムフラックスの開始と関連しており、免疫学的シナプス内に安定化されたILPが蓄積します。このようなILPアレイは、持続的なカルシウムシグナル伝達に結合されています。

T細胞内皮細胞の相互作用中に形成される膜蛍光のリングは、内皮細胞の離散的な陥入スポットを駆動するT細胞突起に対応しており、これらのリングが変位した細胞質および排除された細胞質のゾーンと空間的および速度論的に相関していることが実証されています。スーパー抗原接着の存在下で内皮細胞とT細胞を共インキュベートしてから数分以内に、抗原シグナル伝達に関連する分子とシグナル伝達分子が免疫シナプスのポタプリントとILP内で濃縮されます。実際、T細胞内皮免疫シナプスは、抗原認識分子機構が濃縮されている抗原提示細胞表面に広がるT細胞ILPによって中断された目立たない三次元構造を示します。

このアプローチにより、既存のPCモデル内の主要な障害を克服することができ、他の方法では検出できない3D細胞内構造の観察と、生理学的T細胞のPCインターフェースの迅速なリモデリングが可能になります。これにより、抗原シグナル伝達プロセスの新たなレベルの理解が可能になる可能性を秘めています。