Name: イメージング免疫学的シナプスダイナミクス内皮平面内細胞モデル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: 学ぼう 内皮細胞を用いた平面抗原提示細胞モデルによる免疫学的シナプスのダイナミクス解析法。高解像度イメージングでT細胞活性化メカニズムを可視化し、適応免疫の理解を深める革新的アプローチです。

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代表的な画像を生成するための支援をしてくださったPeter T. Sage博士に感謝します。この研究は、C.V.C. (HL104006) に対する NIH R01 助成金によって支援されました。

<ol><li>von Andrian, U. H., Mackay, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell+function+and+migration.+Two+sides+of+the+same+coin%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">T-cell function and migration. Two sides of the same coin.</a> N. Engl. J. Med. 343 (14), 1020-1034 (2000).</li>
<li>Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesion+receptors+of+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Adhesion receptors of the immune system.</a> Nature. 346 (6283), 425-434 (1990).</li>
<li>Shaw, A. S., Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+the+T+cell+receptor+go+the+distance%3A+a+topological+view+of+T+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Making the T cell receptor go the distance: a topological view of T cell activation.</a> Immunity. 6 (4), 361-369 (1997).</li>
<li>Monks, C. R., Freiberg, B. A., Kupfer, H., Sciaky, N., Kupfer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+segregation+of+supramolecular+activation+clusters+in+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells.</a> Nature. 395 (6697), 82-86 (1998).</li>
<li>Delon, J., Stoll, S., Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+T-cell+interactions+with+antigen+presenting+cells+in+culture+and+in+intact+lymphoid+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Imaging of T-cell interactions with antigen presenting cells in culture and in intact lymphoid tissue.</a> Immunol Rev. 189, 51-63 (2002).</li>
<li>Brossard, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multifocal+structure+of+the+T+cell+-+dendritic+cell+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Multifocal structure of the T cell - dendritic cell synapse.</a> Eur J Immunol. 35 (6), 1741-1753 (2005).</li>
<li>Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cellular+context+of+T+cell+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The cellular context of T cell signaling.</a> Immunity. 30 (4), 482-492 (2009).</li>
<li>Balagopalan, L., Sherman, E., Barr, V. A., Samelson, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+techniques+for+assaying+lymphocyte+activation+in+action%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Imaging techniques for assaying lymphocyte activation in action.</a> Nat Rev Immunol. 11 (1), 21-33 (2011).</li>
<li>Cebecauer, M., Spitaler, M., Serge, A., Magee, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signalling+complexes+and+clusters%3A+functional+advantages+and+methodological+hurdles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Signalling complexes and clusters: functional advantages and methodological hurdles.</a> J Cell Sci. 123, 309-320 (2010).</li>
<li>Oddos, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-speed+high-resolution+imaging+of+intercellular+immune+synapses+using+optical+tweezers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">High-speed high-resolution imaging of intercellular immune synapses using optical tweezers.</a> Biophys J. 95 (10), L66-L68 (2008).</li>
<li>Grakoui, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunological+synapse%3A+a+molecular+machine+controlling+T+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation.</a> Science. 285 (5425), 221-227 (1999).</li>
<li>Bunnell, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+receptor+ligation+induces+the+formation+of+dynamically+regulated+signaling+assemblies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">T cell receptor ligation induces the formation of dynamically regulated signaling assemblies.</a> J Cell Biol. 158 (7), 1263-1275 (2002).</li>
<li>Yokosuka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Newly+generated+T+cell+receptor+microclusters+initiate+and+sustain+T+cell+activation+by+recruitment+of+Zap70+and+SLP-76%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Newly generated T cell receptor microclusters initiate and sustain T cell activation by recruitment of Zap70 and SLP-76.</a> Nat Immunol. 6 (12), 1253-1262 (2005).</li>
<li>Seminario, M. C., Bunnell, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+initiation+in+T-cell+receptor+microclusters%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Signal initiation in T-cell receptor microclusters.</a> Immunol Rev. 221, 90-106 (2008).</li>
<li>Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supported+bilayers+at+the+vanguard+of+immune+cell+activation+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Supported bilayers at the vanguard of immune cell activation studies.</a> J Struct Biol. 168 (1), 152-160 (2009).</li>
<li>Martinelli, R., Carman, C. V. Lymphocyte Endothelilal Interactions. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMartinelli%2C+R+%22Encyclopedia+of+Cell+Biology%22">Encyclopedia of Cell Biology</a>. Bradshaw, R. A., Stahl, P. , Elsevier. London. (2015).</li>
<li>Choi, J., Enis, D. R., Koh, K. P., Shiao, S. L., Pober, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+lymphocyte-endothelial+cell+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">T lymphocyte-endothelial cell interactions.</a> Annu Rev Immunol. 22, 683-709 (2004).</li>
<li>Marelli-Berg, F. M., Jarmin, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+presentation+by+the+endothelium%3A+a+green+light+for+antigen-specific+T+cell+trafficking%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Lett%22%5BJournal%5D)">Antigen presentation by the endothelium: a green light for antigen-specific T cell trafficking?</a> Immunol Lett. 93 (2-3), 109-113 (2004).</li>
<li>Sage, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+recognition+is+facilitated+by+invadosome-like+protrusions+formed+by+memory%2Feffector+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Antigen recognition is facilitated by invadosome-like protrusions formed by memory/effector T cells.</a> J Immunol. 188 (8), 3686-3699 (2012).</li>
<li>Kumari, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+foci+facilitate+activation+of+the+phospholipase+C-gama+in+primary+T+lymphocytes+via+the+WASP+pathway+%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Actin foci facilitate activation of the phospholipase C-gama in primary T lymphocytes via the WASP pathway .</a> eLife. , (2015).</li>
<li>Marelli-Berg, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Major+histocompatibility+complex+class+II-expressing+endothelial+cells+induce+allospecific+nonresponsiveness+in+naive+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Major histocompatibility complex class II-expressing endothelial cells induce allospecific nonresponsiveness in naive T cells.</a> J Exp Med. 183 (4), 1603-1612 (1996).</li>
<li>Ma, W., Pober, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+endothelial+cells+effectively+costimulate+cytokine+production+by%2C+but+not+differentiation+of%2C+naive+CD4%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Human endothelial cells effectively costimulate cytokine production by, but not differentiation of, naive CD4+ T cells.</a> J Immunol. 161 (5), 2158-2167 (1998).</li>
<li>Perez, V. L., Henault, L., Lichtman, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+antigen+presentation%3A+stimulation+of+previously+activated+but+not+naive+TCR-transgenic+mouse+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Immunol%22%5BJournal%5D)">Endothelial antigen presentation: stimulation of previously activated but not naive TCR-transgenic mouse T cells.</a> Cell Immunol. 189 (1), 31-40 (1998).</li>
<li>Epperson, D. E., Pober, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen-presenting+function+of+human+endothelial+cells.+Direct+activation+of+resting+CD8+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Antigen-presenting function of human endothelial cells. Direct activation of resting CD8 T cells.</a> J Immunol. 153 (12), 5402-5412 (1994).</li>
<li>Shiao, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+effector+memory+CD4%2B+T+cells+directly+recognize+allogeneic+endothelial+cells+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Human effector memory CD4+ T cells directly recognize allogeneic endothelial cells in vitro and in vivo.</a> J Immunol. 179 (7), 4397-4404 (2007).</li>
<li>Marelli-Berg, F. M., Okkenhaug, K., Mirenda, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+two-signal+model+for+T+cell+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">A two-signal model for T cell trafficking.</a> Trends Immunol. 28 (6), 267-273 (2007).</li>
<li>Carman, C. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcellular+diapedesis+is+initiated+by+invasive+podosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Transcellular diapedesis is initiated by invasive podosomes.</a> Immunity. 26 (6), 784-797 (2007).</li>
<li>Carman, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+for+transcellular+diapedesis%3A+probing+and+pathfinding+by+%27invadosome-like+protrusions%27%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Mechanisms for transcellular diapedesis: probing and pathfinding by 'invadosome-like protrusions'.</a> J Cell Sci. 122 ((Pt 17)), 3025-3035 (2009).</li>
<li>Dustin, M. L., Tseng, S. Y., Varma, R., Campi, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell-dendritic+cell+immunological+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Immunol%22%5BJournal%5D)">T cell-dendritic cell immunological synapses.</a> Curr Opin Immunol. 18 (4), 512-516 (2006).</li>
<li>Saito, T., Yokosuka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological+synapse+and+microclusters%3A+the+site+for+recognition+and+activation+of+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immunological synapse and microclusters: the site for recognition and activation of T cells.</a> Curr Opin Immunol. 18 (3), 305-313 (2006).</li>
<li>Gomez, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HS1+functions+as+an+essential+actin-regulatory+adaptor+protein+at+the+immune+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">HS1 functions as an essential actin-regulatory adaptor protein at the immune synapse.</a> Immunity. 24 (6), 741-752 (2006).</li>
<li>Burbach, B. J., Medeiros, R. B., Mueller, K. L., Shimizu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell+receptor+signaling+to+integrins%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">T-cell receptor signaling to integrins.</a> Immunol Rev. 218, 65-81 (2007).</li>
<li>Vicente-Manzanares, M., Sanchez-Madrid, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+cytoskeleton+during+leukocyte+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Role of the cytoskeleton during leukocyte responses.</a> Nat Rev Immunol. 4 (2), 110-122 (2004).</li>
<li>Ma, Z., Janmey, P. A., Finkel, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+receptor+deformation+model+of+TCR+triggering%5BTitle%5D)+AND+%22Faseb+J%22%5BJournal%5D)">The receptor deformation model of TCR triggering.</a> Faseb J. 22 (4), 1002-1008 (2008).</li>
<li>Ma, Z., Sharp, K. A., Janmey, P. A., Finkel, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface-anchored+monomeric+agonist+pMHCs+alone+trigger+TCR+with+high+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Surface-anchored monomeric agonist pMHCs alone trigger TCR with high sensitivity.</a> PLoS Biol. 6 (2), e43(2008).</li>
<li>Groves, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bending+mechanics+and+molecular+organization+in+biological+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Phys+Chem%22%5BJournal%5D)">Bending mechanics and molecular organization in biological membranes.</a> Annu Rev Phys Chem. 58, 697-717 (2007).</li>
<li>Xu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+T+cell+receptor+activation+by+dynamic+membrane+binding+of+the+CD3epsilon+cytoplasmic+tyrosine-based+motif%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Regulation of T cell receptor activation by dynamic membrane binding of the CD3epsilon cytoplasmic tyrosine-based motif.</a> Cell. 135 (4), 702-713 (2008).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

全体的に、このプロトコルは、ⅰ）understudied生理学的なAPCとして内皮細胞を調査するための方法を説明し、ii）の「平面携帯APCモデル」の新規タイプとして。前者に関しては、ますます適応免疫応答16-18を形成する上で（造血APCに比べて、 すなわち ）を、周辺非造血（または「間質&#39;）APCは、重要な、非冗長な役割を果たしていることが理解されるようになりました。このような「セミプロ」のAPC、血管と（非常にプロフェッショナルAPCを上回っ）リンパ管内皮細胞の中では最高の16〜18感謝の一つです。しかし、シグナル伝達事象の詳細とその結合された免疫学的シナプスの大部分は未調査のままです。本明細書に記載の方法は、この新興地域での理解を進めるための基礎を提供します。例えば、個別のadaptivを示すことが知られている別の組織からの内皮上に形成されたISの研究にこれらの方法を適用しますE免疫学的機能 （例えば、肝臓およびリンパ内皮）が特に有益かもしれません。 重要なことに、この方法は、適応免疫応...

Tリンパ球は、主要組織適合遺伝子複合体（MHC）に結合した、効率的ペプチド抗原（銀）を認識する能力を特徴と適応免疫系の分岐であるが、それらのT細胞受容体（TCR）を介して1分子。ナイーブリンパ球恒常移行し、「プロのAg提示細胞」（APCは、 例えば 、樹状細胞）をスキャンするメモリ/エフェクターT細胞が効果的に末梢組織内のAPCおよび潜在的な標的細胞の非常に広い範囲を調査する必要がある一方で、リンパ節内。 APC上の同族銀の当初認識以下分では、リンパ球は、それらの移動を阻止し、（IS）「免疫シナプス」と呼ばれる特殊な親密な細胞間のインタフェースを形成し始めます。持続（ すなわち 、30〜60分）は接点が増幅し、2-7のシグナリング維持する必要がありますされています。新興の研究では、IS内、それが連続形成し、迅速なRであることを識別強度および免疫応答2-7を得られるの品質を決定する（ すなわち 、MHC / AgをTCR、F-アクチン、接着およびシグナル伝達分子を含む）は、離散サブ細胞シグナルマイクロクラスタemodeling。しかし、このプロセスの動的な詳細及び調節機構は不完全に理解されている8,9。これは、APC表面の不規則なトポロジーに関連する技術的な課題や細胞間相互作用面のコントロール不良の向き、深く必要な時空間イメージングは8月10日 （Figure1A）に近づく制限の問題から大きく茎。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53288/53288fig1.jpg" /> イメージング免疫学的シナプスのダイナミクスについては、図1のA生理学的平面内細胞APCモデル。概略的には、T細胞とprofessio間の免疫学的シナプスの伝統的なイメージングを示しています<html>最終APC（A）とT細胞とこの新規内皮平面APCモデル（C）と比較して、従来の平面脂質二重層APCモデル（B）。プロフェッショナルAPCは、生理学的、免疫学的シナプスを提供するが、不十分指向細胞間のインタフェースを提供（最適なX-Yの撮像面に対してすなわち 、;解像度〜0.2μm）で、劇的空間（Zの撮像面〜1μmの分解能）および時間的（ すなわち 、妥協します繰り返しイメージングのすべてのzイメージングプレーン）の解像度をスキャンする必要性に起因します。二層モデルは、最適な時空間分解能イメージングを提供する平面のトポロジーを持っているだけでなく、高度に簡略化された非生理学的な剛性です。この内皮細胞モデルは、生理学的な設定で最適な空間と時間的画像の解像度を提供するために、古典的なAPCの生理学的基質と脂質二重層の平面トポロジを兼ね備えています。M /ファイル/ ftp_upload / 53288 / 53288fig1large.jpg「ターゲット= &quot;_空白&quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 以前の研究は、部分的に最適なXYイメージングに平行である、単一の計画に、T細胞活性化の面を固定経由で最適な時空間解像度（ すなわちを提供し 、平面基板モデル（ すなわち 、脂質二重層と抗体被覆表面）、開発することによって、これらの障害物を回避していますプレーン）11-15（ 図1B）。これらのモデルは、動的なアクチン/ TCRシグナリングマイクロクラスター7,11-14の発見を含むT細胞における抗原性のシグナル伝達を制御する分子/細胞内動態に重要な洞察を容易にしました。しかし、このようなモデルは、本質的に単純化されるだけでなく、剛性（ 図1B）（3次元位相幾何学的特徴の開発/研究を排除）。したがって、PHYに、このような調査結果を関連付ける方法を依然として不透明siologic細胞 - 細胞免疫監視。 まだunderstudiedものの、血管やリンパ管の内皮細胞は、「セミプロ」のAPC 16-18の大（ すなわち 、〜1000倍により、すべてのプロフェッショナルAPCより数の大きい）周辺の区画として浮上しています。これらの細胞は、MHC-I、MHC-II-および共刺激分子の多数を表現（例えば、CD40、LFA3、ICOSL、4-1BB、OX40L、TL1A、PD-L1;ではなく、CD80およびCD86）と戦略的です彼らは16-18特殊なセンチネル機能を果たし、血液-組織界面に位置します。以前の研究では、内皮細胞が効果的にエフェクター/メモリー、しかしナイーブではない、T細胞の19-25を再刺激することができることを実証しました。従って、内皮細胞は、T細胞の活性化、分化、メモリーと寛容16,17,26のローカル影響などの末梢組織中での適応免疫応答のエフェクター相に固有のAPCの役割を果たしている可能性があります。 CRIin vitroで増殖させた場合tically、 内皮細胞は、実質的に平面状のセル表面を形成し、（蛍光タンパク質レポーターを用いて、 例えば、）容易にトランスフェクトされています。これらの機能は、細胞間相互作用19,27の間の位相幾何学的力学の高時空間分解能イメージングに最適です。従って、内皮細胞は、抗原認識を駆動し、応答（ 図1C）19,20 を制御する細胞内分子/改造メカニズムの研究のための明らかに適した生理的な「平面携帯APC」モデルとなる恐れがあります。 接着および経内皮移動27中の白血球-内皮相互作用の詳細を研究するための（形質膜と細胞質ゾルの蛍光タンパク質メーカーと内皮細胞のトランスフェクションを含む）以前に確立された補完的なイメージング技術は、白血球が積極的にダイナミックによって内皮の表面を探査することを示しました挿入ANサブミクロンスケールのd後退は、アクチン豊富な円筒状の突起が（〜直径、深さ200〜1,000 nm）をinvadosome状突起（ すなわち 、「ILPS &#39;）27,28と呼ばれます 。これらのイメージング手法は、さらに19,20を報告し、本明細書でさらに説明するように、T細胞、内皮免疫学的シナプスの高時空間分解能イメージングのための最初の方法を開発する内皮APC機能を利用するためのプロトコルの作成 ​​に伴って拡張されました。この小説平面携帯APCモデル由来中央知見は、T細胞ILPSは、初期のAg検出を促進する上で、その後のシグナル伝達を維持するには、両方の機能することです。実際、（安定化およびカルシウム流入初期に応じて計上されていた）、TCRと活性なシグナルなどのPKC-Q、ZAP-70、ホスホチロシンとHS1の示唆に富む分子でshow濃縮を複数ILPSの配列。したがって、ILPSは、TCRシグナルマイクロへの3次元生理学的同等を表しているように見えます平面二重層モデルで見られたクラスタ。このアプローチは、このように、敏感に明らかに/レポート分子と建築（および生体力学的暗黙の）ダイナミクスそうでなければ検出できません。 本明細書に記載の方法は、適応免疫応答の基本的なメカニズムを調べるために我々の能力を向上させるために、プロのAPCと人工APC基板モデル間のギャップを埋めるに有用であるはずです。ここでの焦点は、CD4 + Th1型エフェクター/メモリー細胞の活性化にある間に、以下に説明するように、この基本的なアプローチは、容易に、T細胞型とのAgの広い範囲を研究するために改変することができます。

<table><tbody><tr><td>BDバキュテナーストレッチラテックスフリー止血帯</td><td>BDバイオサイエンス</td><td>367203</td><td></td></tr><tr><td>BDアルコール綿棒</td><td>BDバイオサイエンス</td><td>326895</td><td></td></tr><tr><td>BDバキュテイナーセーフティロック</td><td>BDバイオサイエンス</td><td>367861</td><td>K2 EDTA</td></tr><tr><td>BDバキュテイナープッシュボタン採血セット</td><td>BDバイオサイエンス</td><td>367335</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td>シ<td>グマ-アルドリッチ</td><td>R8758-1L</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GE17-1440-02</td><td>使用前にRTに持参</td></tr><tr><td>FCS-Optima</td><td>Atlanta Biologics</td><td>s12450</td><td>熱不活性化</td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4458-100ML</td><td></td></tr><tr><td>トリパンブルー</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154-20ML</td><td></td></tr><tr><td>ブドウ球菌エンテロトキシンB</td><td>毒素技術</td><td>BT202RED</td><td>PBS</td></tr><tr><td>毒素ショック症候群毒素1</td>毒素<td>技術</td><td>TT606RED</td> PBSヒトIL-15R&の<td>ストック溶液1mg / ml</td></tr><tr><td></td><td>D Systems</td><td>247-IL-025</td><td>PBS</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>10010-049</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>Life Technologies</td><td>33016-015</td><td>H20</td></tr><tr><td>HMVEC-d Ad-Dermal MV Endo Cells</td><td>Lonza</td><td>CC-2543</td><td>他のヒト微小血管ECs、すなわちHLMVECs</td></tr><tr><td>EGM-2 MV弾丸キット</td><td>Lonza</td><td>CC-3202</td><td></td>を使用することができます。</tr><tr><td>トリプシン-EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-4174</td><td>ストック溶液 10x、PBSで希釈</td></tr><tr><td>amaxa-HMVEC-L Nucleofector Kit</td><td>Lonza</td><td>vpb1003</td><td>ステップ4に必要なキット</td></tr><tr><td>IFN-g</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I3265</td><td>ストック溶液 1mg/ml in H20</td></tr><tr><td>TNF-alpha 10ug, human</td><td>Life Technologies</td><td>PHC3015</td><td>Stock solution 1mg/ml in H20</td></tr><tr><td>phenol Red-free HBSS</td><td>Life Technologies</td><td>14175-103</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP299-100</td><td></td></tr><tr><td>塩化カルシウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1016-100G</td><td>H20</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>208337</td> H20 Sigma-Aldrich <td>1M H20</td></tr><tr><td>ヒト血清アルブミン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6909-10ml</td><td></td></tr><tr><td>Immersol 518 F蛍光フリー 液浸油</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>12-624-66A</td><td></td></tr><tr><td>フラ-2 AM 20x50ug</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ F1221</td><td>DMSO</td></tr><tr><td>pEYFP-MEM (Mem-YFP)</td> <td>クロンテック</td><td>6917-1</td><td></td></tr><tr><td>pDsレッドモノマー (可溶性細胞質 DsRed)</td><td>クロンテック</td><td>632466</td><td></td></tr><tr><td>pDsレッドモノマー メンブレン (Mem-DsRed)</td><td>クロンテック</td><td>632512</td><td></td></tr><tr><td>pEGFP-Actin</td><td>Clontech</td><td>6116-1</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td><td>Life Technologies</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>ホルムアルデヒド溶液 37%</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP531-500</td><td>有毒、フュームフードを使用</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-5ML&</td><td></td></tr><tr><td>nbsp;ファルコン15mLコニカル遠心分離管フィ</td><td>ッシャーサイエンティフィック</td><td>14-959-70C</td><td></td></tr><tr><td>ファルコン50mLコニカル遠心分離管フィ</td><td>ッシャーサイエンティフィック</td><td>14-959-49A&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ファルコン組織培養処理フラスコT25</td>フィ<td>ッシャーサイエンティフィック</td><td>10-126-9</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;ファルコン組織培養処理フラスコT75</td>フィ<td>ッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>&nbsp; 13-680-65</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;コーニング細胞培養処理T175</td>フィ<td>ッシャーサイエンティフィック</td><td>10-126-61&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ガラスカバースリップ&nbsp;</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>12-545-85&nbsp;</td><td>直径12mm</td></tr><tr><td>&nbsp;ファルコン組織培養プレート 24ウェル</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>08-772-1</td><td></td></tr><tr><td>デルタ-Tプレート</td><td>バイオテックス</td><td>04200415B</td><td></td></tr><tr><td>ウィートン 使い捨てパスツール ピペット</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>13-678-8D</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml エッペンドルフチューブ&nbsp;</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>05-402-25</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;ICAM1 マウス 抗ヒト</td><td>BD Biosciences</td><td>555509</td><td></td></tr><tr><td>HS1 マウス 抗ヒト</td><td>BD Biosciences</td><td>610541</td><td></td></tr><tr><td>抗ヒト CD11a (LFA-1α) 精製</td><td>ebioscience</td><td>BMS102</td><td></td></tr><tr><td>抗ヒト CD3 Alexa Fluor&reg; 488</td><td>ebioscience</td><td>53-0037-41</td><td></td></tr><tr><td>抗 MHC クラス II 抗体&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab55152</td><td></td></tr><tr><td>抗タリン1抗体</td><td>Abcam</td><td>ab71333</td><td></td></tr><tr><td>抗PKCシータ抗体&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab109481</td><td></td></tr><tr><td>ホスホチロシン (4G10 プラチナ)</td> <td>ミリポア</td><td>50-171-463</td><td></td></tr><tr><td>ヌクレオフェクター II</td><td>アマクサ バイオシステム</td><td></td><td>ステップ 4 に必要なエレクトロポレーター</td></tr><tr><td>ツァイス アクシオバート</td><td>カール ツァイス マイクロイメージング</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ツァイス LSM510&nbsp;</td><td>Carl Zeiss MicroImaging</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Axiovison ソフトウェア</td><td>Carl Zeiss MicroImaging</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NU-425 (Series 60) 生物学的安全キャビネット</td><td>NuAIRE</td><td>Nu-425-600</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;フォルマSTRCYCLE 37 &deg;C、5% CO2細胞培養インキュベーター</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>202370</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機 5810</td><td>エッペンドルフ</td><td>EW-02570-02</td><td></td></tr><tr><td>血球計算盤</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&nbsp;Z359629</td><td>Bright-Line 血球計算盤</td></tr><tr><td>Isotemp Waterbath モデル 202</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-462-2</td><td></td></tr></tbody></table>

イメージング免疫学的シナプスダイナミクス内皮平面内細胞モデル

An Endothelial Planar Cell Model for Imaging Immunological Synapse Dynamics

適応免疫は、T細胞と抗原提示細胞（「APCの &#39;）との間の動的な相互作用によって調節される「免疫学的シナプス」と呼ばれます。これらの親密な細胞間のインタフェース内の個別のサブセルラーMHC / AgをTCRのクラスター、F-アクチン、接着およびシグナル伝達分子を形成し、急速に改造。これらのダイナミクスは、病理学的免疫対開発し、したがって、保護の免疫応答の効率と品質の両方の重要な決定要因であると考えられています。生理学的なAPCとの免疫学的シナプスの現在の理解を得ることができる画像解像度の不足によって制限されます。人工基質モデル （例えば、平面脂質二重膜）は、優れた解像度を提供し、非常に貴重なツールとなっているが、彼 ​​らは本質的に非生理学的および単純化し過ぎています。血管とリンパ内皮細胞は重要な末梢組織（または間質）として出現した「半専門職のコンパートメントアルのAPC」。 （プロフェッショナルAPCの分子機構のほとんどを発現する）これらのAPCは、事実上平面状細胞表面を形成するユニークな機能を持っており、（蛍光タンパク質レポーターで、 例えば ）は、容易にトランスフェクトされています。基本的な抗原性シグナル伝達プロセスの改善されたイメージング及び質問のための新規な及び生理的な「平面セルラーAPCモデル &#39;に説明するように内皮細胞を実装するために、本明細書の基本的なアプローチ。

内皮細胞を使用し、生理的な複雑さとプロフェッショナルAPCの変形能を有する平面脂質二重層モデルの解像度の利点を組み合わせた新たなイメージング手法は、（ 図1）を開発しました。2本で観察された典型的な移行、カルシウムフラックスとトポロジカルダイナミクスの例を示します。図アプローチ。内皮上のサグ不在下でサグ特異的CD4 +のTh1リンパ球が急速に偏光さ、広がり、カルシウムを流動させずに内皮表面（ 図2A）を介して横方向に移動する（図示せず）。 〜5-10分以内に、これらのリンパ球は、内皮を通過する遊出を開始します。彼らが示す、その間、内皮へのSAg搭載の存在下では、リンパ球（すなわち、30〜60分間）は、細胞内カルシウムフラックス（動画1 図2B）持続、「目玉焼き」トポロジーと対称的に広がっ開始しますほとんど、あるいは全くの移行（ 図2...

適応免疫は、T細胞と抗原提示細胞との間に形成される動的な「免疫学的シナプス」によって制御されます。このプロトコルは、研究が進んでいない生理学的APCとして、また新しいタイプの「平面細胞APCモデル」として、内皮細胞を調査するための方法を説明しています。

Adaptive immunity is regulated by dynamic interactions between T cells and antigen presenting cells (&#39;APCs&#39;) referred to as &#39;immunological ...

本手法の全体的な目的は、血管内皮細胞を新しいタイプの平面的な抗原提示細胞モデルとして利用し、基礎的な抗原シグナル伝達プロセスを調査することです。この手法は、免疫シナプス内において、細胞内および分子の再構成ダイナミクスが空間的および時間的にどのように調整されているかなど、獲得免疫分野における重要な問いを解決するのに役立ちます。本手法の主な利点は、内皮細胞が実質的に平面的なAPC表面を形成することにあります。これにより、生理学的に複雑で変形可能な細胞表面という状況において、最適な時空間解像度でのイメージングが可能になります。本手法はCD4陽性Th1エフェクターメモリー細胞の活性化に焦点を当てていますが、さまざまなT細胞タイプ、抗原、およびシグナル伝達プロセスの研究にも適用できます。本日は、クリスと共に、第2のステップについて説明します。まず、核注入法を用いて、膜結合型YFPおよび可溶性DS redを一次ヒト肺または皮膚微小血管内皮細胞に共導入し、導入後の細胞をライブセルイメージング用培養プレートに播種することから始めてください。翌日、細胞培養液をinterferon gammaを添加した新鮮な培地に交換し、内皮細胞にM MHC twoの発現を誘導させます。その後、3日目の24時間後に20 ng/mLのTNF alphaで細胞を刺激します。実験を開始する前に、細菌スーパーアンチゲンであるstaphylococcal enterotoxin Bおよびtoxic shock syndrome toxin oneをそれぞれ1 µg/mL添加し、内皮細胞を37 °Cでインキュベートします。インキュベーション中に、目的のリンパ球培養液から生存細胞数をカウントし、2 × 10⁶個の細胞を15 mLコニカルチューブに移します。次に、細胞を遠心分離して回収し、細胞凝集塊が残らないように、調製したばかりのバッファーA 2 mLでペレットを再懸濁します。その後、T細胞サンプルに2 µMのRAを加え、チューブの蓋を閉めてすぐに転倒混和し、染料を細胞懸濁液全体に均一に分散させます。37°Cで30分間インキュベートした後、ラベル付けしたリンパ球を遠心分離し、ライブイメージング用に20〜40 µLの新鮮なバッファーAで細胞を穏やかに、かつ十分に再懸濁します。顕微鏡システムを起動し、適切な画像キャプチャソフトウェアを開きます。自動マルチチャンネルタイムラプスイメージングの適切なパラメータを設定し、取得間隔を10〜30秒、総時間を約20〜60分に設定します。次に、対物レンズに新鮮なオイルを滴下します。0.5 millilitersのバッファーAを入れた顕微鏡用ディッシュを加熱ステージアダプターに固定し、あらかじめ37 degrees Celsiusに設定しておいたアダプターのスイッチを直ちに入れます。2〜3分間平衡化させた後、20 microliterピペットを用いて、静止状態のRA two負荷リンパ球を固定した顕微鏡用ディッシュのチャンバー内に添加し、明視野イメージングをオンにします。接眼レンズへの光路を選択し、粗動フォーカスノブを使用して、対物レンズを顕微鏡用ディッシュの底面に接触させます。次に、接眼レンズと微動絞りを用いてディッシュの底部に沈降したT細胞を特定し、適切な細胞が見つかったらXYステージコントロールを使用して、少なくとも10個の細胞を含む視野を選択します。明視野から蛍光光源へ、またIPイメージングからCCDカメラへと切り替えます。取得パラメータを最適化した後、静止状態のFira 2 3 40およびFIRA 2 3 80の画像を撮影します。良好な結果を得るための重要なステップの一つは、蛍光取得パラメータを慎重に最適化し、十分な信号が収集されるようにすること、そしてFIRA 2の場合にはベースラインの3 43 80比が1に近くなるようにすることです。FIRA 2の露光時間を設定したら、使い捨て移送ピペットを用いてT細胞のディッシュを血管内皮細胞の顕微鏡用ディッシュに交換し、速やかに培地を除去して、あらかじめ温めておいた1 mLのバッファーAで細胞を1回洗浄し、その後、洗浄液を0.5 mLの新鮮なバッファーAに置き換えます。対物レンズを用いて、明るい蛍光を発する血管内皮細胞が健全に見える視野を特定してください。次に、FIRA 2で行ったのと同様に、膜YFPおよびDS REDの取得パラメータを調整します。各チャネルの平均蛍光信号強度が、検出器のダイナミックレンジの25%から75%の間に収まるように注意します。ライブセルイメージング実験を行う前に、自動ソフトウェアを用いてベースラインを確立するため、内皮細胞のみの画像をいくつかの間隔で撮影します。その後、小容量ピペットのチップを対物レンズの中心に近い培地中に挿入します。5 µLの濃縮したfiraおよび負荷済みリンパ球を、顕微鏡皿のイメージング視野の中央にゆっくりと分注します。リンパ球が沈降するに従い、T細胞と内皮細胞の界面が焦点平面に維持されるよう、ピントを微調整します。40倍および63倍の対物レンズにおいて、1視野あたり10～20個の細胞が最適です。所定の観察間隔の後、イメージングを継続しながら、最大カルシウムフラックスを誘導するために CIN を最終濃度 2 µM になるよう顕微鏡ディッシュに直接ピペッティングします。細胞に処理を施す際は、免疫シナプスの再構成を最適な解像度で捉えるため、内皮細胞の YFP 標識された頂端膜表面に鋭い焦点を合わせ続けるよう注意してください。内皮細胞上にスーパーアンチゲンが存在しない場合、内皮スーパーアンチゲン特異的なCD4陽性TH1リンパ球は、急速に拡散・分極し、内皮細胞上を側方へ遊走します。この過程で、リンパ球は内皮表面に向かって短寿命の突出部（ILP）を伸展させます。これは、スーパーアンチゲン存在下における足跡のような、膜YFP蛍光のリング状の構造として観察されます。ILPによって誘導される密接な細胞間接触は、カルシウムフラックスの開始に関連しており、これにより免疫シナプス内に安定化したILPが蓄積します。このようなILPアレイは、持続的なカルシウムシグナリングと共役しています。T細胞と血管内皮細胞の相互作用中に形成される膜蛍光のリングは、T細胞の protrusions（突起）に対応しており、これらが血管内皮細胞における個別の陥入部位を誘導していることが、これらのリングが細胞質の置換および排除領域と空間的および速度論的に相関しているという実証によって確認されています。スーパーアンチゲン存在下で血管内皮細胞とT細胞を共培養すると、数分以内に、抗原シグナリングに関連する接着およびシグナリング分子が、免疫シナプスの pota prints および ILPs 内に共濃縮されます。実際に、T細胞と血管内皮細胞の免疫シナプスは、抗原認識分子機構が濃縮されたT細胞 ILPs が抗原提示細胞の表面へと伸長する、明確な三次元構造を示します。このアプローチにより、既存のPCモデルにおける主要な障害を克服でき、従来では検出不可能であった3D細胞内構造や、生理学的なT細胞-PCインターフェースの急速なリモデリングの観察が可能になります。これにより、抗原シグナル伝達プロセスの理解を新たなレベルへと引き上げる可能性が開かれます。

an-endothelial-planar-cell-model-for-imaging-immunological-synapse

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

サポートされている平面脂質二重層は、免疫学的シナプスの分子間相互作用をモデル化するために使用できる強力なツールです。ここで、我々は、脂質のbilyerの上部のリーフレットにシナプス形成を調節し、全反射顕微鏡を用いてシナプス形成を可視化するために知られている細胞接着タンパク質を固定するための方法を示しています。...

免疫シナプスとKinapseの研究の形成のためのサポートされている平面二重層

この資料では、全内部反射蛍光（全反射）顕微鏡による平面脂質二重層をサポートしてガラス基板上にHIV-1エンベロープによって誘導されるウイルス学的シナプスの形成を可視化する方法について説明します。方法はまた、HIV-1エンベロープ誘発性ウイルス学的シナプス形成時に発生するシグナル伝達分子の活性化および再配布を検出する免疫​​蛍光染色と組み合わせることができます。...

合成脂質二重膜上でHIV-1エンベロープ誘発性ウイルス学的シナプスとシグナリングのイメージング

このビデオは、初代ヒトT細胞と担持脂質二重膜(SLB)との間の免疫シナプス形成を研究するin...

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このビデオは、免疫学的シナプストポロジーの生細胞イメージングを実演し、Tリンパ球と蛍光抗原を運ぶ上皮細胞との間の相互作用を調査しています。蛍光顕微鏡法では、内皮細胞に赤い細胞質の変位と黄色の膜輪が見られ、免疫学的シナプスの形成が示唆されています。...

生細胞イメージングによる免疫学的Synapseトポロジーの評価

出典:Ing-Esteves, S. &amp; Lefebvre, J. L. Time-Lapse Imaging of Neuronal Arborization using Sparse Adeno-Associated Virus Labeling of Genetically Targeted Retinal Cell Populations.J. Vis. Exp.

マウス網膜外植片における神経細胞樹状細胞ダイナミクスのタイムラプス共焦点イメージング

ここでは、2色STEDナノスによってガラス上で要約NK細胞の細胞傷害性免疫シナプスを撮像するためのプロトコルを示す。この方法を用いて、我々は、サブ100nmシナプスタンパク質の分解能と細胞骨格を得た。...

デュアルカラータイム·ゲーティッド誘導放出枯渇（STED）ナノスによる免疫シナプスの可視化

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好中球遊出の下で生理的流れの間に内皮細胞 - 細胞接合のリアルタイムイメージング

ここでは、免疫学的シナプスを形成するガラス支持脂質二重膜技術と、誘導放出枯渇(STED)顕微鏡の超解像イメージング技術の組み合わせについて説明します。このプロトコルの目標は、これら 2...

グラスサポート平面脂質二重層上のナチュラルキラー細胞免疫シナプスの超解像イメージング

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フローサイトメトリーをイメージングを用いた人間システムの免疫シナプスの定性・定量分析

このプロトコルは、免疫学的シナプス形成とその後の分極分泌トラフィックの両方を免疫学的シナプスに向かって画像化する。細胞コンジュゲートは、超抗原パルスラジ細胞(抗原提示細胞として作用する)とユルカトクローン(エフェクターヘルパーTリンパ球として作用する)との間に形成された。...

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血液脳関門のモデル化のためのMicroSiM(μSiM)バリア組織プラットフォームの使用

学ぼう 内皮細胞を用いた平面抗原提示細胞モデルによる免疫学的シナプスのダイナミクス解析法。高解像度イメージングでT細胞活性化メカニズムを可視化し、適応免疫の理解を深める革新的アプローチです。

イメージング免疫学的シナプスダイナミクス内皮平面内細胞モデル

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