2.5: 発達研究のため培養

外植片培養とは、胎児や胚から組織や臓器全体を摘出する(「摘出」)し、体外培養する(ex vivo)技術です。これらの方法は、器官形成と呼ばれる臓器や組織の成長を直接観察できるようにすることで、発生のプロセスを理解するのに役立つユニークな窓を提供します。

このビデオでは、外植片培養の基本原理を検証し、手順の主要なステップを概説し、典型的な操作について説明し、発生研究におけるこの手法の具体的なアプリケーションを提供します。

外植片の培養方法を説明する前に、この手法の背後にあるいくつかの原則を確認しましょう。

外植片培養は、広範囲の生物由来のさまざまな胚組織に適用できます。この手法は、形態形成として知られる構造変化を時間の関数として直接観察できるため、臓器発生の研究に理想的です。さらに、組織を実験分子で処理して、発生への影響を判断できます。さらに、外植片培養を遺伝子発現を変更するための分子ツールや蛍光顕微鏡と組み合わせることで、細胞や組織の分化の問題に対処するための強力なツールになります。

次に、哺乳類組織の外植片培養のプロトコールをレビューします。

手順を開始するには、安楽死させた妊娠中のげっ歯類から胚を取り出します。周囲の膜を除去した後、胚を単離します。次に、目的の組織または器官を抽出された胚から単離し、成長のためにプレートに移します。抗生物質を含む培地を添加し、プレートを37°Cのインキュベーターセットで成長させます。

外植片の培養が確立されると、いくつかの種類の操作を行うことができます。

例えば、外植された組織を遺伝子操作して、特定の発生過程における目的の遺伝子の役割を試験することができる。これは、注入されたDNAを近くの細胞に電気場で駆動するエレクトロポレーションなどの技術を用いて、遺伝物質を組織に導入することで達成できます。

外植片は、成長因子などのシグナル伝達分子が器官形成で果たす役割をテストするためにも頻繁に使用されます。in vitroで培養した組織は、化合物での治療が培地に加えるのと同じくらい簡単であるため、これらのタイプの研究に特に有用です。ただし、実験化合物に浸した小さなビーズを組織に埋め込むことで、化学処理へのより制御されたアプローチをとることもできます。

どのようなアプローチであっても、外植片技術の主な利点は、光学顕微鏡や蛍光顕微鏡を用いて、実験的操作の影響をリアルタイムで容易に視覚化できることです。

それでは、ex vivo培養の具体的な応用例を見てみましょう。

まず、外植片は、組織の発生を直接視覚化できるモデルシステムを表しています。例えば、これらの研究者は、胚マウスから発生中の膵臓を取り出し、ガラス底の皿で培養してイメージングを改善しました。

組織の発達は光学顕微鏡で観察できますが、蛍光マーカーを発現するトランスジェニック組織を使用すると、尿細管の出芽などの発生過程をさらに詳細に観察できます。また、外植された組織には免疫染色を施すことができるため、研究者は、この青と緑のインスリン産生細胞のように、特定の細胞タイプの発生をモニターすることができます。

外植片培養の別の用途は、成長因子などの特定の分子が器官形成に果たす役割を解読することです。

ここでは、E12.5マウス胚から解剖した胎児肺外植片を、成長因子の存在下または非存在下で最大48時間増殖させた。結果は、この成長因子が胎児の肺の気道形成を阻害することを示しています。

最後に、初期胚からの外植片を使用して、胚形成の最初の段階での遺伝子発現を制御するメカニズムを特定できます。

これらの研究者は、カエルの胚の16細胞期から、背側構造を形成する運命にあるものと、腹側構造に寄与するものの2つの異なる細胞タイプを移植しました。外植片は、背側組織に特異的な遺伝子の発現パターンを特徴付けるために、染色前に約1日間発育させました。

この遺伝子の発現は背側領域からの外植片でのみ観察されたため、遺伝子発現プログラムは、発生の後半に発生する細胞間相互作用によって指示されるのではなく、これらの胚性細胞にコードされていると結論付けられました。

私たちは現在、外植片の培養システムを見て、それが発生研究にどのように使用できるかを観察しました。この技術は、動物の発生の根底にある分子メカニズムの理解を促進する強力なツールです。ご覧いただきありがとうございます!