Name: マイクロRNAトランスクリプトームの転写因子依存性調節を記述する (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: 学ぶ転写因子がマイクロRNAトランスクリプトームを調節するメカニズム。データマイニング、shRNAを用いた遺伝子サイレンシング、バイオインフォマティクス解析を統合し、神経科学における遺伝子発現制御の包括的理解を提供します。

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この研究は、CLLグローバル研究財団からの助成金によってサポートされていました。テキサス大学MDアンダーソンがんセンターは、がんセンターサポート助成金（P30CA16672）を通じて米国国立衛生研究所によって部分的にサポートされています。

1.データマイニング手法を用いたマイクロRNA遺伝子のプロモーターにおける転写因子結合部位を特定します<ol><li> DNA要素（ENCODE）プロジェクトの百科事典の一部として生成されたクロマチン免疫沈降（チップ）配列データを抽出するために、カリフォルニア大学サンタクルーズ（UCSC）ゲノムブラウザを使用してください。 <ol><li> UCSCゲノムブラウザでテーブルブラウザを開きます。 </li><li>テーブルを抽出するために、以下の仕様を使用します。クレード：（哺乳類）、ゲノム：（人間）、アセンブリ：（Feb2009（GRch37 / hg18））、グループ：（規制）、トラック（TxnFactorChIP）、テーブル：（weEncoderesTFbsCo7steredv3）、地域：（ゲノム）、出力形式（選択したテーブルからすべての遺伝子）。 </li><li> .txtファイルとして1.1.2からの出力を保存し、スプレッドシートに。 </li><li>関心の転写因子のためのソートやフィルタ（ 例えば 、STAT2）。 </li></ol></li><li> Baeer らで入手可能なH3K4me3とのエピジェネティクスのシグネチャに基づいて、マイクロRNAプロモーターのリストを使用してください。9 </suP&gt;。 .txtファイルにこのリストをコピーしてください。 </li><li>ヒトゲノム上の座標に応じて一致させるために、（ 例えば 、STAT3が推定されるマイクロRNAプロモーターに結合）1.1および1.2からのデータをマップし、補足的なコーディングファイル1に概説されるようにシャープなC言語で書かれたコードを使用して中央値の結合親和性を決定します。 </li></ol> 2. shRNAが関心の転写因子の発現をダウンレギュレートするために<ol><li>プレート約10cmプレート293ヒト胎児腎臓細胞株から1.5×10 6細胞を50％コンフルエンス（10％FBSを含むDMEM）。 </li><li> shRNAを含む緑色蛍光タンパク質（GFP）レンチウイルス5μgの293ヒト胎児腎臓細胞株由来のトランスフェクト細胞は、目的の転写因子に向けられ、パッケージングベクター5μgのは、製造者のプロトコルに従って接着細胞のためのトランスフェクション試薬を用いました。 </li><li>対照として、293ヒト胎児腎臓細胞株からの細胞をトランスフェクト製造業者のプロトコルに従ってのshRNAおよびパッケージングベクターをスクランブル。 </li><li> （37℃、CO 2インキュベーターで）16時間細胞にトランスフェクションミックスを維持し、次いで10％FBSで、新鮮な10％DMEM培地10ミリリットルにメディアを変更します。 </li><li>細胞培養（300×gで、5分間）遠心し、感染性上清を回収、48時間後にトランスフェクションを待ちます。任意の浮遊細胞を除去するために、0.45μmのシリンジフィルター（25mmの界面活性剤フリーのセルロースアセテート膜）を介して上清をフィルタリングします。 </li><li>上清を濃縮し、100キロダルトンの閾値と超遠心フィルター装置を使用してレンチウイルスを収集します。 30 950×gでスピン - ボリュームになるまで60分未満250μlに濃縮されています。 -80℃で濃縮したウイルスを保管してください。 </li><li>レンチウイルスを用いて細胞をトランスフェクト。 -80℃の冷凍庫から冷凍レンチウイルスを削除し、室温に解凍。新鮮な1.5mlマイクロチューブにウイルス上清100μlを移します。 <ol><li>ブリン低血清培地で1ミリリットルにチューブでボリュームアップグラム。 、10ng / mlの最終濃度を1ミリリットルのウイルス懸濁液に臭化ヘキサジメトリンを追加穏やかに混合し、混合物を5分間放置しました。 </li></ol></li><li>遠心し、5×10 6各形質導入のための細胞と穏やかには、ウイルスを含む培地0.5mlに細胞ペレットを再懸濁します。その後、10％FBSの最終濃度に20％FBSを含む培地の0.5ミリリットルを追加し、24時間 - 細胞が4インキュベーターに滞在してみましょう。 </li><li> 48〜72時間を待って、製造元の指示に従ってヨウ化プロピジウム（PI）および緑色蛍光タンパク質（GFP）で細胞を染色します。光から細胞を保護し、GFP + / PIの速度を測定するために、FACSソーターを使用-細胞を。唯一の死細胞のPI汚れているので、このレートは、生細胞におけるトランスフェクション効率の推定値です。 </li><li>以前に10を説明したようにFACSソーターによりGFP発現（GFP +）のに陽性細胞集団をソートします。 </li><li>使用Weste以前前に指定されたshRNAを目的の細胞（例えば、CLL細胞）を感染させた後、目的の転写因子のレベルを決定するために、10に記載されているように RN免疫ブロッティング。 </li></ol> 3.転写因子-shRNAをトランスフェクトした細胞におけるマイクロRNAトランスクリプトームの発現レベルを測定<ol><li>製造業者のプロトコルに従って市販のキットを用いてRNAを単離します。 </li><li> RNAにラベルを付け、マイクロRNAマイクロアレイ11にハイブリダイズします。 </li><li>転写因子のshRNAまたは空のベクターコントロール5でトランスフェクトした細胞において差次的に発現マイクロRNAを決定します。 </li><li> PCR 5リアルタイムを使用して最も差次的に発現するマイクロRNAのためのマイクロアレイの結果を検証します。 </li></ol> 4.転写因子依存トランスクリプトームの記述にバイオインフォマティクスおよびshRNAのアプローチ間のオーバーラップを決定<ol><li> DETへ予想され 、それらのプロモーター中の転写因子結合部位を保有するマイクロRNA遺伝子の比率を観察し、転写因子のshRNAトランスフェクションした細胞で下方制御されたのオコジョ、次の操作を行います。 <ol><li> 1.3で生成されたリストからのプロモーター/総マイクロRNAに興味のある転写因子を保有する遺伝子の比を得ます。このリストは、（ 例えば 、STAT3結合部位/総マイクロRNA遺伝子とマイクロRNA遺伝子が= 0.25テスト済み） 期待される比率です。 </li><li>決定転写因子のshRNAにおいてダウンレギュレートされた遺伝子の数は3.3で生成されたリストから細胞をトランスフェクトし、1.3で生成されたリストから、結合部位、目的の転写因子を有しています。この数/ダウンレギュレートされた遺伝子の総数は、 観測された比率（STAT3結合部位/ダウンレギュレートされたマイクロRNA = 0.6の合計数と例えば 、マイクロRNA遺伝子）です。 </li></ol></李&gt; <li>上記生成された観察と予想される比率を比較し、転写因子のshRNAトランスフェクトされた細胞においてダウンレギュレートされた遺伝子のリストは、それらのプロモーター中の転写因子結合部位に濃縮されているかどうかを判断するための統計をχ2使用します。 </li></ol>

<ol><li>Bentwich, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+hundreds+of+conserved+and+nonconserved+human+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Identification of hundreds of conserved and nonconserved human microRNAs.</a> Nat Genet. 37, 766-770 (2005).</li>
<li>Hata, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functions+of+microRNAs+in+cardiovascular+biology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Functions of microRNAs in cardiovascular biology and disease.</a> Annu Rev Physiol. 75, 69-93 (2013).</li>
<li>Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs%3A+target+recognition+and+regulatory+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs: target recognition and regulatory functions.</a> Cell. 136, 215-233 (2009).</li>
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<li>Rozovski, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+transducer+and+activator+of+transcription+%28STAT%29-3+regulates+microRNA+gene+expression+in+chronic+lymphocytic+leukemia+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer%22%5BJournal%5D)">Signal transducer and activator of transcription (STAT)-3 regulates microRNA gene expression in chronic lymphocytic leukemia cells.</a> Mol Cancer. 12, 50(2013).</li>
<li>Turner, M. J., Slack, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+control+of+microRNA+expression+in+C.+elegans%3A+promoting+better+understanding%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biol%22%5BJournal%5D)">Transcriptional control of microRNA expression in C. elegans: promoting better understanding.</a> RNA Biol. 6, 49-53 (2009).</li>
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<li>Baer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+promoter+DNA+hypermethylation+and+hypomethylation+is+associated+with+aberrant+microRNA+expression+in+chronic+lymphocytic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Extensive promoter DNA hypermethylation and hypomethylation is associated with aberrant microRNA expression in chronic lymphocytic leukemia.</a> Cancer Res. 72, 3775-3785 (2012).</li>
<li>Hazan-Halevy, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STAT3+is+constitutively+phosphorylated+on+serine+727+residues%2C+binds+DNA%2C+and+activates+transcription+in+CLL+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">STAT3 is constitutively phosphorylated on serine 727 residues, binds DNA, and activates transcription in CLL cells.</a> Blood. 115, 2852-2863 (2010).</li>
<li>Melo, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+TARBP2+mutation+in+human+cancer+impairs+microRNA+processing+and+DICER1+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">A TARBP2 mutation in human cancer impairs microRNA processing and DICER1 function.</a> Nat Genet. 41, 365-370 (2009).</li>
<li>Akira, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+roles+of+STAT+family+proteins%3A+lessons+from+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Functional roles of STAT family proteins: lessons from knockout mice.</a> Stem Cells. 17, 138-146 (1999).</li>
<li>Frank, D. A., Mahajan, S., Ritz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+lymphocytes+from+patients+with+chronic+lymphocytic+leukemia+contain+signal+transducer+and+activator+of+transcription+%28STAT%29+1+and+STAT3+constitutively+phosphorylated+on+serine+residues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">B lymphocytes from patients with chronic lymphocytic leukemia contain signal transducer and activator of transcription (STAT) 1 and STAT3 constitutively phosphorylated on serine residues.</a> J Clin Invest. 100, 3140-3148 (1997).</li>
<li>Calin, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+profiling+reveals+distinct+signatures+in+B+cell+chronic+lymphocytic+leukemias%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">MicroRNA profiling reveals distinct signatures in B cell chronic lymphocytic leukemias.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 11755-11760 (2004).</li>
<li>Consortium, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+user%27s+guide+to+the+encyclopedia+of+DNA+elements+%28ENCODE%29%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+biology%22%5BJournal%5D)">A user's guide to the encyclopedia of DNA elements (ENCODE).</a> PLoS biology. 9, e1001046(2011).</li>
<li>Miranda, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pattern-based+method+for+the+identification+of+MicroRNA+binding+sites+and+their+corresponding+heteroduplexes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A pattern-based method for the identification of MicroRNA binding sites and their corresponding heteroduplexes.</a> Cell. 126, 1203-1217 (2006).</li>
<li>Consortium, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+encyclopedia+of+DNA+elements+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome.</a> Nature. 489, 57-74 (2012).</li>
<li>Lau, J. C., Hanel, M. L., Wevrick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+and+imprinted+epigenetic+modifications+of+the+human+NDN+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific and imprinted epigenetic modifications of the human NDN gene.</a> Nucl Acids Res. 32, 3376-3382 (2004).</li>
<li>Corcoran, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Features+of+mammalian+microRNA+promoters+emerge+from+polymerase+II+chromatin+immunoprecipitation+data%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Features of mammalian microRNA promoters emerge from polymerase II chromatin immunoprecipitation data.</a> PLoS One. 4, e5279(2009).</li>
<li>Bhattacharyya, M., Feuerbach, L., Bhadra, T., Lengauer, T., Bandyopadhyay, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+transcription+start+site+prediction+with+multi-objective+feature+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Stat+Appl+Genet+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">MicroRNA transcription start site prediction with multi-objective feature selection.</a> Stat Appl Genet Mol Biol. 11, Article 6 (2012).</li>
</ol>

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

タンパク質をコードする遺伝子のRNAポリメラーゼII-依存性転写の基礎となるメカニズムは、広く研究されています。これらの要素はわずか1％を占める一方で-ヒトゲノムの2％、ENCODEプロジェクトからの証拠は、ヒトゲノムの80％以上が転写17を受けることができるし、何が非コードDNAエレメントの転写を調節することを示唆しているが、主に未知のままである6 。 可能性を解読するのPol IIは、公的に利用可能な資源からのデータを組み合わせる戦略を開発するために私たちを率いて、また、マイクロRNA 6を含むいくつかの非タンパク質コード遺伝子の転写のために責任があることが示されたいくつかの研究で、計算アルゴリズムおよびin vitro試験でマイクロRNAの転写を調節する目的の転写因子の機能を有します。本明細書中で提案した戦略は、2の重要なステップを含んでいます。まず、転写因子Bを識別するために、公的に利用可能なデータを使用しますマイクロRNAプロモーターにinding。そのために我々は、転写...

マイクロRNAは、典型的には、転写後レベルでのmRNA発現の負の調節因子として機能する内因性の小さな非コード規制のRNAです。約1,000非コード20〜25ヌクレオチド長のマイクロRNAは、ヒトのゲノム1,2に記載されています。マイクロRNAは、マイクロRNA、一般に、標的mRNAの3 &#39;非翻訳領域（UTR）に位置するその相補的シードマッチ配列のシード配列との間の標準的な塩基対形成を介して遺伝子発現を調節します。まとめると、マイクロRNAは、タンパク質をコードする遺伝子3の30％以上を調節し、少しだけは、マイクロRNAのDNAから転写について知られています。マイクロRNAの転写の調節は、mRNA 4,5と同様であることが示唆されています。具体的には、タンパク質をコードする遺伝子の転写を促進するその活性と同様に、転写因子は、マイクロRNA 6の転写を活性化すると考えられています。転写因子メートルicroRNAの相互作用は、遺伝子発現の調節因子7因子として報告されており、また、フィードバックとフィードフォワードループを形成してもよいです。例えば、Yamakuchi らは、p53が順番にp53のリプレッサーSIRTし、それによって増加p53活性8の翻訳を阻害するmicroRNA34aの発現を誘導するフィードバックループを報告しました。 マイクロRNAの転写因子依存性発現の特定の例が報告されている一方で、関心の転写因子は、マイクロRNA-トランスクリプトームの発現を調節する方法に関する情報を提供する認められた方法が欠けています。本明細書で提案したプロトコルの目的は、マイクロRNA-トランスクリプトームの転写因子依存性調節の詳細な説明を提供することです。公に利用可能なデータ、バイオインフォマティクスツールを組み合わせ、マイクロアレイ技術を用いて、このアルゴリズムに従う、研究者は、ゲノム規模で捕捉することができるだろうか、任意の関心対象の任意の細胞型における転写因子は、マイクロRNA-トランスクリプトームの発現を調節し、マイクロRNAの発現を調節する転写因子mRNAの推定寄与を探索します。

<table><tbody><tr><td>リポフェクタミン 2000</td><td>ライフテクノロジー</td>ズ <td>11668027</td><td></td></tr><tr><td>0.45 & マイクロ;mシリンジフィルター</td><td>Thermo Scientific (Nalgene)</td><td>190-2545</td><td></td></tr><tr><td>Amicon 超遠心フィルター装置、閾値100&nbsp;kDa</td><td>Merck Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Merck Millipore</td><td>TR-1003-G</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol reagent</td><td>Life Tachnologies (Invitrogen)</td><td>15596-026</td><td></td></tr><tr><td>293 Cell line human</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85120602</td><td></td></tr></tbody></table>

マイクロrnaトランスクリプトームの転写因子依存性調節を記述する

Describing a Transcription Factor Dependent Regulation of the MicroRNA Transcriptome

タンパク質をコードする遺伝子の転写調節が広範に研究されたが、ほとんどは、具体的にはマイクロRNAの転写因子は、非コードRNAの転写に関与している方法で知られています。ここでは、公的に利用可能なデータ、計算リソースと高スループットデータを使用してマイクロRNAの転写を調節する転写因子の潜在的な役割を研究するための戦略を提案します。我々は、転写因子結合部位に濃縮されているマイクロRNAプロモーターを同定するために、ENCODEプロジェクトからデータを-sequencingマイクロRNAプロモーターおよびクロマチン免疫沈降（ChIP）を識別するためにH3K4me3とエピジェネティックな署名を使用しています。 shRNAのが目的の転写因子を標的とし、マイクロRNA配列に細胞をさらすと、目的の細胞をトランスフェクトすることにより、我々は、マイクロRNAトランスクリプトーム上で、この転写因子の効果を研究します。説明に役立つ例として、我々は慢性光年のマイクロRNAトランスクリプトーム上のSTAT3の影響に関する我々の研究を使用しますmphocytic白血病（CLL）細胞。

STAT3は、典型的には、抗アポトーシス及び増殖効果12を有する遺伝子の転写を誘導する転写因子です。 STAT3は、非コードRNAトランスクリプトームに影響を与えるかどうかは現時点では不明です。すべてのCLL細胞ではSTAT3は、セリン707残基10,13上に構成的にリン酸化されています。核へホスホセリンSTAT3シャトルは、DNAに結合し、他の細胞型10にチロシンのpSTAT3により活性化されることが知られている遺伝子を活性化します。 CLLは、マイクロRNAネットワーク14の世界的な規制緩和によって特徴づけされているので、我々は、セリンのpSTAT3の存在がCLL細胞におけるマイクロRNAの発現に影響を与えるという仮説を立てました。 この仮説を試験するためにSTAT3結合部位を保有するマイクロRNAのプロモーターが同定されていました。ベアらに...

ここでは、関心のある転写因子を標的とする小さなヘアピン(sh)RNAで細胞をトランスフェクションした後、公開されているデータ、計算リソース、およびマイクロRNAアレイからのハイスループットデータを使用して、目的の転写因子がマイクロRNAトランスクリプトームに及ぼす影響を研究する戦略を提案します。

マイクロRNAトランスクリプトームの転写因子依存性調節を記述する

While the transcription regulation of protein coding genes was extensively studied, little is known on how transcription factors are involved in ...

本手法の全体的な目的は、目的の転写因子がmicroRNAトランスクリプトームをどのように制御しているかを記述することです。この手法は、タンパク質コード遺伝子の転写を調節する転写因子が、microRNAの転写にも関与しているかという重要な疑問に答えるのに役立ちます。本手法の主な利点は、データマイニング、実験データ、およびバイオインフォマティクス解析を統合し、目的の転写因子の活性に依存するmicroRNA遺伝子の転写に関する包括的な記述を提供できる点にあります。この手法は、microRNA遺伝子の転写と転写因子の活性状態の相互作用に関する知見を提供できますが、これは記述的な手法であり、そのような関連性の確認には追加のアッセイを用いる必要があることに留意してください。まず、クロマチン免疫沈降シーケンシングデータを抽出するために、University of California Santa Cruzゲノムブラウザなどのゲノムブラウザを開きます。サイトにアクセス後、トップメニューから「Tools」を選択し、「Table Browser」を開きます。ここに示すように、それぞれのボックスに仕様を入力し、「Get Output」を選択してテーブルを抽出してください。出力をテキストファイルとして保存し、そのファイルをスプレッドシートにインポートしてください。表計算ソフトで名前列をソートし、STAT2などの目的の転写因子で結果をフィルタリングします。次に、H3K4me3エピジェネティックシグネチャーに基づいたmicroRNAプロモーターのリストをコピーし、txtファイルに貼り付けます。その後、補足データファイルで提供されているSQLで記述された補足コードを使用して、収集したデータをマッピングし、結合親和性の中央値を決定します。まず、150万個のHEK293細胞を10 cmディッシュに加え、10% FBSを添加したDMEMを加えます。細胞が約50%のコンフルエンシーに達するまで24時間培養します。次に、培地を交換します。次に、製造元の指示に従い、標的shRNAを含む5 µgの緑色蛍光タンパク質レンチウイルスと5 µgのパッケージングベクターを組み合わせたトランスフェクション剤を添加します。コントロールとして、スクランブルshRNAとパッケージングベクターを用いて、同様の細胞プレートにトランスフェクションを行います。トランスフェクション混合物を細胞上で16時間インキュベートした後、培地を10% FBSを添加した新鮮な10 mLのDMEM培地に交換します。トランスベクションの48時間後に、細胞から培地を除去します。その後、感染性上清を回収するために5分間遠心分離を行います。浮遊細胞を除去するため、0.45 micronのシリンジフィルターで上清をろ過します。次に、分画分子量100 kilodaltonsの超遠心ろ過装置に培地を加えます。培地を遠心分離し、Lentivirusを濃縮して、液量が250 microliters未満になるまで処理します。残った液体をクライオチューブに移し、濃縮したウイルスを使用するまでminus 80 degrees Celsiusで保存します。準備ができたら、-80°Cフリーザーから凍結保存したレンチウイルスを取り出し、バイアルを室温に戻します。ウイルス上清100 µLを新しい1.5 mLマイクロ遠心チューブに移し、無血清培地900 µLを加えます。次に、1 mLのウイルス懸濁液にヘキサジメチンの臭化物（hexadimethrine bromide）を10 ng/mLの濃度で加えます。チューブを静かに混ぜ、混合液を5分間静置します。計画している導入回数分、1回あたり500万個の細胞を回収し、ウイルスを含む培地 0.5 milliliters で細胞ペレットを静かに再懸濁します。細胞を12ウェルプレートに移し、4時間から24時間インキュベートします。次に、20% FBSを含む培地をさらに0.5 milliliters加えます。トランスダクション後48〜72時間で細胞を回収し、製造元の指示に従ってプロピジウムヨードで染色します。染色後、細胞を遮光し、GFP陽性かつプロピジウムヨード陰性細胞の割合を測定することで、FACsを用いて形質導入効率を推定します。次に、ソートしたGFP陽性細胞集団を回収し、タンパク質を抽出します。最後に、指定のshRNAで細胞を感染させる前後の標的転写因子のレベルをウェスタンブロッティングで決定します。CLL細胞にSTAT3 shRNAを導入した後、STAT3 mRNAとSTAT3タンパク質のレベルはどちらも有意に減少しました。さらに、CLL細胞のmicroRNAアレイにより、STAT3 shRNAを導入したCLL細胞と空ベクトルを導入したCLL細胞の間で、発現に有意な差が認められた23種類のmicroRNAが同定されました。ここでは、そのうち7つの遺伝子について、定量RT-PCRを用いてmicroRNAアレイの結果を検証した結果を示しています。この手順の後、クロマチン免疫沈降法や電気泳動移動度シフトアッセイ、差分アッセイなどの他の手法を行うことで、この転写因子が特定の標的遺伝子のプロモーターに結合し、それを活性化することを検証できます。このビデオを視聴することで、バイオインフォマティクス解析、公開データ、およびshRNAを用いた転写因子のサイレンシングを統合し、その転写因子がどのようにマイクロRNA遺伝子の発現を制御しているかを解明する方法について、十分な理解を得ることができます。

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イントロマイクロRNA生合成レポーターアッセイを開発し、イン ビトロ の細胞で、イントロニックmiRNAの1つ、ターゲットの1つ、調節タンパク質を過剰発現させるプラスミド、ウミシイタケの4種類のプラスミドを用いました。miRNAをプロセシングし、標的配列に結合することによってルシフェラーゼ発現を制御することができた。...

哺乳類細胞におけるイントロニックマイクロRNA成熟を解析するためのレポーターアッセイ

ここでは、サンプルの限られた量を扱う場合は特に、マイクロRNA（miRNA）の発現レベルのコストと時間効果のハイスループットスクリーニングのツールと​​してのマイクロ流体プラットフォームとの組み合わせで最適化された多重逆転写定量PCR（定量RT -...

ハイスループットマイクロRNAプロファイリング：最適化されたマルチプレックスフリューダイナミックArrayTMのIFCSでナノリッタースケールでの定量RT - PCR

非破壊ボリュームの可視化は、最も効率的ではX線マイクロコンピュータ断層撮影（CT）となっている断層の技術によって達成することができます。...

の高分解能3次元イメージング生体外</emマイクロCTによる>生物試料

我々は、還元および酸化半反応の両方を調査するストップトフロー装置の使用を記述...

ストップトフロー分光光度法を用いたフラビン依存性モノオキシゲナーゼの還元と酸化の半反応を監視する

ヒトおよびブタ：我々は、2つの高度に相同なFVIII形態の膜結合構造を解決するために適用クライオ電子顕微鏡法、脂質ナノテクノロジー、および構造解析の組み合わせを提示する。螺旋状に負に荷電した脂質ナノチューブ（LNT）上の二つの機能の​​組換えFVIIIフォームを整理するために私たちの研究室で開発された方法論が記載されている。...

脂質ナノチューブ上血液凝固第VIII因子の螺旋組織

本明細書で我々は、小胞の調製、転写および翻訳機構のカプセル化、およびタンパク質の産生を監視するための簡単​​な方法を記載する。得られた無細胞系がますます複雑な細胞模倣物の構築の開始点として使用することができる。...

セルラーミミックの構築のための小胞における無細胞転写および翻訳機構のカプセル化

学ぶ転写因子がマイクロRNAトランスクリプトームを調節するメカニズム。データマイニング、shRNAを用いた遺伝子サイレンシング、バイオインフォマティクス解析を統合し、神経科学における遺伝子発現制御の包括的理解を提供します。

マイクロRNAトランスクリプトームの転写因子依存性調節を記述する

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