Name: インビトロアッセイではホスファチジルメチルトランスフェラーゼ活性を測定します (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-05T13:00:01.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: 学ぶLeishmania細胞抽出物を用いたホスファチジルエタノールアミンメチルトランスフェラーゼ（PEMT）活性の定量的測定法。酵素精製不要で、脂質代謝研究に有用なインビトロアッセイ技術です。

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1.細胞抽出物の準備<ol><li> 20mMのpH7.4のHEPES、100 U / mlペニシリン、100μg/ mlのストレプトマイシン、5μg/ mlのヘムを補充した1×M199からなる培地中で26ºCで気密キャップで密封滅菌プラスチックボトルにリーシュマニア細胞を増殖させます振盪せずに、0.35グラム/ LのNaCO 2 H、0.1mMのアデニン、および2 / mlのビオプテリン。これらは1〜2×10 7 / mlの細胞密度に達したときに4ºCで5分間1,500 gでの遠心分離によって細胞を回収。 </li><li>ピペットで上清を捨て、冷リン酸緩衝生理食塩水（137mMの塩化ナトリウム、2.7mMのKClを文化のボリュームの半分に血清学的ピペットで細胞ペレットを再懸濁することによって細胞を洗浄、10 mMのの Na 2 HPO 4、1.8mMのKH 2 PO 4、pH7.4の）。 BL2の安全ガイドラインに従って、細胞上清を廃棄してください。 </li><li> 4ºCで5分間1500グラムで再び遠心細胞。ピペットで上清を捨てます。トンを続行次のステップOまたは（3ヶ月まで）-80ºCで長期保存のために液体窒素中で細胞ペレットを凍結スナップ。 </li><li> 2X溶解バッファー（0.5Mスクロース、0.1MのトリスHCl、pH7.5の、2mMのEDTA、および2倍プロテアーゼ阻害剤カクテル）を準備し、氷上で4ºCで保管してください。 </li><li> 2X溶解緩衝液の等量（新鮮または凍結した）細胞ペレットを再懸濁します。ガラスビーズの1倍のボリュームを追加します。 10分間4ºCで激しくボルテックス。 </li><li> 1×溶解バッファーの2容量を加え、混合します。破壊されていない細胞および核をペレット化するために10分間、4ºCで1,500×gで遠心分離細胞抽出物。 </li><li>新鮮なクールな遠心管にピペットで上清を移し、実験終了まで氷上で細胞抽出物を保持します。 </li></ol> 2.このようなビシンコニン酸アッセイなどのタンパク質推定キットを用いて細胞抽出物のタンパク質濃度を決定します<ol><li> S（II）、BCAと銅を混合することにより、ビシンコニン酸（BCA）溶液（1ミリリットル/チューブ）を準備49の比でulfate：1（v / v）です。 </li><li> BCA溶液1mlアリコートに10 mg / mlのウシ血清アルブミン（BSA）のストック溶液を希釈することによって、0のタンパク質標準を準備10、20、30、40、50、および60μgの/ mlでした。 </li><li>重複でBCA溶液1ml中の細胞抽出物の2μLを加えます。予め温めておいた60℃の水浴中で10分間、標準およびタンパク質サンプルをインキュベートします。 </li><li>転送サンプルを3分間氷に。 562ナノメートルの波長で分光光度計を用いて基準とタンパク質試料の吸光度を測定します。 </li><li>製造業者のプロトコルに記載されているように参照としてBSA標準を使用して細胞抽出物のタンパク質濃度を計算します。 1×溶解緩衝液で10mlのMG /タンパク質濃度まで細胞抽出液を希釈します。 </li></ol>チューブあたり200μl中3酵素アッセイ注：化学フードで次の手順を実行します。 <ol><li> 15ミリリットルの重複の各サンプルをテストコニカルチューブ。チューブあたり20μlの1 MトリスHCl pHが7.5を用意し、氷上で保管してください。クロロホルム/メタノール2mlを調製（1：1（V / V）溶液停止）を各チューブのための室温​​です。 </li><li>ピペットで氷の上の各15ミリリットルコニカルチューブ中の1MトリスHCl pH7.5の20μlの。 </li><li>ここで上から放射線安全ガイドラインに従ってください。 SAMの50.06μMの合計チューブあたり[メチル- 3 H]アデノシル-L-メチオニンおよび50μM冷たいSAM - 0.06μM（0.2μCiの）Sと同等のものを追加します。冷水μlの追加xここで、x = 200-（20（+細胞抽出物のための20（）+寒さと放射性SAMのボリューム）バッファ用）チューブあたり。 </li><li>予め温めておいた30ºCの水槽に各コニカルチューブに移します。反応を開始するために各チューブに細胞抽出物（タンパク質200μgの相当）の20μLを加えます。所望の時間（0〜45分）インキュベートします。 </li><li>クロロホルム/メタノール2mlを加えて反応を停止し（1：1、V / V、停止液）を各チューブにします。 RT（20〜25にコニカルチューブを転送6; C）。 </li></ol> 4.脂質抽出注：化学フードで次の手順を実行します。 <ol><li>酵素反応試料を含む各チューブに水700μlを添加します。 30秒間激しくボルテックス。 RTで5分間1,500×gで遠心分離し、水相から有機を分離します。 </li><li>ピペットで新しい15ミリリットルコニカルチューブに低い有機相を転送します。 30秒間激しくボルテックスチューブとを含む各「下相」への水の1ミリリットルを追加します。遠心分離は、再び5分間1500×gで水相から有機を分離しました。 </li><li>ピペットを用いてシンチレーションチューブに低い有機相を転送します。 N 2気流下で乾燥したサンプル。放射線のガイドラインに従って非取り込まれた放射性SAMを含む水相と放射性コニカルチューブを廃棄してください。 </li><li> 2ミリリットル/シンチレーション液のチューブを追加します。シンチレーションCOUに取り込まれた放射能を測定しますメーカーのプロトコルと、機器の用途に応じてNTER。 </li><li>以下の一般式を使用して、ナノモル/ mgのタンパク質における酵素活性を計算します。 CPM値は×10 3×[SAM（MM）の合計（放射性およびコールド）濃度]放射性SAM（CI /ミリモル）xの×5特異的活性[放射性SAMの濃度（mM）の] 注：上記のプロトコルは、依存のSAM濃度またはタンパク質依存PEMTアッセイのために変更することができます。 SAM濃度依存的酵素アッセイについては、時間（線形範囲内である15分）、一定に維持され、タンパク質依存PEMTアッセイ、SAM濃度（ここでは0.05 mMのを選んだ）と時刻ながら冷SAMの種々の量をアッセイに添加します（15分間）一定に保たれます。また、緩衝液のpHは、いくつかのPEMT酵素は異なる最適なpH値を持っている場合、必要​​に応じて変更することができます。 </li></ol>

<ol><li>Keogh, M. R., Courtney, P. D., Kinney, A. J., Dewey, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+characterization+of+phospholipid+N-.methyltransferases+from+Arabidopsis+and+soybean%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Functional characterization of phospholipid N-.methyltransferases from Arabidopsis and soybean.</a> J Biol Chem. 284 (23), 15439-15447 (2009).</li>
<li>Geiger, O., Lopez-Lara, I. M., Sohlenkamp, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatidylcholine+biosynthesis+and+function+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Phosphatidylcholine biosynthesis and function in bacteria.</a> Biochim Biophys Acta. 1831 (3), 503-513 (2013).</li>
<li>Gao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decreased+lipogenesis+in+white+adipose+tissue+contributes+to+the+resistance+to+high+fat+diet-induced+obesity+in+phosphatidylethanolamine+N-.methyltransferase-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Decreased lipogenesis in white adipose tissue contributes to the resistance to high fat diet-induced obesity in phosphatidylethanolamine N-.methyltransferase-deficient mice.</a> Biochim Biophys Acta. 1851 (2), 152-162 (2015).</li>
<li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lack+of+phosphatidylethanolamine+N-.methyltransferase+alters+plasma+VLDL+phospholipids+and+attenuates+atherosclerosis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Lack of phosphatidylethanolamine N-.methyltransferase alters plasma VLDL phospholipids and attenuates atherosclerosis in mice.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 29 (9), 1349-1355 (2009).</li>
<li>Vance, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipid+methylation+in+mammals%3A+from+biochemistry+to+physiological+function%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Phospholipid methylation in mammals: from biochemistry to physiological function.</a> Biochim Biophys Acta. 1838 (6), 1477-1487 (2014).</li>
<li>Nishimaki-Mogami, T., Suzuki, K., Takahashi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+phosphatidylethanolamine+methylation+in+the+secretion+of+very+low+density+lipoproteins+by+cultured+rat+hepatocytes%3A+rapid+inhibition+of+phosphatidylethanolamine+methylation+by+bezafibrate+increases+the+density+of+apolipoprotein+B48-containing+lipoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">The role of phosphatidylethanolamine methylation in the secretion of very low density lipoproteins by cultured rat hepatocytes: rapid inhibition of phosphatidylethanolamine methylation by bezafibrate increases the density of apolipoprotein B48-containing lipoproteins.</a> Biochim Biophys Acta. 1304 (1), 21-31 (1996).</li>
<li>Noga, A. A., Zhao, Y., Vance, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+unexpected+requirement+for+phosphatidylethanolamine+N-.methyltransferase+in+the+secretion+of+very+low+density+lipoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">An unexpected requirement for phosphatidylethanolamine N-.methyltransferase in the secretion of very low density lipoproteins.</a> J Biol Chem. 277 (44), 42358-42365 (2002).</li>
<li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+repression+of+phosphatidylethanolamine+N-.methyltransferase+%28PEMT%29+in+BRCA1-mutated+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Epigenetic repression of phosphatidylethanolamine N-.methyltransferase (PEMT) in BRCA1-mutated breast cancer.</a> Oncotarget. 5 (5), 1315-1325 (2014).</li>
<li>Cui, Z., Houweling, M., Vance, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+rat+hepatoma+cell+growth+by+expression+of+phosphatidylethanolamine+N-.methyltransferase-2%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Suppression of rat hepatoma cell growth by expression of phosphatidylethanolamine N-.methyltransferase-2.</a> J Biol Chem. 269 (40), 24531-24533 (1994).</li>
<li>Cui, Z., Shen, Y. J., Vance, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inverse+correlation+between+expression+of+phosphatidylethanolamine.N-.methyltransferase-2+and+growth+rate+of+perinatal+rat+livers%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Inverse correlation between expression of phosphatidylethanolamine.N-.methyltransferase-2 and growth rate of perinatal rat livers.</a> Biochim Biophys Acta. 1346 (1), 10-16 (1997).</li>
<li>Minder, A. C., de Rudder, K. E., Narberhaus, F., Fischer, H. M., Hennecke, H., Geiger, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatidylcholine+levels+in.Bradyrhizobium+japonicum.+membranes+are+critical+for+an+efficient+symbiosis+with+the+soybean+host+plant%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Phosphatidylcholine levels in.Bradyrhizobium japonicum. membranes are critical for an efficient symbiosis with the soybean host plant.</a> Mol Microbiol. 39 (5), 1186-1198 (2001).</li>
<li>Kodaki, T., Yamashita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+phosphatidylethanolamine+methylation+pathway.+Cloning+and+characterization+of+two+distinct+methyltransferase+genes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Yeast phosphatidylethanolamine methylation pathway. Cloning and characterization of two distinct methyltransferase genes.</a> J Biol Chem. 262 (32), 15428-15435 (1987).</li>
<li>Tanaka, Y., Amano, F., Maeda, M., Nishijima, M., Akamatsu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+properties+of+phosphatidyl-N-.monomethylethanolamine+N-.methyltransferase%2C+the+enzyme+catalyzing+the+second+and+the+third+steps+in+the+phosphatidylethanolamine+N-.methyltransferase+system%2C+from+mouse+liver+microsomes%5BTitle%5D)+AND+%22Jpn+J+Med+Sci+Biol%22%5BJournal%5D)">Purification and properties of phosphatidyl-N-.monomethylethanolamine N-.methyltransferase, the enzyme catalyzing the second and the third steps in the phosphatidylethanolamine N-.methyltransferase system, from mouse liver microsomes.</a> Jpn J Med Sci Biol. 43 (3), 59-73 (1990).</li>
<li>Bibis, S. S., Dahlstrom, K., Zhu, T., Zufferey, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Leishmania+major+phosphatidylethanolamine+methyltransferases+LmjPEM1+and+LmjPEM2+and+their+inhibition+by+choline+analogs%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biochem+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Characterization of Leishmania major phosphatidylethanolamine methyltransferases LmjPEM1 and LmjPEM2 and their inhibition by choline analogs.</a> Mol Biochem Parasitol. 196 (2), 90-99 (2014).</li>
<li>deRudder, K. E., Thomas-Oates, J. E., Geiger, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhizobium+meliloti.+mutants+deficient+in+phospholipid+N-.methyltransferase+still+contain+phosphatidylcholine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Rhizobium meliloti. mutants deficient in phospholipid N-.methyltransferase still contain phosphatidylcholine.</a> J Bacteriol. 179 (22), 6921-6928 (1997).</li>
<li>Aktas, M., Narberhaus, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+characterization+of+the+enzyme+properties+of+the+phospholipid+N-.methyltransferase+PmtA+from+Agrobacterium+tumefaciens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">In vitro characterization of the enzyme properties of the phospholipid N-.methyltransferase PmtA from Agrobacterium tumefaciens.</a> J Bacteriol. 191 (7), 2033-2041 (2009).</li>
<li>Ridgway, N. D., Vance, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatidylethanolamine+N-.methyltransferase+from+rat+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Phosphatidylethanolamine N-.methyltransferase from rat liver.</a> Methods Enzymol. 209, 366-374 (1992).</li>
<li>Gaynor, P. M., Carman, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatidylethanolamine+methyltransferase+and+phospholipid+methyltransferase+activities+from+Saccharomyces+cerevisiae.+Enzymological+and+kinetic+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Phosphatidylethanolamine methyltransferase and phospholipid methyltransferase activities from Saccharomyces cerevisiae. Enzymological and kinetic properties.</a> Biochim Biophys Acta. 1045 (2), 156-163 (1990).</li>
<li>Arondel, V., Benning, C., Somerville, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+functional+expression+in+Escherichia+coli.+of+a+gene+encoding+phosphatidylethanolamine+methyltransferase+%28EC+2.1.1.17%29+from+Rhodobacter+sphaeroides%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Isolation and functional expression in Escherichia coli. of a gene encoding phosphatidylethanolamine methyltransferase (EC 2.1.1.17) from Rhodobacter sphaeroides.</a> J Biol Chem. 268 (21), 16002-16008 (1993).</li>
<li>Wessel, M., Klusener, S., Godeke, J., Fritz, C., Hacker, S., Narberhaus, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virulence+of+Agrobacterium+tumefaciens.+requires+phosphatidylcholine+in+the+bacterial+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Virulence of Agrobacterium tumefaciens. requires phosphatidylcholine in the bacterial membrane.</a> Mol Microbiol. 62 (3), 906-915 (2006).</li>
<li>Klusener, S., Aktas, M., Thormann, K. M., Wessel, M., Narberhaus, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+physiological+relevance+of+Agrobacterium+tumefaciens.+phosphatidylcholine+biosynthesis+genes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Expression and physiological relevance of Agrobacterium tumefaciens. phosphatidylcholine biosynthesis genes.</a> J Bacteriol. 191 (1), 365-374 (2009).</li>
<li>Henderson, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+of+the+gene+encoding+Leishmania+donovani.S.-adenosylhomocysteine+hydrolase%2C+a+potential+target+for+antiparasitic+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biochem+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Cloning of the gene encoding Leishmania donovani.S.-adenosylhomocysteine hydrolase, a potential target for antiparasitic chemotherapy.</a> Mol Biochem Parasitol. 53 (1-2), 169-183 (1992).</li>
<li>Koszalka, G. W., Krenitsky, T. A. 5'-Methylthioadenosine (MTA) phosphorylase from promastigote of Leishmania donovani. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKoszalka%2C+GW+%22Purine+and+Pyrimidine+Metabolism+in+Man+V%2C+Adv+Exp+Med+Biol%22">Purine and Pyrimidine Metabolism in Man V, Adv Exp Med Biol</a>. Nyhan, W. L., Thompson, L. F., Watts, R. W. E. 131, Springer US. 559-563 (1986).</li>
<li>Biastoff, S., Teuber, M., Zhou, Z. S., Dräger, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colorimetric+activity+measurement+of+a+recombinant+putrescine+N.-methyltransferase+from+Datura+stramonium%5BTitle%5D)+AND+%22Planta+Med%22%5BJournal%5D)">Colorimetric activity measurement of a recombinant putrescine N.-methyltransferase from Datura stramonium.</a> Planta Med. 72 (12), 1136-1141 (2006).</li>
<li>Hendricks, C. L., Ross, J. R., Pichersky, E., Noel, J. P., Zhou, Z. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+enzyme-coupled+colorimetric+assay+for+S.-adenosylmethionine-dependent+methyltransferases%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">An enzyme-coupled colorimetric assay for S.-adenosylmethionine-dependent methyltransferases.</a> Anal Biochem. 326 (1), 100-105 (2004).</li>
<li>Cannon, L. M., Butler, F. N., Wan, W., Zhou, Z. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stereospecific+colorimetric+assay+for+%28S.%2CS.%29-adenosylmethionine+quantification+based+on+thiopurine+methyltransferase-catalyzed+thiol+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A stereospecific colorimetric assay for (S.,S.)-adenosylmethionine quantification based on thiopurine methyltransferase-catalyzed thiol methylation.</a> Anal Biochem. 308 (2), 358-363 (2002).</li>
<li>Hoffman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatographic+analysis+of+the+chiral+and+covalent+instability+of+S.-adenosyl-L-methionine%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Chromatographic analysis of the chiral and covalent instability of S.-adenosyl-L-methionine.</a> Biochemistry. 25 (15), 4444-4449 (1986).</li>
<li>Wu, S. E., Huskey, W. P., Borchardt, R. T., Schowen, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chiral+instability+at+sulfur+of+S.-adenosylmethionine%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Chiral instability at sulfur of S.-adenosylmethionine.</a> Biochemistry. 22 (12), 2828-2832 (1983).</li>
<li>Dorgan, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+enzyme-coupled+continuous+spectrophotometric+assay+for+S.-adenosylmethionine-dependent+methyltransferases%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">An enzyme-coupled continuous spectrophotometric assay for S.-adenosylmethionine-dependent methyltransferases.</a> Anal Biochem. 350 (2), 249-255 (2006).</li>
</ol>

興味のある競合が宣言されていません

この単純な、迅速なPEMTアッセイは、タンパク質源として、全細胞抽出物を使用して、PE上にSAMからの放射性のメチル基の転移に起因するPEのメチル化形態の定量化を可能にします。これは、高速の敏感な、再現性、および精製された酵素を17にも適しています。興味のメチルトランスフェラーゼは、これらの基板にではなく、PE 12,13,18,19に固有である場合モノメチルまたはジメチル-PEは、アッセイに追加することができます。精製PEMT酵素が使用される場合、PEがアッセイに添加することができます。このプロトコルの制限は、アッセイは、反応生成物（モノ-PE、ジメチル-PE、またはPC）を識別していないということです。 20,21で説明したようにしかし、反応生成物の同一性（モノメチルPE、ジメチルPE、PC）は、さらに、1次元薄層クロマトグラフィーによって分析することができます。さらに、このようなSの -adenosylhomocysteine ​​及び5&#39;-メチルチオなどのSAMの分解生成物のいくつかはPEMT活性Bを阻害することができますYフィードバック...

ホスファチジルエタノールアミンメチル（PEMT）酵素は、モノメチルPEを与えるためにPE、モノ-PEまたはジメチル-PE上のメチル基供与体としてのS -adenosylmethionine（SAM）を使用して、1つ以上のメチル基の共有結合を触媒ジメチルPE、および/ ​​またはホスファチジルコリン（PC）。これらの酵素は、動物細胞及び真菌におけるほぼ遍在しています。彼らはまた、いくつかの植物1および細菌の約10％、真核生物2と相互作用する特にで見つけることができます。 PEMTsはだけでなく、他の重要な細胞機能を果たすことにより、動物細胞における主要な脂質クラスのPCの生産に貢献することによって、細胞の生物学に関連します。哺乳類では、PEMTsは、主に、それらは非常に低密度リポタンパク質の正常な分泌のために必要とされる肝臓で発現され、それらはまた、食餌誘発性肥満3、アテローム性動脈硬化4に寄与し、インスリンレジストンス5。さらに、哺乳類のPEMTも低いレベルにあるが、脂肪細胞に発現し、脂肪沈着6、7に参加しています。癌発生8、9アポトーシス、及び細胞増殖10 PEMT役割も実証されています。細菌では、PEMT酵素は、正常な細胞増殖2、毒性2、および宿主植物11との共生のために重要であることが示されています。 本プロトコルの目的及び論理的根拠は、酵素を精製することなく、全細胞抽出物からPEMT活性を測定することです。二つの異なるプロトコルがPEMT活性を測定するために開発されています。最初の、そして最も一般的なものは、この記事のトピックであるPE、上に放射性SAMからトリチウム化メチル基の転移を測定します。このプロトコルは、本来understを得るために12酵母および哺乳動物細胞（肝臓）13からPEMT活性を測定するために開発されましたこれらの酵素の特異性を決定するために、これらの細胞におけるPC生合成の論理積ならびに。以降、この技術は、（15けれどもアッセイの基本的なpH値を使用して）細菌2及び原虫寄生14などの他の細胞型に適用されています。この技術は、全細胞抽出物、ならびに精製された酵素を用いて使用することができ、潜在的に任意の細胞抽出システムにも適用することができます。非放射性のアッセイはまた、Sの -adenosylhomocysteine、SAM 16のトランスメチレーション産物の酵素の定量化に依存しているように設計されています。それは放射能を含まないように後者のアッセイは、より便利かもしれないが、それは精製された酵素にのみ適しています。

<table><tbody><tr><td>S-[Methyl-3H]アデノシル-L-メチオニン(5-15 Ci/mMoleの比活性)</td><td>Perkin Elmer</td><td>NET155050UC</td><td>試薬を分注し、-20°Cで凍結します。C;この試薬を使用している間は放射線安全ガイドラインに従ってください</td></tr><tr><td>プロテアーゼ阻害剤カクテル</td><td>ロシュライフサイエンス</td><td>11836170001</td><td>新鮮に希釈してください&nbsp;</td></tr><tr><td>ガラスビーズ、酸洗浄、425-600 mm</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>G8772</td><td></td></tr><tr><td>ビシンコニン酸溶液</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>B9643</td><td></td></tr><tr><td>硫酸銅 (II) シ</td><td>グマアルドリッチ</td><td>C2284</td><td></td></tr><tr><td>シンチレーションカウンター MicroBeta2 1検出器付き</td><td>パーキン・エルマー&nbsp;</td><td>2450-0010</td><td></td></tr><tr><td>分光光度計 Biomate 3</td><td>Thermo Scientific</td><td>840208300</td><td></td></tr><tr><td>BSA 原液 (10 mg/ml)</td><td>New England Biolabs</td><td>B9001S</td><td></td></tr><tr><td>シンチレーション液&nbsp;</td><td>Research Product International Corp</td><td>111198</td><td></td></tr><tr><td>S-(5'-アデノシル)-L-メチオニンクロリド(塩酸塩)&nbsp;</td><td>Cayman Chemicals</td><td>13956</td>は<td>、試薬を20 mM HClで希釈し、アリコートを-80°Cで凍結します。C&nbsp;</td></tr></tbody></table>

インビトロアッセイではホスファチジルメチルトランスフェラーゼ活性を測定します

In Vitro Assay to Measure Phosphatidylethanolamine Methyltransferase Activity

ホスファチジルエタノールアミンメチルトランスフェラーゼは、S-アデノシル-L-メチオニンからホスファチジルエタノールアミン、モノメチル-ホスファチジルエタノールアミン、またはジメチル-ホスファチジルエタノールアミンへの1つ以上のメチル基の移動を触媒する生合成酵素であり、モノメチル-ホスファチジルエタノールアミン、ジメチル-ホスファチジルエタノールアミン、またはホスファチジルコリンのいずれかを生成します。これらの酵素は、動物細胞や真菌に遍在し、細菌の約10%にも見られます。それらは、インスリン抵抗性、糖尿病、アテローム性動脈硬化症、細胞増殖、または病原性など、脂質代謝における直接的な役割を超えて、細胞生理学におけるさまざまな重要な機能を果たします。本稿では、全細胞抽出物を酵素源として使用して、S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionineからホスファチジルエタノールアミンへのトリチウム化メチル基の移動を測定する単純な無細胞酵素アッセイについて報告しています。得られたメチル化形態のホスファチジルエタノールアミンは疎水性であるため、有機抽出により水溶性S-[メチル-3]H]アデノシル-L-メチオニンから分離できます。このアッセイは、他の細胞タイプにも適用できる可能性があり、酵素を精製することなく、目的のホスファチジルエタノールアミンメチルトランスフェラーゼに特異的な阻害剤/薬物の試験に使用できます。

図1は、基質としての内因性のPEを使用して、酵素源としてリーシュマニア全細胞抽出物を用いて行った時間依存PEMTアッセイを示します。有機相中の放射能の量をシンチレーション計数によって定量しました。得られた数値を、PEに転写トリチウム化メチル基の量を計算するために利用されました。 PEMT活性は、約20分間のリニアました。それは、それがさらに15分間一定にとどまった後、約30分でプラトーに達しました。予想されるようになし、細胞抽出物は、アッセイ（ 図 2）に添加しなかった時、PEMT活性が検出されませんでした。また、この活動は、Lの阻害剤である100μMのオクタデシルトリブロマイドの存在下で廃止されました大手 PEメチルトランスフェラーゼLMJ PEM1およびLMJ PEM2 14。 PEMT活性はまた、タンパク質濃度たdependenトン、そしてこの活動は、酵...

本レポートは、リーシュマニア細胞抽出物を使用してホスファチジルエタノールアミンメチルトランスフェラーゼ活性を測定するためのin vitro酵素アッセイについて説明しています。このアッセイは、S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionineから内因性ホスファチジルエタノールアミンへの放射性メチル基の移動に基づいています。

Phosphatidylethanolamine methyltransferases are biosynthetic enzymes that catalyze the transfer of one or more methyl group(s) from ...

この手法の全体的な目的は、全細胞抽出物からホスファチジルエタノールアミン-N-メチルトランスフェラーゼ（PEMT）活性を定量化することです。本法を用いることで、ホスファチジルコリンの生合成におけるホスファチジルエタノールアミン-N-メチルトランスフェラーゼの重要性など、脂質代謝分野における重要な疑問を明らかにすることが可能になります。このプロトコルの主な利点は、全細胞抽出物を用いて測定でき、酵素の精製を必要としない点にあります。このプロトコルにより、寄生虫が最も豊富に含有する脂質であるホスファチジルコリンをどのように合成しているかについての知見を得ることができます。また、このプロトコルは哺乳類細胞や細菌などの他の細胞型にも適用可能です。Leishmania細胞を、補充済みM199培地を用い、気密キャップで密封した滅菌プラスチックボトルに入れ、26 °Cで振盪せずに培養します。4°Cで1500G、5分間の遠心分離により細胞を回収します。これは、細胞密度が1mLあたり10〜20 million cellsに達したときに行います。ピペットで上清を除去した後、セルペレットをセロロジカルピペットを用いて、培養液量の半分に相当する冷PBS（リン酸緩衝生理食塩水）で再懸濁し、細胞を洗浄します。細胞を再び1550Gで5分間、4°Cで遠心分離します。上清をピペットで除きます。次のステップに進むか、長期保存のために細胞ペレットを液体窒素で急速凍結し、-80°Cで保存します。次に、細胞ペレットを同 volumes の 2X lysis buffer で再懸濁します。1X volumes のガラスビーズを加え、4 °C で 10 分間激しくボルテックスします。2 volumes の 1X lysis buffer を加えて混合します。次に、細胞抽出液を1500G、4°Cで10分間遠心分離し、未破砕の細胞と核を沈殿させます。ピペットを用いて上清を新しい冷却遠心チューブに移し、実験が完了するまで細胞抽出液を氷上に保持します。2 µLの細胞抽出液を1 mLの bicinchoninic acid 溶液に添加し、同様に2回繰り返します。標準試料とタンパク質サンプルを、60 °Cに予熱したウォーターバスで10分間インキュベートします。サンプルを氷上に移し、3分間静置します。分光光度計を用い、波長562 nmで標準試料およびタンパク質サンプルの吸光度を測定します。製造元のプロトコルに従い、ウシ血清アルブミンの標準物質をリファレンスとして、細胞抽出液のタンパク質濃度を算出します。1X溶解バッファーを用いて、細胞抽出液をタンパク質濃度 10 mg/mL に希釈します。化学薬品用フード内で、各サンプルとその重複検体を 15 mL コニカルチューブに入れて試験します。1 M Tris-HCl (pH 7.5)を1本あたり20 µLずつ調製し、氷上で保持します。また、各チューブ用にクロロホルム・メタノール停止液を2 mL、室温で調製します。氷上の15 mLコニカルチューブに、1 M Tris-HClを20 µLずつピペッティングします。次に、放射線安全ガイドラインに従い、1本あたり0.06 µMのトリチウム標識SAMおよび50 µMの非標識SAMを加え、合計で50.06 µMのSAMとします。この時点で、テキストプロトコルに従って算出した量の非標識水を各チューブに加えます。各コニカルチューブを、30 °Cに予熱したウォーターバスに移します。反応を開始させるため、各チューブに20 µLの細胞抽出液を加えます。サンプルを任意の時間インキュベートします。各チューブに2 mLのクロロホルム・メタノールを加えて反応を停止させます。コニカルチューブを室温に戻します。化学薬品用フード内で、酵素反応試料を含む各チューブに700 µLの水を加えます。30秒間激しくボルテックスします。次に、室温で1500gにて5分間遠心分離し、有機相と水相を分離させます。下層を回収する際、水相が混入しないようにすることが極めて重要です。水相が混入すると、アッセイの計算に誤差が生じます。ピペットを用いて、下層の有機相を新しい15 mLコニカルチューブに移します。下層に有機相を含む各チューブに1 mLの水を加え、30秒間激しくボルテックスします。その後、再び1500Gで5分間遠心分離し、有機相と水相を分離させます。ピペットを用いて、下層の有機相をシンチレーションチューブに移します。窒素ガスの気流下でサンプルを乾燥させます。未組み込みの放射性SAMを含む水相および放射性円錐チューブは、放射線管理ガイドラインに従って廃棄してください。次に、チューブあたり2 mLのシンチレーション液を加えます。製造元のプロトコルおよび使用器具に従い、シンチレーションカウンターを用いて取り込まれた放射能を測定します。テキストプロトコルに記載された計算式を用いて、タンパク質1ミリグラムあたりのナノモル量として酵素活性を算出します。ここでは、内因性PEを基質とし、Leishmania全細胞抽出液を酵素源として実施した時間依存性PEMTアッセイを示しています。有機相中の放射能量はシンチレーション計数により定量し、PEに転移したトリチウム標識メチル基の量を算出するために利用した。PEMT活性は約20分間直線的に上昇した。その後、30分頃にプラトーに達し、さらに15分間一定の状態を維持した。予想通り、細胞抽出液を添加しなかった場合はPEMT活性は検出されず、細胞抽出液をアッセイに添加した場合には検出された。さらに、leishmania majorのホスファチジルエタノールアミン-N-メチルトランスフェラーゼであるLMJ PEM OneおよびLMJ PEM twoの特異的阻害剤である100 micromolarのオクタデシルトリメチルアンモニウムブロミドの存在下で、この活性は消失しました。PEMT活性はタンパク質濃度依存的であり、この活性は酵素アッセイに使用したタンパク質量に正比例していました。最後に、SAM濃度の影響を調べるため、SAM濃度を段階的に上げてPEMTアッセイを実施しました。PEMT活性は、SAM濃度が約0.5 mMでプラトーに達しました。本プロトコルは、サンプル数に応じて3〜5時間で完了します。SAMは不安定な化合物であるため、最近購入したSAMを使用することが非常に重要です。病原体や放射性物質を扱う作業は極めて危険であることに留意してください。したがって、安全ガイドラインに従い、適切な実験器具を着用することが重要です。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

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