急性アルツハイマーなどの認知障害を誘発するために正常マウスにおけるアミロイドβペプチドの脳室内注射
March 16th, 2016
アミロイドβ（Aβ）は、動物モデルが定義された量とAβ断片の種の管理を可能にし、各研究グループ内の個人差を低減-injected。このプロトコルは、正常マウスにおけるアルツハイマー様の行動異常の製造を可能にする、定位楽器なしでAβの脳室内（ICV）注射を説明しています。
この外科的処置の全体的な目標は、定位器具を使用せずにアミロイドベータの脳室内注射を行い、正常なマウスにアルツハイマー様の行動異常を急性に誘発することです。この方法は、アルツハイマー病の創薬など、神経生物学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、定位器具の助けを借りずにマウスの脳室内領域にAベータを直接注入できることであり、老化プロセスを待たずにマウスのアルツハイマー様行動異常を模倣することができます。
この技術の意味は、アミロイドベータの下流の病理を研究するために使用でき、薬剤候補のスクリーニングに使用できるため、アルツハイマー病の治療または診断にまで及びます。一般的に、この方法に不慣れな個人は、動物の頭蓋骨のブレグマの正確な位置を見つけるのが難しい場合があるため、苦労するでしょう。この手順を開始するには、DMSOで1ミリモルのA-βを作ります。
その後、PBSで10倍に希釈します。次に、ICV注射用のビヒクルとして10%DMSOを含むPBS溶液を調製します。その後、マイクロシリンジをパラフィルムストリップを使用して26ゲージのステンレス鋼針で包み、深さを制御して注射するための針の長さを調整します。
針挿入時にパラフィルムが圧縮されないように、シリンジを複数回密に包み、針の長さを一定に保ちます。次に、パラフィルムストリップの層をカットして、針先とパラフィルムの間の針の長さを3.8ミリメートルに調整します。次に、シリンジを70%エタノールで2回洗浄します。
その後、シリンジを蒸留水ですすいでください。ヒュームフードで少なくとも30分間完全に乾燥させ、清潔なシリンジをさらに20分間UVライトの下に置いてから注入します。このステップでは、7週齢の麻酔をかけたマウスを温かいマットの上に置きます。
次に、滅菌PBSドロップまたは軟膏を両目に塗布して、処置中の角膜の乾燥を防ぎます。その後、つま先ピンチ伸筋離脱反射を評価して、適切な麻酔を確認します。次に、シリンジの垂直注入の基準となるように、表面に複数の垂直線が引かれた2つのミラーを準備します。
1つのミラーをマウスの本体のすぐ横に置き、もう1つのミラーを頭の前に置きます。マウスの 2 つの目の間の仮想的な正中線に対して M1 を平行に保ち、M2 を M1 に対して垂直に配置して、2 つの平面が 90 度の角度を形成するようにします。次に、マウスの額に70%エタノールをスプレーし、乾いた綿棒でこすります。
ブレグマの位置を特定するには、親指と人差し指を目の真上に置き、両目が突き出るまで額を少し押し下げます。同時に、額の皮膚を後方にドラッグして、額の下の頭蓋骨の動きを最小限に抑えます。頭蓋骨の下の深さ2.4ミリメートルのところにテーラーズテープで注射部位を見つけます。
シリンジに10マイクロリットルのA-β溶液またはビヒクルを入れます。注射器を注射部位の平面に対して垂直になるように配置します。次に、両方のミラーのシリンジの反射画像をミラーに描かれた線に合わせます。
パラフィルムラッピングが皮膚に触れるまで針の挿入を開始します。片手でシリンジを持ち、もう一方の手で5マイクロリットルのA-β溶液またはビヒクルを注入し、一時停止せずに5秒以上ゆっくりと注入し、シリンジが全体を通して垂直に保たれていることを確認します。注入が完了したら、3〜5秒待ってからシリンジを取り外してください。
親指と人差し指を頭に戻し、頭蓋骨が不必要に動かないように押さえます。次に、シリンジを傾けずに取り外します。その後、マウスをウォームパッドの上に置いて回復します。
A-βが標的のICV領域に注入されたかどうかを確認するには、脳組織への針挿入の痕跡をチェックして、それが脳室の1つに到達したかどうかを確認します。注射が成功しなかった場合は、その被験者のデータを実験結果の分析から除外します。この実験では、42アミノ酸の完全長A-βペプチドを使用して、Aβモノマー、オリゴマー、およびフィブリルの混合物を作製しました。
HFIP誘導モノマー化ステップを通じて、相対的に均質なモノマーが得られました。7日間のインキュベーション後、さまざまなサイズのA-β凝集体が開発され、その中で三量体と四量体がA-βのオリゴマー型の中で主要な種でした。本研究では、Aβを注入したマウスを対象に、Y迷路試験において、各マウスが迷路を自由に探索できるように、アーム選択の順番とアームエントリーの総数を記録することで、空間ワーキングメモリを評価しました。
A-βを注射したマウス群は、交代率が有意に低く、認知障害の発症を示しました。このテクニックを習得すると、適切に実行されれば、麻酔処置を含めて20分で行うことができます。これらの手順を試みるときは、針を注射面に対して垂直にすることを覚えておくことが重要です。
開発後、この技術は、アルツハイマー病の創薬分野の研究者が、これらの簡単にアクセスできるアルツハイマー病のげっ歯類モデルにおける薬物候補のin vivoスクリーニングを探求する道を開きました。このビデオを見れば、定位器械を使わずに脳室内注射を行う方法についてよく理解できるはずです。
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概要
このプロトコルは、体視的機器を使用せずに正常マウスにアミロイドベータ（Aβ）を脳室内注射する方法を説明しています。この方法により、アルツハイマー型の行動異常を急性に誘発し、神経生物学およびアルツハイマー病の薬物発見研究を促進します。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 神経生物学
- アルツハイマー病研究
背景
- Aβ注入された動物モデルは、研究群の個体差を減少させます。
- この技術により、脳室内領域への直接注射が可能になります。
- 老化を待つことなくアルツハイマー型の行動を模倣します。
- 新規者が頭頂縫合の正確な位置を見つけることは難しい場合があります。
研究の目的
- 正常マウスにアルツハイマー型の行動異常を誘発すること。
- アミロイドベータの下流の病理を研究すること。
- アルツハイマー病の潜在的な薬物候補をスクリーニングすること。
使用された方法
- Aβの脳室内注射。
- DMSOを使用した1ミリモルAβの調製。
- 誘発された異常の行動評価。
- 薬物発見の意味の評価。
主な結果
- マウスにおけるアルツハイマー型の行動の成功的な誘発。
- 体視的機器を使用せずに、この方法の実現可能性を示しました。
- アミロイドベータの病理に関する洞察を提供しました。
- 薬物候補のスクリーニングを促進しました。
結論
- この方法はアルツハイマー病研究の価値あるツールです。
- 行動変化の迅速な評価を可能にします。
- 薬物発見プロセスを潜在的に加速します。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Acute intracerebroventricular injection of amyloid-β in normal mice enables rapid modeling of Alzheimer-like cognitive deficits, bypassing the need for aging-based models. This approach provides a controlled system for interrogating amyloid-driven pathology and evaluating candidate therapeutics in vivo. The method supports early-stage target validation and accelerates preclinical decision-making for Alzheimer's disease portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct testing of amyloid-β pathogenicity and downstream effects in a controlled in vivo context.
- Facilitates mechanistic de-risking by isolating amyloid-β as the independent variable driving cognitive deficits.
- Supports functional target validation for amyloid-centric therapeutic hypotheses.
Screening & Assay Development
- Provides a reproducible animal model for behavioral screening of candidate compounds targeting amyloid pathology.
- Standardizes cognitive deficit induction, supporting quantitative behavioral assay development.
- Enables rapid, scalable evaluation of compound efficacy in a disease-relevant system.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational biomarker strategies by modeling acute cognitive impairment linked to amyloid burden.
- Bridges discovery and preclinical validation by offering a platform for in vivo efficacy assessment.
- Supports risk-adjusted advancement of candidates based on quantitative behavioral outcomes.
Pipeline & Workflow Integration
This model fits within the early discovery to preclinical continuum, enabling hypothesis-driven testing and lead identification for Alzheimer's disease programs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on amyloid-β mechanisms and downstream cognitive effects.
- Screening: Delivers standardized, reproducible behavioral readouts for compound evaluation.
- Analytics: Provides quantitative measurements of cognitive performance for comparative analysis.
- Translational Research: Offers continuity from mechanistic studies to preclinical candidate selection.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable in vivo platform for ongoing Alzheimer's research and screening.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in amyloid-targeted interventions and reduces mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Streamlines model setup, enhances reproducibility, and supports scalable screening workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital allocation by providing rapid in vivo efficacy data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of Alzheimer's disease candidates based on functional outcomes.
Implementation Considerations
- Requires technical expertise in precise intracerebroventricular injection and behavioral assessment.
- Needs access to animal facilities, injection apparatus, and behavioral testing infrastructure.
- Demands rigorous cross-team standardization for injection depth and behavioral protocols.
- May require adaptation for different mouse strains or amyloid-β preparations.
- Potential limitations include technical variability in injection accuracy and behavioral assay sensitivity.
