リアルタイムで麻酔したマウスに生体顕微鏡により腸間膜静脈に好中球および単球のイメージング

私たちは、麻酔をかけたマウスの生体内共焦点顕微鏡を使用して、定常状態および炎症条件下で腸間膜静脈の好中球と単球の挙動を監視するためのプロトコルを詳述しています。

この生体内共焦点顕微鏡検査の全体的な目標は、マウスの定常状態および炎症条件下で腸間膜静脈の好中球と単球のダイナミクスを監視することです。この方法は、白血球の遊走、動員、血管内皮との相互作用の分子基盤は何かなど、免疫学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、統計状態条件下でのLY 60低単球のパトロールを追跡および分析する能力、および同じ血管への単球と好中球の両方の動員を追跡する能力です手順を示す局所炎症刺激の後、ステファンラーは、骨髄から単一細胞調製物を準備するために、研究室の技術者になります。 8〜12週齢のマウスの後肢を70%エタノールで滅菌し、メスを使用して大腿骨と脛骨を採取します。

脚を90%エタノールですすぎ、骨をPBSで満たされた培養皿に移します。次に、培養フードでメスを使用して大腿骨と脛骨を洗浄し、膝関節でそれらを分離します。次に、骨の端を切り取り、23ゲージの針を備えた調製培地で作られた1ミリリットルの注射器を使用して、各骨から骨髄を50ミリリットルの円錐管に洗い流します。

細胞凝集体を針先に戻して細胞凝集体を破壊し、次に新鮮な調製物で細胞懸濁液の総量を最大25ミリリットルにし、培地で細胞をスピンダウンし、その後復活させます。1ミリリットルの赤血球溶解緩衝液に口蓋を懸濁させ、細胞を氷上の15ミリリットルの円錐管に移します。30秒後、10ミリリットルの調製物で溶解を停止します。中程度。

細胞を再度スピンダウンすると、Resusはペレットを懸濁します。ネガティブセレクションによって好中球を濃縮するための調製培地をさらに2ミリリットル。まず、骨髄細胞を150マイクロリットルのマウス好中球濃縮カクテルと氷上で10分間インキュベートします。

インキュベーションの終わりに、10ミリリットルのフェノールレッドフリーdmemで。チューブを1回反転させ、細胞をスピンダウンします。ペレットを1.75ミリリットルの調製培地に懸濁し、細胞を5ミリリットルのポリスチレン丸底チューブに移します。

次に、250マイクロリットルのビオチン選択カクテルと細胞を氷上で10分間インキュベートします。インキュベーションの最後に、細胞単離キットからの磁性粒子を30秒間のボルテックスで懸濁します。次に、氷上で500マイクロリットルの粒子と細胞を10分間インキュベートします。

インキュベーションの終わりに、チューブを磁石に入れます。3分後、磁石を新しい5ミリリットルのポリスチレン丸底チューブに反転させます。標識されていない細胞を採取するには、標識されていない細胞のチューブを磁石に入れます。

3分後、磁石を15ミリリットルの円錐形のチューブに反転させて、ラベルのない細胞を移し、チューブの最後の一滴を残します。次に、新鮮なフェノールレッドフリーdmで容量を最大5ミリリットルにします。次に、ここで使用するセルトラッカーオレンジなどの適切な細胞質色素を半マイクロリットルを摂氏37度の細胞に加えます。

2分後、摂氏37度で、細胞を2.5ミリリットルの調製培地で洗浄し、ペレットを1ミリリットルの調製培地に1.5ミリリットルのチューブに再懸濁し、細胞をカウントし、摂氏37度で5分間インキュベートします。細胞をスピンダウンした後、ペレットを1ミリリットルのPBSに懸濁し、続いて細胞が回転している間に別の遠心分離を行います。直径30mmの穴が開いた10cmの組織培養皿に、35mmのガラスカバースリップをオイルで取り付けます。

次に、ペレットをPBSの100マイクロリットルあたり7つの細胞に1回10回再懸濁し、標識後できるだけ早く細胞を氷上に置きます。標識した好中球細胞を麻酔した8〜12週齢のCX three CR one GFPマウスに静脈内注入し、マウスを加熱パッドに置きます。その後、すぐに動物の目に軟膏を塗り、ハサミを使って腹部の皮膚を開き、腹膜を露出させ、ハサミで腹膜を切開して腸を露出させます。

次に、200マイクロリットルの摂氏37度のPBSを腹腔に投与し、マウスを組織培養皿の上に伏せて、穏やかな圧力で腹腔から腸を取り除きます。次に、滅菌綿棒を使用して、腸を慎重にカバースリップに転がして腸間膜血管を露出させ、摂氏37度のPBSで濡らしたティッシュペーパーで組織を固定して、蠕動運動に起因する動きを減らします。時間をかけて、PBS加重組織で腸を慎重に固定することが非常に重要です。

そうしないと、画像取得中の蠕動運動による動きが実験を台無しにします。次に、組織培養皿とマウスを倒立顕微鏡のカスタムメイドの微量ステージ上の摂氏37度のサーモスタットチャンバーに移し、後肢に2回目の麻酔薬を筋肉内に投与します。次に、適切なレーザーを必要な最小出力に設定し、レーザー誘発光毒性を回避し、マウスを30分間休ませます。

動物が回復したら、定常状態の条件下で最初の動画を30分間記録します。次に、血管の炎症を開始するために、100マイクログラムのTLR、2つのTLR、1つのアゴニスト、PAM3、CSK4を含む20マイクロリットルのPBSを、画像化された血管に直接分注します。最後に、アゴニストの添加後の焦点を制御するように注意して2番目のムービーを取得し、炎症が内皮の幅の変化を誘発し、ここでZ軸の焦点を変更し、このムービーでは、今示したように、定常状態条件下で取得されたムービーの最初の時点の画像処理の異なるステップが示されています。

定常状態条件下での緑色レーシックcilo単球のパトロールは、血流中を循環する赤色好中球を観察することで可視化できます。ここは。PAM 3 CSK 4の添加後90分後に同じ関心フィールドが示され、その結果、好中球と単球が内皮壁に大量に動員され、単球は適切なソフトウェアを使用して細心の注意を払ってスキャンし、単球と好中球の正確な経路を示します。内皮のパトロールは、炎症の開始前と開始後に追跡できます。

Z軸への焦点の喪失やXY方向の変位は、腸の動きが実験を台無しにする結果として発生する可能性があることに注意することが重要です。この手法は、異なる遺伝子改変マウスモデルを使用するか、ブロッキング抗体や医薬品を注射して、白血球の挙動における特定の目的分子の役割を決定することにより、さらに変更することができます。このビデオを見た後、腸間膜静脈の飽和白血球のダイナミクスを監視する方法について十分に理解しているはずです。