腹腔内卵巣癌転移の定量

この実験の全体的な目標は、同系同種同所異種移植マウスモデルにおける腹腔内卵巣癌転移の相対的な腫瘍量を決定することです。相対的な腫瘍負荷を画像化し定量化するこの新しい方法は、卵巣がんの転移の調節における重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の基本的な利点は、蛍光スペクトルの混合を解除することにより、画像から組織の自己蛍光が除去され、標準化された相対的な腫瘍量の測定が可能になることです。

この技術は、ヒト卵巣がんの転移に関する洞察を提供し、治療薬の有効性のモニタリングに重要な意味を持ちます。この手法の視覚的なデモンストレーションは、堅牢なイメージング技術と画像から定量的データを抽出するための分析手順を組み合わせているため、非常に重要です。本日は、Stack LabのラボプログラムマネージャーであるYueying Liuが手順を実演します。

腫瘍細胞の増殖を10週間行った後、麻酔をかけた各マウスの体を一度に1つずつ小動物の光学イメージングシステムに入れます。各時点でコホート内のすべてのマウスをスキャンします。蛍光標識された腫瘍細胞を観察するには、マルチスペクトル取得を実行して合計5つの画像を収集します。

標準露出は 15 秒、2 x 2 ビニング、視野角は 16 cm、F ストップは 1.1 から選択します。次に、開放励起フィルター、開放発光フィルター、標準露光0.2秒、2×2ビニング、視野角16cm、F値2.8の白色光を用いて、動物全体の反射率像を取得します。安楽死後、先のとがった解剖はさみを使用して、マウスの腹側正中線に沿って、大腿部の上部から胸郭の下部まで皮膚を前方に切ります。

腹膜組織から皮膚をそっと分離し、腹膜壁に穴を開けないように注意してください。次に、胸郭の底と太ももの上部の両方に沿って横方向にカットして、皮膚の2つのフラップを作成します。マウスをスキャナーの腹側に置き、腹腔が下を向くようにして、皮膚フラップを引っ張って開きます。

マウスの臓器をその場でスキャンし、以前に生きたマウスに使用したのと同じパラメータを使用します。次に、標準的な技術を使用して肝臓、大網、膵臓、胃、横隔膜、および小腸と大腸を抽出して、マウスの解剖を続けます。また、左右の腹膜、卵巣、腎臓、腸間膜、そして最後に脂肪パッドを切除します。

臓器に見える各腫瘍を観察、列挙、記録します。キャリパーを使用して、各腫瘍の直径を測定します。直径が2ミリメートル未満の腫瘍を小、2ミリメートルから5ミリメートルの腫瘍を中、5ミリメートルを超える腫瘍を大きさと指定します。

次に、添付のテキストプロトコルの図4にある臓器スキャンテンプレートに臓器を配置し、それを使用して次のスキャン中に各臓器の位置を整理します。PBSを使用して臓器を湿らせます。小動物光学イメージングシステムと以前に使用したパラメータを使用して、臓器の各シートをスキャンします。

スキャン後、臓器を10%ホルムアルデヒドに入れ、標準的な技術を用いて組織学のために処理します。各マルチスペクトルスキャンで自己蛍光の量を減らすには、まず赤色蛍光タンパク質のin vivoスペクトルファイルをロードし、続いて自動床のin vivo赤色ファイルを非混合画像ウィンドウにロードし、アンミックスを選択します。次に、ドットBIPファイルを16ビットのスケーリングされていないドットtif形式でエクスポートし、ファイルに移動して開き、正しい16ビットドットtifファイルを選択して、画像Jにロードします。

次に、画像メニューに移動し、[調整]、[明るさのコントラスト]の順に選択し、最小表示値をゼロに、最大表示値をプラス35353に設定します。次に、画像メニューを再度表示して、テーブルの検索に移動し、[レッドホット]を選択します。動物モデルによって必要な輝度レベルは異なりますが、特定の研究を通じて輝度を一定に保つことが重要です。

フリーハンド選択ツールを使用して、各臓器の周囲に自由形式の関心領域選択を描画します。自由形式の関心領域は、臓器の境界の近くに描画する必要があります。次に、「control」と「M」と入力して、測定ツールを使って各臓器の表面積を計算します。

このデータをスプレッドシートに記録します。各臓器の周囲に描画された関心領域で、右クリックして[複製]を選択し、臓器のみを含めます。次に、画像の下で、調整、次にしきい値に移動し、下限しきい値レベルをプラス1, 200に、上限しきい値レベルをプラス1, 700に設定します。

また、暗い背景を確認してから、[OK]を選択します。これにより、最も明るい蛍光領域のみが選択されます。画像では、上記のように、以前に最も明るい領域が分析ステップで選択されるように、画像 J のしきい値スライダーを手動で操作する必要がある場合があります。

疾患モデルが異なれば、必要な閾値制約も異なりますが、特定の研究を通じて閾値レベルを一定に保つことが重要です。[分析] で [粒子の分析] を選択し、ピクセルの 2 乗のサイズを 10 から無限遠に変更します。アウトラインを表示するように選択し、結果のみを表示するように選択して、[OK] をクリックします。

これにより、腫瘍と見なされる明るい領域の領域と生の積分密度の両方が測定されます。表面積の値と、各腫瘍選択の生の積分密度を、臓器表面積を含む同じスプレッドシートに一緒に記録します。次に、[分析]でツールを選択し、キャリブレーションバーに移動します。

臓器の画像にキャリブレーションスケールバーを追加します。モンタージュには、特定の研究によって決定された多数の臓器またはより少ない臓器を含めることができます。次に、[ファイル]で[名前を付けて保存]に移動し、モンタージュをドットtifとドットjpegの両方として保存します。

次に、臓器のドットjpegファイルを開き、挿入メニューに移動して、各画像にテキストボックスを追加します。オルガンのラベルを追加するには、オルガンの 3 行のそれぞれの下にテキスト ボックスを作成します。フルボディスキャンの16ビットドットtifファイルをそれぞれ開いてください file マウス番号の順にImageJに

次に、画像メニューに移動し、[調整]、[明るさのコントラスト]の順に選択します。最小表示値を 0 に設定し、最大表示値をプラス 35353 に設定します。次に、画像メニューに戻り、テーブルを検索してから、レッドホットを選択します。

これが完了したら、モンタージュをドットTIFファイルとドットjpegファイルの両方として保存します。イメージングの10週間前にマウスに注入されたID8マウス卵巣がん細胞株は、赤チャネルで蛍光を発し、成長全体を通じて蛍光を発し続けます。小動物光学イメージングシステムを用いたライブイメージングは、マウス内の拡大するID8細胞を見ることができ、単にマウスの体重を量るよりも正確なアプローチで腫瘍負荷を評価することができます。

安楽死と腹側皮膚層の除去に続いて、無傷の臓器をより詳細に見ることができます。ただし、臓器スキャンテンプレートに配置された個々の臓器は、各臓器の腫瘍量を明確に表示します。左に示したマウスの大網、膵臓、卵巣、腸間膜の腫瘍量は、右に示したマウスの同じ臓器よりもはるかに大きい。

異なる腫瘍量の観察は、腫瘍サービス領域と腫瘍シグナル強度の両方の観点から定量的に確認されます。この手法を習得すると、1時間あたり最大18匹の生きたマウスを画像化するために使用できます。個々の臓器の解剖とex vivoイメージングには、検体あたり約20分かかります。

この手順に続いて、2015年のがん研究論文で示されているように、肥満が卵巣がんの転移に与える影響などの仮説に対処するために、定量的磁気共鳴などの他の方法を実行できます。