Name: 強化された暗視野顕微鏡とハイパースペクトルマッピングにより組織学的試料中の金属酸化物ナノ粒子の同定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 19 s
Description: 学ぶ 強化暗視野顕微鏡とハイパースペクトルマッピングを用いて組織学的試料中の金属酸化物ナノ粒子を迅速に同定する方法です。電子顕微鏡より少ないリソースでナノ粒子の局在化が可能となります。

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著者は、動物研究の協力により組織サンプルを分析につなげたGünter Oberdörster, DVM, PhD、Alison Elder, PhD、およびAlison Elder, PhD(ロチェスター大学)およびMary Frame, PhD(ストーニーブルック大学)に感謝します。さらに、著者は感謝します:クリスティーナ・ロトンディ(アルバニー医科大学組織学コア)。ラニ・セラーズ、DVM、PhDおよびバーバラ・カネラ博士(アルバート・アインシュタイン医科大学組織学および比較病理学施設);レオナルド・ベゼラとアーラム・アブアワド(ブレナー研究チームのメンバー);レスリー・クラウス、バイロン・チーザム、エリーズ・ジョンソン(CytoViva)。この研究は、CDC-NIOSHの助成金OH-009990-01A1と、S.B.に授与されたニューヨーク州のNanoHealth and Safety Centerによって部分的に支援されました。

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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

従来の組織学的染色、金属酸化物ナノ粒子の同定および分析を受けた組織サンプルはEDFM、HSIマッピング、及び画像解析技術の組み合わせによって達成することができるために。 、それはサンプルが最適な可視化のために5〜10ミクロンの厚さに区分されることが重要であり、組織学または免疫組織化学のための試料調製における柔軟性（汚れの種類例えば 、固定または凍結組織を用いた）がありますが。ここで使用されるサンプルは、ヘマトキシリン​​およびエオシンで染色し、カバーガラスを、ガラス顕微鏡スライド上に取り付けられた、ホルマリン固定およびパラフィン包埋の前6μmの厚さにロータリーミクロトームで切片にしました。 ex vivoでの皮膚浸透毒性コラボレーションからブタの皮膚組織をこの研究に使用しました。組織は、水性懸濁液中の金属酸化物ナノ粒子（アルミナ、シリカ、セリア）に曝露しました。関心領域（複数可）の検出（高コントラストelemeNTS）EDFMとその後のHSIマッピングおよび分析を容易に重要な最初のステップです。陽性および陰性対照サンプルを画像化し、参照用スペクトルライブラリを作成するために最初に分析しなければなりません。陽性対照から収集されたスペクトルは、正の対照スペクトルライブラリに輸出されています。その後、負の対照画像からすべてのスペクトルは、特異性を改善するために、陽性対照のスペクトルライブラリから減算される（偽陽性を減少させます）。得られた濾過したスペクトルのライブラリーは、目的の物質の分析に役立つRSLと見なされます。すべての組織サンプルは、同じ撮像処理を受け、RSLに対してマッピングされます。結果の画像は、黒の背景の上に興味の要素を持つ領域のみが含まれます。この画像は、視野当たりのマッピングされた粒子の面積を求めるために、その閾値と粒子解析関数を使用してImageJを用いて分析することができます。 ImageJのから得られた数値データをエクスポートすることができますさらなる分析のためにスプレッドシートにエド。 それは、生物学的サンプルは、互いに本質的に異なっており、および染色方法はEDFMとHSIを介して可視化に影響を与えることができるように、露出設定は、サンプルの特定のタイプに最適な高コントラスト画像を生成するものに応じて決定されるべきであることを考慮することが重要です。偽陽性の低減は、スペクトルライブラリーのろ過によって達成することができるが、この汚染に対応するスペクトルが潜在的に陽性対照のスペクトルライブラリから濾過することができるように、それは、興味の要素による汚染を回避している信頼性のネガティブコントロールを得ることが重要です、偽陰性率が増加します。 SPを生成蓄積した粒子数の多いエリア：また、ハイパースペクトルイメージングソフトウェアで検出可能であるスペクトル強度の範囲は、特定のソフトウェア（この研究のために、それは16,000単位である）の上限を超えることはできません強度限界を超えるectral強度が偽陰性の数を増加させる危険性に起因し、スペクトルライブラリの外に残っています。 HSIシステムは、従来の方法に比べて多くの利点を与える一方で、考慮すべきいくつかの欠点と制限があります。一つは、収集した光大量のデータが実質的な計算能力を必要とするかもしれないということです。もう一つは、基準スペクトルのライブラリが作成されているときHSIは、特に初期段階で、時間がかかることができるということです。また、撮像時間は、単純な暗視野像よりも、それが遅くなって、画像キャプチャごとに数分かかることがあります。しかしながら、それは依然として電子顕微鏡でサンプル調製および可視化を行うよりも高速です。さらに、複雑なシステムは、高度に専門的なコントロールの開発を必要とする複数の特性スペクトル、をもたらし、26難しい標準化、ユニバーサルリファレンスライブラリの確立を行うことができます。最後に、ハイテク個々の原子を解決することができ、このような原子間力顕微鏡や透過型電子顕微鏡などのプローブ - 又は電子顕微鏡技術は、より低い解像度でnique結果。この技術の分解能が原因で、ナノメートルレベルまたは正確にサブミクロンレベルでの材料を配置するための粒子サイズを測定するための高精度なツールであることから、それを防止するその光の性質が、これらに限定されます。技術は、特定の組織区画または細胞小器官内（例えば、細胞核など）1μm以上の粒子を特定することができるかもしれないが、小さい細胞小器官または特徴は、この方法で正確に視覚化するために挑戦しています。また、その空間分解能与えられたノートの、この方法は、単一のナノ粒子と凝集体11を区別することはできません。 その他の考慮事項は次のとおりです（例えば貴金属など）特定の材料は、非常に高い反射率と異なるスペクトルのプロファイルを持つ、ANALYにそれらを容易にすることができますZEこのツールを使用して、スペクトルマップ。このような半金属のこの研究で調査酸化物と炭素系ナノ材料24、27、などの他のものは、それらの元素組成、形状により困難であること、およびマトリックスに依存することができます。マーサーによってら二つのマウス吸入試験では、本研究で用いたものと同様のシステムは、肺内および周囲組織との著しく高いコントラストに基づいて、二次臓器にカーボンナノチューブを配置するために使用しました。炭素繊維のユニークな形状は、識別のための十分な特性だったのでしかし、ハイパースペクトルマッピングは、いずれの試験ではそう実証されていません。通常の生物物理学的プロセスを経て特定の臓器への関心のナノ粒子を堆積する（多くの場合、自身の研究の対象）予測不可能であるため、該当するポジティブコントロールの決意が困難であることができ、制御メートルのどの世代の配慮が必要です。もう1つの考慮事項は、組織に特異的に関連します興味のある材料の状態に影響を与えるIGHT。スペクトルライブラリが関心の自然のままのナノ粒子から作成されている場合、それが原因で変更することにより、 例えば粒子（の変化に起因するスペクトルの変化に組織または細胞におけるこれらの同じナノ粒子にライブラリをマップすることが困難な場合がありますpHは、溶解、凝集、結合タンパク質）および全体的な微小環境または行列。最後に、技術は、その半定量的性質に制限される：それは、それが容易にそのような材料の全器官の負担を特徴付けるなどのタスクを実行するために使用することができないことを意味同様の解像度の他の二次元顕微鏡技術のように定量することができます。 全体的に、EDFMとHSIは、TEM、HAADFやDICなどの従来のナノ材料のイメージングと特性評価技術、いくつかの利点を提供します。 EDFM / HSIはより集中Convenとに比べて時間とコストを節約するより高速画像収集と分析を可能にします的な技術。さらに、EDFM / HSIための試料調製は、時間を節約し、また、それは、他の技術のために使用することができるので、与えられたサンプルのより柔軟な分析を可能にする、一般的に最小で非破壊の両方です。さらに、HSIは、多くの組成物のナノスケール物質の分析のためおよびマトリックスの様々な可能、汎用性があります。研究チームは、技術の特異性の詳細な評価を含め、他の材料とサンプルタイプのためにここに記載された方法を改善するために取り組んでいます。研究チームによる調査の下で重要な次のステップは、目的の材料や組織タイプのための伝統的な金の基準に対するこれらの技術の検証（例えば、ラマン、TEM、SEM）です。

ナノ材料は、ますます産業や様々な用途で使用されているように、このような電子顕微鏡のような伝統的な様式、より多くの、手頃な価格の迅速、かつ便利なナノスケール画像化および特徴付けの方法が必要です。細胞、組織、および生物系でナノ粒子（NP）の相互作用を可視化するために、多くの光学技術は、微分干渉コントラスト（DIC）顕微鏡1と、このような全反射（TIR）又は近などのエバネセント場ベースのアプローチを含め、使用されていますフィールド走査光学顕微鏡（NSOM）2,3。しかし、これらはほとんどの非専門家のラボ4の手の届かないところに、ハイエンドの分析手法です。透過型電子顕微鏡（TEM）などの電子顕微鏡は、また、細胞5,6,7,8-とNPの相互作用を研究するために使用されています。高角度環状暗視野（HAADF）走査型透過電子顕微鏡は、NPの相互作用を研究するために使用されていますウイルス9と。共焦点顕微鏡は、NP-細胞の相互作用10を研究するために使用される別の人気の技術です。 近年では、暗視野ベースのハイパースペクトルイメージング（HSI）技術は、生物学的マトリックス11内のNPを研究するための有望な分析ツールとして使用されてきました。 HSIシステムは、超立方体またはデータキューブ12として知られている空間およびスペクトルデータの三次元表現を生成します。スペクトル変化の空間的なマップは、材料識別のために使用されます。既知の物質のスペクトルプロファイルを生成し、未知試料との比較のための参照ライブラリとして使用することができます。 HSIシステムの主な利点の一つは、それによって、知られており、同様の組成物の別の基準粒子にそれらをリンクするだけでなく、 インビボまたはエクスビボでの位置及び未知のNPの分布を確立する分光法とイメージングを結合する能力、です。 のいくつかの利点があります従来の撮像技術よりHSIシステムを使用して：最小限のサンプル調製が必要です。試料調製は、本質的に、典型的には非破壊的です。画像収集と分析が高速です。技術は費用対効果の高い13です。そして、混合された組成物および/ ​​または複雑なマトリックス中の化合物の空間分布及び分析がより容易に達成される14。 貴重なサンプルを含むナノ材料の研究のために、最も重要な検討事項の一つは、潜在的に繰り返して1つ以上の方法により試料を検査することを可能にする非破壊イメージング法の利用可能性です。反復または複数の分析は、単一のメソッドから利用できないでしょう包括的なデータセットを開発することが望まれます。この点には、その光学的性質を研究することは、サンプルを分析するための最も安全な方法です。強化された暗視野顕微鏡（EDFM）とHSIシステムを使用することにより、試料の光学応答を研究するために - すなわちリフレctanceだけでなく、吸光度と透過率-特徴識別および特徴付けは、15を行うことができます。潜在的な特性評価のエンドポイントは、相対的な大きさや形状のナノ粒子または凝集体のサンプル中のナノ粒子の分布の評価が含まれます。 本稿では、スペクトルアングルマッパー（SAM）と呼ばれるピクセルのスペクトルマッチアルゴリズムに基づいて、HSIシステムを使用して、死後組織中の金属酸化物ナノ粒子のために特別にマッピング方法を説明します。それは動物モデルは工業ナノ材料への曝露の健康への影響を評価するために使用される生体 nanotoxicology調査で 、現在および将来を補完する可能性があるので、私たちは、この特定のアプリケーションを選択しました。この方法の適用はまた、組織または動物モデルを利用したナノスケールの薬物送達研究を知らせることができます。 Oを通して、特に、ナノ粒子の吸収、分布、代謝、および排泄rgansや組織は、このシステムで調査することができます。多種多様なアプリケーションには、生物医学研究11で使用するために検討されています。 この方法は、元素組成16-19の種々のナノ粒子に曝露されている（例えば、種々の組織型、気管支肺胞洗浄試料、血液塗抹標本など）異なる生物学的試料の評価のために利用することができます。さらに、この方法は、 インビボおよびナノスケールの薬物送達研究のために適切である11 インビトロでのナノ粒子の生体内分布の研究に有用です。生物学的試料を越えて、EDFMとHSIは、廃水20のような環境試料中のナノ粒子を評価するために使用することができます。これは、ナノ粒子の侵入を防止するのに個人用保護具の有効性を評価するために使用することができるので、職業暴露評価は、同様にこの技術を使用することによって容易にすることができます。さらに、研究テ午前は、現在、職業暴露評価から集めたナノ粒子のフィルター媒体サンプルの評価のための同様のEDFMとHSIプロトコルを開発しています。 EDFMとHSIのためのこれらの種々のサンプルタイプの製剤は変化し得るが、それは彼らが容易に光学系によって視覚化することができるような方法で製造されることが重要です。それは従来の明視野顕微鏡を介して可視化されることになるかのように一般的に、サンプルを用意する必要があります。 11市販のいくつかのハイパースペクトルイメージングシステムがあります。

<table><tbody><tr><td>CytoViva 150ユニット(コンデンサー)</td><td>CytoViva(アラバマ州オーバーン)</td><td></td><td>をオリンパスBX43顕微鏡に搭載</td></tr><tr><td>オリンパスBX43顕微鏡 - アナライザースロット - HSI、CytoViva(アラバマ州オーバーン)を通じて得られた10倍および40倍のエア対物レンズと100倍の油浸対物レンズ付き</td><td>、</td><td></td><td>CytoViva 150ユニットコンデンサ</td></tr><tr><td>ーDagexcel-MデジタルFirewireカメラで使用 - 冷却済み、Exponent 7ソフトウェア</td><td>を含むCytoViva(アラバマ</td><td></td>州オーバーン)で入手した<td>強化された暗視野カメラとソフトウェア</td></tr><tr><td>CytoVivaハイパースペクトルイメージングシステム1.4、Pixelflyハイパースペクトルカメラ、XYステージコントローラー、</td><td>CytoViva(アラバマ</td><td></td>州オーバーン)で取得したENVIハイパースペクトルイメージングソフトウェア、ハイパー<td>スペクトルカメラとソフトウェア</td></tr>クリーンルーム清掃<tr><td>ガラス顕微鏡スライド(ガラスBスライド)</td><td>Schott NEXTERION</td><td>1025087</td><td>従来のガラス顕微鏡スライドと比較して破片やアーティファクトを削減 最適なイメージングのための</td></tr><tr><td>クリーンルーム 洗浄ガラス顕微鏡カバースリップ (#1.0; 22 mm x 22 mm x&nbsp; 1.45 mm)</td> <td>Schott NEXTERION</td><td>カスタム</td>は、最適なイメージングタイプA顕微鏡液浸油フィッシャーサイエンティフィック12368B複数のサプライヤー70%イソプロパノールのための<td>従来のガラスカバースリップと比較して、ゴミやアーティファクトを削減</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>水</td><td></td><td></td><td>複数のサプライヤー</td></tr><tr><td>ImageJソフトウェア</td><td>国立衛生研究所(NIH)</td><td></td><td>無料のオープンソースソフトウェアオンラインダウンロード</td></tr><tr><td>金属酸化物ナノ粒子</td><td>産業パートナー</td><td></td>によって研究チームに供給されたアルミ<td>ナ、シリカ、およびセリアナノ粒子 水性懸濁液中。著者と業界パートナーとの間の秘密保持契約により、これ以上の製品情報を開示することはできません。</td></tr></tbody></table>

強化された暗視野顕微鏡とハイパースペクトルマッピングにより組織学的試料中の金属酸化物ナノ粒子の同定

Identification of Metal Oxide Nanoparticles in Histological Samples by Enhanced Darkfield Microscopy and Hyperspectral Mapping

ナノマテリアルは、産業、製造、生物医学研究を通じてますます普及しています。生体試料中のナノスケール材料の同定、位置特定、および特性評価を支援するツールや技術の必要性が高まっています。電子顕微鏡法など、現在利用可能な方法はリソースを大量に消費する傾向があり、多くの研究コミュニティにとってその使用は禁止されています。ハイパースペクトルイメージングシステムによって補完された強化された暗視野顕微鏡法は、組織学的サンプル中のナノ粒子の迅速かつ安価な特性評価を可能にすることにより、このボトルネックの解決策を提供する可能性があります。この方法により、高コントラストのナノスケールイメージングとナノマテリアルの同定が可能になります。この技術では、組織学的組織サンプルは、光ベースの顕微鏡検査の場合と同様に調製されます。まず、ポジティブコントロールサンプルを分析して、サンプル内の対象物質の検出を可能にする参照スペクトルを生成します。また、特異性の向上(偽陽性の減少)のために、対象材料を含まないネガティブコントロールも分析されます。その後、ハイパースペクトル顕微鏡の方法とソフトウェアを使用してサンプルをイメージングおよび分析したり、これらの参照スペクトルと照合して、サンプル内の関心のある材料の位置のマップを提供できます。この技術は、貴金属など、非常にユニークな反射率スペクトルを持つ材料に特に適していますが、半金属酸化物などの他の材料にも適用できます。この技術は、電子顕微鏡技術を使用せずに組織学的サンプルから取得するのが難しい情報を提供し、より高い感度と分解能を提供する可能性がありますが、光学顕微鏡よりもはるかに多くのリソースと時間がかかります。

ハイパースペクトル顕微鏡は、分光光度法と同様の方法で物質を同定する能力のために有用です。 図1に示されるように、各材料は、いくつかの特徴的なスペクトル及びユニークで、その反射率の全体的な形状を有しています。また、 図1は、スペクトルプロファイルのマトリックス依存性を示す図である：組織学的組織サンプル中の3つの金属酸化物のそれぞれ（上のパネル）のスペクトルプロファイルは、水性懸濁液中で3つの金属酸化物の各々についてスペクトルプロファイル（異なります下のパネル）。同じマトリックス中に未知の試料の特徴的なスペクトルプロファイルをマッピングすることによって、この技術は、材料の有無を決定するために有用であり、また、半定量的サンプル中の物質の相対量を比較することができます。 陽性対照皮膚サンプルから作成した基準スペクトルライブラリーは実験的にマッピングするために適切です皮膚サンプル。 図2に見られるように、基準スペクトルのライブラリは、対応する陽性対照にうまくマッピングし、対応する負のコントロールにマップされません。 技術の最も重要な利点は、試料中の目的の物質の低いレベルを検出するため、ならびに汚染物質と区別するために、その能力です。例えば、個々のナノチューブ20〜30グラムのラット25で40μgのほど低用量の吸入の間に肺に観察することができる。図3は、組織学的皮膚サンプルでこれを示しています。いくつかの粒子は、暗視野光学像で容易に明らかであるが（コラム2）他のものは明視野顕微鏡（カラム1）、または他の方法を使用して、見逃されている可能性があり、ハイパースペクトルイメージング（列3）を用いて検出されます。暗視野HSIの使用はまた、単純な明視野顕微鏡上の特異性を改善するのに役立ちます。これらの画像は、その後、n分析のより定量的な形態を受けることができますImageJの経由otably粒子分析。 強化された暗視野顕微鏡でもハイパースペクトルイメージングの非存在下では、いくつかの異なる用途を有します。最初は、高品質、高コントラストの画像を生成する能力です。これは、最もよくする目的の粒子は、それらの明視野の対応と比較して容易に識別され、 図3に示されています。ハイパースペクトルマッピングが存在しない場合には、注意が関心のある粒子からの汚染物質の粒子を混乱を避けるために必要があるが、これらの画像はまた、定量的な粒子分析を受けることができます。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53317/53317fig1.jpg" /> スペクトルライブラリ（懸濁液中のナノ粒子）に比べて、図1の参照スペクトルライブラリ（組織マトリックス）。この図はナンから基準スペクトルライブラリーを生成することの重要性を実証します実験試料と同じマトリックスに関心のomaterials。最初の行は、この研究（アルミナ、シリカ、セリア）の各材料のための参照スペクトルライブラリ（RSL）を示している。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53317/53317fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> このRSLは、陽性対照組織サンプルは、陰性対照組織サンプルに対して濾過したこのプロトコールに記載の方法によって作成されました。 2行目は、スライドガラス上の液体懸濁液中の関心のナノ粒子から作成されたスペクトルライブラリ（SL）を示しています。より多くの湾曲の少ない独特のピークはシリカの周りを600でアルミナNPサスペンションSLで見られたのに対し、アルミナの場合は、500と650の波長における二峰性ピークは、RSLで発見された、周りの650の波長でピークがありましたより多くの湾曲の少ない独特のピークはarouでシリカNPサスペンションSLで見られたのに対し、RSLに存在します少ない独特のピークが周りの560でセリアNPサスペンションSLで見られたのに対し、NDセリアの場合600は、二峰性のピークは、RSLに520と620の波長で発見されたこれは、NPのが埋め込まれたマトリックスが作成されますことを示唆していますなどの特定の実験のためのSLを作成するためのコントロールを選択するときに、かなりのことができるスペクトルのシフト。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53317/53317fig2.jpg" /> 図2の参照スペクトルライブラリ（組織マトリックス）を陽性対照および陰性対照ブタ皮膚組織にマッピング 。各RSL（左の列）は、その対応する陽性対照（中央の列）にもマッピングし、それに対応するネガティブコントロール（右列）にマッピングされていないという点で、この図は、実験試料へのマッピングに適したとしてのRSLの確認として機能し<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53317/53317fig2large.jpg" target="_blank">てください。時間をクリックします</a>この図の拡大版を表示するには、ERE。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/53317/53317fig3.jpg" /> 金属酸化物ナノ粒子にさらされる実験ブタ皮膚組織の図3ハイパースペクトルマッピング 。それぞれ、表皮、真皮、皮下組織、：上から下への行は、表層から最も深い層に皮膚の異なる層に対応しています。最初の行は、懸濁液中のアルミナのNPに曝露された皮膚試料の表皮の角質層を示す図です。 2行目は、懸濁液中のシリカのNPに曝露しました。 3行目は、懸濁液中でのNPをセリアします。各列は、異なる技術を用いて画像化皮膚の同じ領域を示しています。強化された暗視野顕微鏡（EDFで、最初の列は、明視野顕微鏡赤い四角で囲まれた領域が拡大された（40X MAG;スケールバー=50μm）を、（スケールバー=10μmの100XのMAG）に対応白い矢印は、高コントラストのNPを指している第二カラム、中のM）。 3列目は同じ高コントラストのNP（白矢印）を示す、ハイパースペクトルカメラ（HSI）を得ました。 EDFMおよびHSI画像は、100Xの倍率で撮影しました。 =10μmのスケールバー。 4番目の列は、それぞれイエローの各アルミナのNPが緑で表示されている曝露群、赤中のシリカのNP、およびセリアのNPに対するそれぞれのRSLに対してマッピングされたHSI画像を示している。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53317/53317fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

スペクトルマッピングによる強化された暗視野顕微鏡法とハイパースペクトルイメージングにより、従来の方法よりも速度と精度が向上した組織学的サンプル中のナノスケール材料のスクリーニング、局在化、および同定が可能になります。この論文の目標は、組織学的サンプル中の金属酸化物ナノ粒子の暗視野イメージングとハイパースペクトルマッピングの方法を提供することです。

Nanomaterials are increasingly prevalent throughout industry, manufacturing, and biomedical research. The need for tools and techniques that aid in the ...

この手順の全体的な目的は、暗視野顕微鏡およびハイパースペクトルマッピングを用いて、組織学的試料中の金属酸化物ナノ粒子を同定することである。まず、ナノ粒子を含む陽性対照試料において関心領域を特定し、暗視野像を撮影する。次に、ハイパースペクトルカメラを用いて、その関心領域のハイパースペクトル画像またはデータキューブを作成する。次に、ポジティブコントロールのデータキューブから参照スペクトルライブラリを作成し、ネガティブコントロールでフィルタリングして偽陽性を除去します。最終ステップとして、この参照スペクトルライブラリを実験サンプルにマッピングし、同一組成のナノ粒子の同定および位置特定を行います。最終的に、拡張暗視野顕微鏡法とハイパースペクトルマッピングを用いることで、電子顕微鏡などの他の手法よりも迅速かつ低リソースで、組織学的サンプル中の金属酸化物ナノ粒子を同定することが可能になります。この手法は、電子顕微鏡などの従来のナノ材料イメージングおよび特性解析技術に対して、いくつかの利点があります。具体的には、試料調製が通常最小限で済み、非破壊的である点です。また、画像の取得と解析に要する時間とコストが少なく、多様なマトリックス中のナノ粒子イメージングに適用することが可能です。適切な陽性コントロール試料と参照スペクトルライブラリの作成には、困難が伴い時間もかかるため、この手法の導入に苦労することがあります。しかし、これらの初期ステップが完了すれば、実験試料を極めて迅速に評価することが可能です。本手法はナノ粒子の皮膚浸透に関する知見を提供できるだけでなく、気管支肺胞洗浄液や血液塗抹標本などの他の生物学的試料や、職業暴露評価に使用されるフィルターなどの非生物学的試料にも適用できます。この手法の実演を担当するのは、私の研究室の医学生であるPlar Sosaです。まず、光源、ステージコントローラー、光学カメラ、ハイパースペクトルカメラ、およびコンピュータシステムを電源に接続し、電源を入れます。次に、ステージとコンデンサーを操作位置まで上げ、Type A浸漬油を3〜5滴、コンデンサーレンズに慎重に滴下します。気泡が生じた場合は、一度オイルを拭き取り、再度レンズに塗布してください。次に、サンプルをステージ上に配置し、コンデンサーをゆっくりと上昇させ、浸漬油がスライドの下面に接触するようにします。油がスライドに接触すると、照明のリングが急速に明るくなることで確認できます。コンデンサーをセットした後、10倍対物レンズに切り替え、必要に応じてコンデンサーを調整して焦点を合わせ、明るさを最大化します。コンデンサーの調整ノブを使用して、明るい部分が中心にくるように調整してください。光学イメージングソフトウェアを起動します。対物レンズの微動フォーカスノブを使用して、サンプルのピントを合わせます。その後、関心領域（ROI）を特定します。照明を均一にするため、必要に応じてコンデンサーの焦点を調整します。メニューバーの設定タブをクリックし、画像キャプチャボタンをクリックします。キャプチャイベント用です。希望の画像フォーマットを選択し、画像にファイル名を割り当てます。さらに、デフォルトのタイムラプス値を設定し、最後にOKをクリックします。次に、露光メニューに移動し、最もコントラストの高い画像が得られる露光設定を選択します。ここでは、レベルを0.0%に設定します。ゲインは2.8 dBに設定し、シャッタースピードは56 msに設定します。メニューバーの画像ボタンをクリックして画像をキャプチャしてください。対物レンズを40倍および100倍に変更します。より高倍率で画像を撮影する場合、ライトガイドがハイパースペクトルカメラに向けられていることを確認し、ハイパースペクトルイメージングソフトウェアを開いてHSIデータキューブを取得します。ソフトウェアのメニューバーから「hyperspectral microscope」を開き、「HSI microscope controls」を選択してください。ここで、対物レンズの倍率とセーフパスを設定します。次に、設定（settings）でキャプチャ領域（area capture）を変更し、ライン数を変更してください。本研究では、露光時間を720に設定しました。ここでは0.25秒を使用しています。その他の設定はすべてデフォルトのままにし、「preview HSI」をクリックして画像を確認します。カメラの視野の中心のx軸に沿ってユーザーが移動した際の、最大波長の強度を示す強度グラフを観察します。カーソルを動かして、グラフの正確な輪郭を描いてください。これにより、左側に数値強度のインジケーターが表示されます。このプレビューに基づき、対物レンズの微動フォーカスを調整して画像内のピークを鮮明にし、ピントを合わせてください。次に、光源の明るさやコンデンサーのフォーカスを調整して光強度を最適化するか、プレビューをキャンセルしてソフトウェアで露光時間を調整してください。「capture」をクリックすると、名称付きの4つの新しいウィンドウが表示されます。バンドリスト。1番目のズーム。1番目のスクロールと1番目のRGBバンドが表示されます。今後のすべての参照に使用されるデータキューブであるため、RGBバンドウィンドウの1番目を最大化します。このデータキューブを右クリックし、tiffファイルとして保存して「OK」をクリックします。データキューブの画像ウィンドウ内で右クリックし、「Z profile spectrum」を左クリックします。左側にスペクトルプロファイルのポップアップウィンドウが表示されたら、データキューブのターゲット上で関心のあるピクセルをクリックします。最も明るいピクセルは、目的の物質であると自信を持って同定できるものです。「粒子解析（particle analysis）」メニューから「粒子フィルター（particle filter）」ツールを選択し、データキューブ内に存在する粒子を同定します。新しく表示されたポップアップウィンドウで、「spectral max」が背景ピクセルの値より高く、かつ目的の物質の値より低くなるように設定してください。有効なデータ最大値は16,000です。パーティクルフィルターレビューツールのウィンドウで、「select all」をクリックします。次に、「export to spectral library」をクリックし、スペクトルライブラリに名前を割り当てます。陰性対照として使用するサンプルを選択した後、そのサンプルから複数のデータキューブを取得します。ハイパースペクトルカメラを用いて、少なくとも1つは必要ですが、より多く取得することも可能です。選択性を高めるため、ネガティブコントロールのデータキューブを開いた状態で、メインプログラムツールバーにある解析メニューから「フィルター・スペクトルライブラリ（filter spectral library）」をクリックします。「新しいファイルを開く（open new file）」をクリックし、入力ファイルとして事前に作成したポジティブコントロールのスペクトルライブラリを選択し、「OK」をクリックします。CytoVivaスペクトルライブラリフィルターウィンドウで、「画像（image）」をクリックして参照用スペクトルライブラリの出力ファイル名を選択し、「OK」をクリックします。次に、ソース画像としてネガティブコントロールのデータキューブのファイル名をクリックします。ソフトウェアがスペクトルライブラリを分析し、ネガティブコントロールのデータキューブのいずれかのスペクトルと一致する各スペクトルを削除します。実験用データキューブを開いた状態で、実験サンプルのデータキューブを取得してください。マッピングメソッドのサブメニューにあるスペクトルメニューをクリックし、スペクトルアングルマッパー（spectral angle mapper）を開きます。ポップアップウィンドウで実験データキューブの名前を選択し、「OK」をクリックします。ファイル名が表示されていない場合は、「Open new file」をクリックして実験データキューブを選択してください。次に、「End Member collection」というポップアップウィンドウで「okay」をクリックし、「SAM」のメニューバーで「import」をクリックします。その後、「Spectral Library file」から選択します。事前に作成した参照スペクトルライブラリを開き、「okay」をクリックします。Input Spectral Libraryという名前の新しいポップアップウィンドウで、[select all items]をクリックし、[okay]をクリックします。次に、[color]を右クリックして[select]を選択し、[Apply default colors to all]で[select all]をクリックしてから[apply]をクリックします。その後、出力ファイル名を選択し、[okay]をクリックします。データキューブウィンドウのオーバーレイメニューを開き、「classification」を選択します。次に、出力ファイル名を指定し、「okay」をクリックします。インタラクティブクラスツールウィンドウのメニューでオプションメニューを開き、「merge classes」を選択して、統一された配色スキームを作成します。他のソフトウェアを用いてデータを解析しやすくするために、ベースクラスリストから単一のスペクトルを選択します。次に、「unclassified」以外のすべてのクラスを選択してベースに統合します。その後、「OK」をクリックします。次に、選択したベースカラーをクリックすると、一致するすべてのスペクトルがその色で表示されます。黒い背景に一致するスペクトルを表示する静止画像を得るには、デフォルトで黒色に設定されている「未分類の色（unclassified colors）」ボックスをクリックしてください。この手法の最大の利点は、暗視野顕微鏡法とハイパースペクトルマッピングによって、組織標本中の金属酸化物ナノ粒子を同定できる点にあります。これらの画像は、皮膚の組織標本を用いてこのプロセスを実証したものです。暗視野光学イメージでは一部の粒子が容易に確認できますが、ハイパースペクトルイメージングを用いることで、さらに多くの粒子を検出できます。ここに示しているのは、Illuminaナノ粒子に曝露させた豚皮膚組織の表皮層です。また、シリカナノ粒子に曝露させた真皮層の角質層上には、高コントラストのナノ粒子クラスターが沈着していることが確認されました。結合組織上に堆積した複数の高コントラスト・ナノ粒子が観察されます。最後に、シリアナノ粒子に曝露させた皮下組織において、脂肪細胞に沿って堆積した複数の高コントラスト分散ナノ粒子が確認でき、本手法によるナノ粒子の同定が可能となります。肺、肝臓、脾臓、腎臓、リンパ節などの他の組織サンプルにおいても可能です。この手順に従い、粒子数や粒子の位置などの追加の疑問を解消するために画像解析を行うことができます。高度に専門化されたコントロールの必要性や、フォトニックイメージングの解像度の制限といった特定の考慮事項および欠点は、従来の方法との比較検討が必要です。特定の研究課題を調査するために最も適切な分析手法を選択する際、本アプリケーションは現在および将来のナノ毒性学研究を補完する可能性があるため、今回この例を用いて実演することにしました。また、本手法は、臓器や組織におけるナノ粒子の吸収、分布、代謝、および排泄に関する研究にも役立ちます。

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