強化された暗視野顕微鏡とハイパースペクトルマッピングにより組織学的試料中の金属酸化物ナノ粒子の同定

この手順の全体的な目標は、暗視野顕微鏡とハイパースペクトルマッピングによって組織学的サンプル中の金属酸化物ナノ粒子を同定することです。これは、まずナノ粒子を含むポジティブコントロールサンプルの関心領域を同定し、暗視野画像を撮影することで達成されます。2 番目のステップは、ハイパースペクトル カメラを使用して、関心領域のハイパースペクトル イメージまたはデータ キューブを作成することです。

次に、ポジティブコントロールデータキューブから参照スペクトルライブラリが作成され、ネガティブコントロールに対してフィルタリングされて誤検出が除去されます。最後のステップは、参照スペクトルライブラリを使用して実験サンプルにマッピングし、同じ組成のナノ粒子を特定して位置を特定することです。最終的に、強化された暗視野顕微鏡法とハイパースペクトルマッピングは、電子顕微鏡などの他の技術よりも迅速かつリソース集約的でない方法で組織学的サンプル中の金属酸化物ナノ粒子を同定するために使用されます。

この方法には、電子顕微鏡などの従来のナノマテリアルイメージングおよび特性評価技術に比べて、いくつかの利点があります。その中、サンプル調製は通常最小限で非破壊的です。画像の取得と解析は、時間とコストが少なく、さまざまなマトリックスのナノ粒子イメージングに適用できます。

この方法論は、適切なポジティブコントロールサンプルと参照スペクトルライブラリの作成が困難で時間がかかるため、苦労することがあることを誰もが知っていました。しかし、これらの最初のステップが完了すると、実験サンプルをかなり迅速に評価できます。この方法は、ナノ粒子の皮膚浸透に関する洞察を提供するだけでなく、気管支肺胞洗浄や血液塗抹標本などの他の生物学的サンプルや、職業暴露評価に使用されるフィルターなどの非生物学的サンプルにも適用できます。

この手法を実演するのは、私の研究室の医学生であるPlar Sosaで、光源、ステージコントローラー、光学カメラ、ハイパースペクトルカメラ、およびコンピューターシステムを接続してオンにします。次に、ステージとコンデンサーを操作位置まで上げ、コンデンサーレンズにタイプAの浸漬油を3〜5滴慎重に塗布します。気泡が発生した場合は、油分を拭き取り、レンズに再度塗布してください。

次に、サンプルをステージ上に置き、浸漬油がスライドの下側に接触するまでコンデンサーをゆっくりと上げます。これは、オイルがスライドに接触する照明の急速に明るくなるリングを通じて顕著になります。コンデンサーを所定の位置に置き、10 x対物レンズに切り替えてから、必要に応じてコンデンサーに焦点を合わせて位置合わせし、コンデンサーの位置合わせノブを調整して明るいスポットを中央に配置します。

光学イメージングソフトウェアを開きます。ファインオブクティブフォーカスノブを使用してサンプルに焦点を合わせます。次に、関心のある領域を見つけます。

必要に応じてコンデンサーの焦点を調整して、照明を平衡化します。メニューバーの設定タブをクリックし、画像キャプチャボタンをクリックします。キャプチャイベント用。

目的の画像形式を選択し、画像のファイル名を割り当てます。さらに、デフォルトのタイムラプス値を選択し、最後に[OK]をクリックします。次に、露出メニューに移動し、最もコントラストの高い画像を作成する露出設定を選択します。

ここでは、レベルを0.0%に設定し、ゲインを2.8デシベルに設定し、シャッタースピードを56ミリ秒秒に設定します。メニューバーの画像ボタンをクリックして、画像をキャプチャします。目標を 40 x と 100 x に変更します。

高倍率で画像を撮影し、ライトガイドがハイパースペクトルカメラに向けられていることを確認してから、ソフトウェアでHSIデータキューブを取得するためのハイパースペクトルイメージングソフトウェアを開き、メニューバーのハイパースペクトル顕微鏡を開き、HSI顕微鏡コントロールを選択します。ここでは、対物レンズの倍率と安全な経路を設定します。次に、設定でエリアキャプチャを変更し、行数を変更します。

この研究では、720を使用して露光時間を設定しました。ここでは0.25秒を使用しました。他のすべてはデフォルトのままにして、プレビューHSIをクリックして画像を表示します。

ユーザーがカメラのフィールドの中心の x 軸を横切って移動したときの最高波長の強度を表す結果の強度グラフを観察します。カーソルを移動して、グラフの正確なアウトラインを生成します。これにより、左側に数値の強度インジケーターが表示されます。

このプレビューに基づいて、細かい対物フォーカスを調整して画像のピークをシャープにすることで、画像のピントを合わせます。次に、光源の輝度コンデンサーの焦点を調整して光の強度を最適化するか、プレビューをキャンセルしてソフトウェアで露光時間を調整します。[キャプチャ] をクリックし、使用可能な名前を持つ 4 つの新しいウィンドウを確認します。

バンドリスト。一番のズーム。ナンバーワン、スクロール、ナンバーワンのRGBバンドが表示されます。

1 番の RGB バンド ウィンドウはデータ キューブであり、将来のすべての参照に使用されるため、最大化します。右。このデータ キューブをクリックし、tiff ファイルとして保存して、[OK] をクリックします。データキューブ画像ウィンドウを右クリックし、Zプロファイルスペクトルを左クリックします。

ポップアップスペクトルプロファイルウィンドウが左側に表示されたら、データキューブターゲット上の目的のピクセルをクリックします。最も明るいのは、関心のある材料を表していると自信を持って識別できるものです。パーティクル解析メニューで、パーティクル フィルター ツールを選択して、データ キューブに存在するパーティクルを特定します。

新しいポップアップ ウィンドウ セットでは、スペクトルの最大値が値を超える必要があるため、背景ピクセルよりも高くなりますが、対象のマテリアルよりも低くなります。有効なデータの最大値は 16, 000 です。パーティクル フィルタ レビュー ツール ウィンドウで、[select all] をクリックします。

次に、「スペクトルライブラリにエクスポート」をクリックし、スペクトルライブラリの名前を割り当てます。ネガティブコントロールとして機能するサンプルを選択した後、サンプルからいくつかのデータキューブを取得します。ハイパースペクトル カメラを使用するには、少なくとも 1 つ必要ですが、さらに多くのカメラをキャプチャできます。

ネガティブコントロールデータキューブを開いた状態で選択性を高めるには、フィルタースペクトルライブラリをクリックします メインプログラムツールバーにある解析メニューの下で、[新しいファイルを開く]をクリックし、以前にポジティブコントロール用に作成したスペクトルライブラリを入力ファイルとして選択し、[OK]をクリックします。フィルターcyto vivaスペクトルライブラリウィンドウ。画像をクリックし、参照スペクトルライブラリの出力ファイル名を選択し、[OK]をクリックします。

次に、ネガティブコントロールデータキューブのファイル名をソース画像としてクリックします。ソフトウェアはスペクトルライブラリを分析し、ネガティブコントロールデータキューブの任意のスペクトルに一致する各スペクトルを削除します。実験データキューブを開いた状態で、実験サンプルからデータキューブを取得します。

マッピング方法サブメニューのスペクトルメニューをクリックし、スペクトル角度マッパーを開きます。ポップアップ・ウィンドウで実験データ・キューブの名前を選択し、「OK」をクリックします。ファイル名がリストされていない場合は、「新しいファイルを開く」をクリックし、実験データキューブを選択します。

次に、End Member collection、SAMというポップアップウィンドウで[OK]をクリックし、メニューバーのインポートをクリックします。次に、スペクトルライブラリファイルから選択します。以前に作成した参照スペクトルライブラリを開き、[OK]をクリックします。

[Input Spectral Library] という名前の新しいポップアップ ウィンドウで、[select all items] をクリックし、[OK] をクリックします。次に、色を右クリックして選択します。デフォルトの色をすべて適用し、[すべて選択]、[適用]の順にクリックし、出力ファイル名を選択して[OK]をクリックします。

データ・キューブ・ウィンドウでオーバーレイ・メニューを開き、「分類」を選択します。次に、出力ファイル名に移動し、[OK]をクリックします。インタラクティブ クラス ツール ウィンドウ メニューで、オプション メニューを開き、結合クラスを選択して統一された配色を作成します。

他のソフトウェアを使用してデータを分析しやすくするために、基本クラスリストから 1 つのスペクトルを選択します。次に、未分類以外のすべてのクラスを選択して、ベースにマージします。次に、[OK]をクリックします。

次に、選択したベースカラーをクリックすると、一致するすべてのスペクトルがその色で表示されます。黒の背景に一致するスペクトルを表示するアマチック画像を取得するには、黒である未分類のカラーボックスをクリックします デフォルトでは、この技術の最も重要な利点は、暗視野顕微鏡法とハイパースペクトルマッピングによって組織学的サンプル中の金属酸化物ナノ粒子を同定する能力です。これらの画像は、組織学的皮膚サンプルを使用してこのプロセスを示しています。

一部の粒子は暗視野、光学画像で容易に明らかですが、ハイパースペクトルイメージングを使用して追加の粒子が検出されます。ここに示されているのは、表皮層のブタの皮膚組織で、イルミナナノ粒子にさらされました。シリカナノ粒子に曝露された真皮層の角膜層上に、ナノ粒子の高コントラストクラスターが沈着しているのが見つかりました。

結合組織上に複数の高コントラストナノ粒子が堆積しているのがわかります。最後に、シリアナノ粒子に曝露された皮下組織で。この方法を用いて、脂肪細胞ナノ粒子の同定に沿って複数の高コントラスト分散ナノ粒子が堆積しているのが見られます。

肺、肝臓、脾臓、腎臓などの他の組織サンプルでは、そしてリンパ節が可能です。この手順に従って、粒子数や粒子の位置などの追加の質問に答えるために、画像分析を実行できます。高度に専門化された制御の必要性やフォトニックイメージングの解像度の制限など、特定の考慮事項と欠点を従来の方法と比較検討する必要があります。

特定の研究課題を調査するために最も適切な分析技術を選択する際、現在および将来のナノ毒性学研究を補完する可能性があるため、この特定のアプリケーションを実証することを選択しました。また、ナノ粒子の吸収、分布、代謝、臓器や組織全体の排泄に関する研究にも役立つ可能性があります。