定量的リアルタイムPCRによるマウス乳腺腫瘍モデルにおける肺転移の評価

この手順の全体的な目標は、転移を分析する方法として、肺の腫瘍細胞から特定の MRNA の量を検出することです。この手法の主な利点は、転移の定量的尺度であることです。肺腫瘍の解剖を行うには、テキストプロトコルに従って致死量のイソフッ素を使用してマウスを安楽死させた後、マウスを背中のフォームボードに置き、手足を広げてマウスをボードに固定します。

エタノールを使用してマウスにスプレーした後、鉗子を使用して動物の下部を中央でつかみ、はさみで、マウスの腹腔を貫通しないように注意しながら、皮膚を通して首に向かって上向きに切ります。次に、動物の下端にある腹膜をつかみ、首の付け根に向かって上向きに切り始めます。胸郭の左側と右側に沿って慎重に切り込み、胸腔に出血する可能性のある血管を切断しないように注意してください。

横隔膜と胸郭の上部を通して左右に切り込んで、肋骨を取り除きます。次に、鉗子を使用してマウスの気管をつかんで前方に引っ張り、解剖ハサミを使用して気管を切断してからマウスから肺を取り出します。PBSを使用して、肺組織をやさしく洗います。

次に、テキストプロトコルに従って肺組織の肉眼的評価を行った後、肺をすぐに分析する場合は、RNA単離に進みます。組織からRNAを単離するには、テキストプロトコルに記載されている方法のいずれかを使用して組織を均質化することから始めます。RNA単離キットから溶解バッファーを調製し、各ミリリットルの溶解バッファーに20マイクロリットルの腫瘍カプトエタノールを添加します。

300マイクロリットルの溶解緩衝液に組織30グラムごとに再懸濁し、30%振幅に設定された超音波発生器を使用して、組織を10秒間超音波処理します。10マイクロリットルのプロチナーゼKを590マイクロリットルのTEバッファーに添加し、600マイクロリットルのバッファーを300マイクロリットルの超音波処理組織に添加します。室温で10分間インキュベートします。

次に、サンプルを 13, 000 倍 G 以上で 10 分間遠心分離して、破片を除去します。次に、上清を新しいチューブに移します。上清900マイクロリットルごとに450マイクロリットルのエタノールを加えて、RNAを沈殿させます。

次に、700マイクロリットルのライセートエタノール混合物をRNAカラムに移します。再びGの13,000倍以上で1分間回転させ、RNAをカラムに結合させます。その後、廃液を捨て、残った上清をカラムに加え、再度回転させます。

次に、350マイクロリットルの洗浄バッファー1をカラムの上部に加え、サンプルを30秒間遠心分離します。廃液を捨て、チューブ内のカラムを交換します。各サンプルについて、5ユニットのDNase One酵素と5マイクロリットルの10X DNaseバッファー、および40マイクロリットルのDNase RNaseフリー水を混合してDNaseを調製します。

各カラムに50マイクロリットルのDNaseミックスを加え、室温で15分間インキュベートします。次に、350マイクロリットルの洗浄バッファー1をカラムに加え、サンプルを30秒間遠心分離します。廃液を廃棄した後、600マイクロリットルの洗浄バッファー2を加え、さらに30秒間回転させます。

250マイクロリットルの洗浄バッファー2を追加する前に液体を捨て、2分間回転させます。カラムを新しい収集チューブに移し、50〜100マイクロリットルのRNase DNaseフリー水をカラムに加えます。1分間インキュベートした後、1分間回転させます。

回収した溶出液をカラムに再流し、RNAの収量を増やします。すぐに使用できるように、サンプルを氷の上に置いてください。後で使用する場合は、ドライアイスまたは液体窒素で急速冷凍し、必要になるまで摂氏マイナス80度で保管します。

分光光度計を使用して、RNAを定量します。次に、滅菌済みRNase DNaseフリーPCRチューブまたはプレートで、この表に示すように、0.5〜2 μgの全RNAを使用して、最初の再合成用の反応ミックスを調製します。混合し、穏やかに遠心分離し、ここに示すプログラムを使用して標準的なPCR装置をプログラムします。

反応が完了したら、滅菌したヌクレアーゼフリーの水を使用して、完成した反応を目的の容量に希釈します。リアルタイムPCRを行うには、ヒトHER2などのポジティブコントロールC DNAを使用し、C DNAの1〜4回の段階希釈液を調製して5つの標準を生成することにより、各プライマーセットの標準曲線を設定します。次に、標準曲線と実験サンプルを含む合計サンプル数を計算します。

次に、滅菌済みRNase DNaseフリーチューブで、目的の各実験遺伝子のマスターミックスと、gapdhなどの内部コントロールを調製します。標準試料または実験サンプルごとに1マイクロリットルのC DNaseを含む試験プレートを調製します。各プライマープローブについて、ウェルごとに少なくとも1つのC DNAサンプルを割り当てます。

各プライマープローブについて、ウェルごとに19マイクロリットルのマスターミックスを添加します。この生物発光実験は、ギャップ結合タンパク質Connexin 43を標的とするACT1で処理したマウスの肺がルシフェラーゼ活性に対して陰性に見えることを示しており、組織に腫瘍細胞が存在しないことを示唆しています。しかし、肺組織のH&E切片の解析では、ルシフェラーゼによって照射されなかった微小転移が示されており、ルシフェラーゼイメージングは低数の腫瘍細胞を検出するのに十分な感度ではないことが示唆されている。

ここに示されているのは、HER2に特化したプローブを使用して、マウスメモリー脂肪パッドに最初に移植された細胞から肺組織中のヒトHER2およびJIMT1腫瘍細胞を検出するためのqRT-PCR実験の結果です。いずれの肺にも肉眼的に見える転移は観察されなかったが、11のサンプルのうち2つで、qRT-PCRは転移を検出した。この図では、細胞番号系列のマウス肺gapdhに正規化された相対的なHER2レベルを決定するために、標準曲線解析を準備しました。

結果は、HER2プローブを使用したqRT-PCRが、わずか10個の細胞でHER2レベルを検出するのに十分な感度を示していました。最後に、この回帰分析は、陽性コントロールとネガティブコントロールを含む、各肺サンプルの相対細胞数を示します。一度習得すると、このテクニックは適切に実行すれば、6〜8時間で完了します。

この手順を試みる際には、RNA単離および逆転写酵素反応中にRNAの完全性を維持するための予防策を講じることを忘れないでください。このビデオを見た後、定量的なリアルタイムPCRによって全肺組織の転移を検出する方法を十分に理解しているはずです。