定量的リアルタイムPCRによるマウス乳腺腫瘍モデルにおける肺転移の評価

この手順の全体的な目的は、転移を分析する方法として、肺の腫瘍細胞から特定のmRNAの量を検出することです。この手法の主な利点は、転移を定量的に測定できる点にあります。肺腫瘍の解剖を行うには、テキストプロトコルに従って致死量のイソフルランを用いてマウスを安楽死させた後、マウスをフォームボードの上に仰向けに置き、四肢を広げて解剖ピンでボードに固定します。

マウスにエタノールをスプレーした後、ピンセットで動物の中央下部を掴み、ハサミを用いて、マウスの腹腔を突き破らないように注意しながら、皮膚を首に向かって上方に切開します。次に、動物の下端にある腹膜を掴み、首の付け根に向かって上方に切開し始めます。胸腔内で出血する可能性のある血管を切断しないよう注意しながら、肋骨辺縁の左右に沿って慎重に切開します。

横隔膜と肋骨の上部を左右に切開し、肋骨を取り除きます。次に、ピンセットでマウスの気管を掴んで前方に引き出し、解剖用ハサミで気管を切断して、マウスから肺を取り出します。PBSを用いて肺組織を優しく洗浄してください。

次に、テキストプロトコルに従って肺組織の肉眼的評価を行い、肺をすぐに解析する場合は、RNA抽出に進みます。組織からRNAを抽出するには、まずテキストプロトコルに記載されている方法のいずれかを用いて組織をホモジナイズします。RNA抽出キットを用いて溶解バッファーを調製し、溶解バッファー1 mLあたり20 µLのtumor captoethanolを添加します。

30 gの組織を300 µLのライシスバッファーで再懸濁し、振幅30%に設定したソニケーターで10秒間超音波処理します。10 µLのプロテアーゼKを590 µLのTEバッファーに加え、このバッファー600 µLを、超音波処理した組織300 µLに加えます。室温で10分間インキュベートします。

次に、13,000 ×g 以上で10分間遠心分離し、デブリを除去します。その後、上清を新しいチューブに移します。RNAを沈殿させるため、上清 900 µL ごとに 450 µL のエタノールを加えます。

次に、溶解液とエタノール混合液 700 µL を RNA コラムに転写します。13,000 ×g 以上の遠心力で 1 分間再度遠心し、RNA をコラムに結合させます。その後、廃棄液を捨て、残りの上清をコラムに加えて、再度遠心します。

次に、カラムの上部に350 µLの洗浄バッファー1を加え、サンプルを30秒間遠心分離します。廃液を捨て、カラムをチューブに戻します。各サンプルにつき、5 unitのDNase I酵素、5 µLの10X DNaseバッファー、および40 µLのDNase/RNaseフリー水を混合して、DNaseを調製します。

各カラムに50 µLのDNase mixを加え、室温で15分間インキュベートします。次に、カラムに350 µLのwash buffer oneを加え、サンプルを30秒間遠心分離します。廃液を捨てた後、600 µLのwash buffer twoを加え、さらに30秒間スピンします。

液を廃棄した後、250 µLの洗浄バッファー2を加え、2分間遠心分離します。カラムを新しい回収チューブに移し、RNase DNase free waterを50～100 µLカラムに加えます。1分間インキュベートした後、1分間遠心分離します。

RNAの収量を増やすため、回収した溶出液を再度カラムに通します。すぐに使用する場合は、サンプルを氷上で保持してください。後で使用する場合は、ドライアイスまたは液体窒素で急冷し、必要になるまで-80°Cで保存してください。

分光光度計を用いてRNAを定量します。次に、滅菌済みのRNase/DNaseフリーPCRチューブまたはプレートを用いて、本表に示す通り、0.5〜2 µgの全RNAを使用して一次転写反応ミックスを調製します。混合後、軽く遠心分離し、ここに示すプログラムを用いて標準的なPCR装置で動作させます。

反応が完了したら、滅菌済みのヌクレアーゼフリー水を用いて、完成した反応液を目的の量まで希釈します。リアルタイムPCRを行うには、ヒトHER2などのポジティブコントロールcDNAを使用し、cDNAを1〜4段階で連続希釈して5つの標準試料を調製することで、各プライマーセットの標準曲線を作成します。次に、標準曲線および実験試料を含む全サンプル数を算出します。

次に、滅菌済みのRNase/DNaseフリーチューブを用いて、各目的遺伝子およびgapdhなどの内部コントロールのマスターミックスを調製します。各標準サンプルまたは実験サンプルのために1 µLのcDNAを含むテストプレートを準備します。各プライマープローブにつき、1ウェルあたり少なくとも1つのcDNAサンプルを割り当てます。

各プライマープローブにつき、1ウェルあたり19 µLのマスターミックスを添加します。この生物発光実験では、ギャップ結合タンパク質Connexin 43を標的とするACT1で処理したマウス肺において、ルシフェラーゼ活性が陰性であることが示されており、組織内に腫瘍細胞が存在しないことが示唆されます。しかし、肺組織のH&E染色切片を解析すると、ルシフェラーゼでは発光しなかった微小転移が認められ、ルシフェラーゼイメージングは少数の腫瘍細胞を検出するには感度が不十分であることが示唆されました。

ここでは、マウスの記憶脂肪パッドに移植した細胞に由来する肺組織中のヒトHER2陽性JIMT1腫瘍細胞を検出するために、HER2特異的なプローブを用いたqRT-PCR実験の結果を示しています。どの肺においても肉眼で確認できる転移は見られませんでしたが、11サンプル中2サンプルにおいてqRT-PCRで転移が検出されました。この図では、細胞数シリーズにおけるマウス肺のgapdhで標準化した相対的なHER2レベルを決定するために、標準曲線分析が行われました。

結果は、HER2プローブを用いたqRT-PCRが、わずか10個の細胞におけるHER2レベルを検出できる十分な感度を有していることを示しています。最後に、この回帰分析により、陽性および陰性コントロールを含む各肺サンプルの相対的な細胞数が示されます。この手法に習熟すれば、適切に実施することで6〜8時間で完了させることができます。

この手順を行う際は、RNA分離および逆転写反応の間、RNAの完全性を維持するための予防策を講じることが重要です。このビデオを視聴することで、定量リアルタイムPCRを用いて、肺全組織における転移を検出する方法について十分に理解できるはずです。