細胞内のCaの蛍光と生物発光イメージング ²⁺高齢者における海馬ニューロン

この手順の全体的な目標は、ニューロン老化のモデルと考えられている皮海馬ニューロンの長期培養における細胞質およびミトコンドリアカルシウムの蛍光および生物発光イメージングを使用して、老化脳におけるカルシウムリモデリングを調査することです。この方法は、細胞内カルシウムのリモデリングがカルシウム過剰に関連する興奮毒性とニューロン損傷にどのように寄与するかなど、老化分野における重要な問題を理解するのに役立ちます。この技術の主な利点は、この技術の同じ標本の重複からin vitroで異なるDYSで培養を使用して個々のニューロンのカルシウムリモデリングを密接に追跡することが可能であることです。これは、このエージェント関連疾患のカルシウム過負荷に関連する新規ターゲットを変数化するため、脳卒中または細胞疾患の治療を通じて行われます。

このビデオを見た後、Jesusは、ラット海馬ニューロンの短期および長期培養における細胞質およびミトコンドリアカルシウムの蛍光および回想イメージングを行う方法をよく理解しています。この手順を開始するには、シャーレ内のパラフォームのストリップにカバースリップを配布します。次に、各カバースリップに1ミリグラムあたり1ミリグラムで200マイクロリットルのポリDリシンを塗布し、一晩治療します。.

翌日、カバースリップを二重蒸留滅菌水で15分ごとに90分間滅菌条件下で洗浄します。カバースリップをマルチに入れ、使用するまで摂氏37度、CO2を5%に保温したインキュベーターに保管します。海馬ニューロンを分離するには、新生児ラットの子犬の頭蓋骨を滅菌ハサミで開き、へらで脳を抽出し、ハムのF12培地ですばやく洗います。

次に、各半球にメスで斜めに切り込みを入れ、顕微鏡下でハムF 12培地を含むシャーレに移します。髄膜を捨てます。皮質の上の特徴的な凹面の位置にある海馬を慎重に識別します。

次に、海馬を慎重に引き離し、アイハサミを使用して海馬を皮質から分離します。次に、海馬片を1.8ミリリットルの濾過済みペパン溶液が入ったバイアルに移します。摂氏37度でインキュベートし、時々穏やかに振とうしながら15分間

次に、90マイクロリットルのDNAの1つの溶液を追加します。ミリリットルあたり50マイクログラムを加え、さらに15分間インキュベートします。その後、組織を10ミリリットルの遠心チューブに移し、新鮮な神経基礎培養培地で断片を洗浄します。

組織片を5ミリリットルのプラスチックピペットに通すことにより、細胞懸濁液を得る。次に、細胞懸濁液を160 Gで5分間遠心分離します。その後、プラスチック製の滅菌牧草地ピペットを使用して仰臥位を取り出し、1ミリリットルの自動ピペットを使用して1ミリリットルの神経基礎培養培地にペレットを慎重に懸濁します。

次に、ノイバウアー計数チャンバーを使用して細胞密度を測定します。10マイクロリットルの細胞懸濁液を加え、顕微鏡下で細胞の数を数えます。次に、対応する計算を実行して、約30, 000個の細胞を含む40〜80マイクロリットルの細胞懸濁液を取得します。

500マイクロリットルの神経基礎培地を含む4つのウェルプレートで、ガラスカバースリップを含む各ウェルに約30,000個の細胞を再生した。若いニューロンの場合はin vitroで2〜5日間、老化したニューロンの場合はin vitroで15日以上インキュベーターに保管してください。この手順では、午前2時00分より少ない細胞を室温の暗所で60分間インキュベー

次に、カバースリップを増殖チャンバーに移します。その後、カバースリップ付きのプロフュージョンチャンバーを倒立顕微鏡のホルダーに置きます。微視的なフィールドを選択し、プレウォームHBSで細胞を連続的に灌流します。

続いて、エピは340ナノメートルと380ナノメートルで細胞を照らします。次に、5秒から10秒ごとに520ナノメートルで放出される光を蛍光カメラで記録し、蛍光カメラをfira two diicミラーでフィルタリングします。記録された蛍光画像を解析するには、まずAqua Cosmosソフトウェアを使用して実験ファイルを開き、ratioをクリックして目的の比率範囲を選択します。

結果の画像のピクセルごとの比率を計算して、一連の比率の画像を取得します。次に、背景消去ボタンを調整して背景を減算します。その後、計算の開始を押します。

次に、すべての時系列ボタンを押して、個々の細胞の定量分析のために古いROIを消去します。新しいROIまたは個々のニューロンに対応するROIを確立します。個々の記録をグラフ化するには、グラフをクリックして、各ROIに対応する蛍光比値をOriginラボプログラムにエクスポートします。

次に、[計算]をクリックしてTXTファイルを保存します。その後、MIT変異体プラスミドを用いて培養ニューロンをトランスフェクションする各刺激に対する各刺激に対する蛍光比の上昇の大きさを推定するための対応する計算を行います。まず、トランスフェクション試薬を含む溶液Aをバイアルに50マイクロリットル調製します。

次に、バイアルにMIT uteプラスミドを含む50マイクロリットルの溶液Bを調製します。溶液Bを溶液Aに加え、20分間インキュベートします。その後、海馬ニューロンを含むカバースリップを、200マイクロリットルの新鮮な神経基礎TFを含む新しいマルチディッシュに移します。次に、100マイクロリットルの溶液AとBを各カバースリップに一滴ずつ加え、30分間インキュベートします。

30分後、メディウムを取り出します。新鮮な神経基底tfで細胞を洗浄します。戻されると、カバーは元の神経基礎培養培地に滑り込み、トランスフェクション後24時間細胞を培養して、プローブの効率的な発現と標的化を可能にします。

次に、HBSの200マイクロリットルに4マイクロリットルのシーラントTEREZIN Nを加えて、4マイクロモルの最終濃度を得ます。穏やかに混合し、暗所で室温で2時間インキュベートします。2時間後、トランスファーカバーを灌流チャンバーに滑り込ませ、予温したHBS溶液で連続的に精査します。

ミトコンドリアのカルシウム濃度の生物発光画像を記録するには、蛍光発光で示されるように、APOコリンを発現する細胞を含む微視的なフィールドを選択します。次に、顕微鏡のライトを消します。光路にあるダイクロイックを含むボックスを取り外します。

次に、励起ライトをオフにし、完全な暗闇のために暗いボックスを閉じます。37°Cに予め温めた試験溶液の有無にかかわらず、HBS培地で細胞を灌流します。次に、画像プロセッサで処理されたフォトンカウンティングカメラで10秒ごとにフォトニック発光画像をキャプチャします。

次に、dig toinを追加して残りのすべての光子を放出し、ミトコンドリアカルシウムを反映した生物発光画像を分析します。GFP蛍光画像を開きます。トランスフェクションされた細胞の周囲に描画して、個々のROIを選択します。

次に、シーケンスのすべての画像に同じROIをコピーして貼り付けます。画面キャプチャ。その後、各ROIのフォトニック発光値を特定のソフトウェアにエクスポートして、グラフをクリックします。

すべてのROIの値を計算するには、合計値を選択し、すべての画像に現在のROIを使用します。続いて、計算を押し、テキストファイルを保存してデータをエクスポートします。次に、示された各刺激に対するミトコンドリアカルシウムの上昇の大きさを推定するための対応する計算を行います。

これは、100マイクロモルおよびMDA暖色系の刺激前後の海馬ニューロンの短期および長期培養の代表的な明視野および疑似カラー画像であり、細胞質カルシウム濃度の上昇を反映しています。これらのトレースは、海馬ニューロンの短期および長期培養における100マイクロモルおよびMDAに応答した細胞質カルシウム濃度の代表的な単一細胞記録を示しています。細胞質カルシウム濃度の増加は、短期の培養ニューロンよりも長期的にはるかに大きいことに注意してください。

この実験では、培養した海馬ニューロンに、4マイクロモルシーラントテレジンとインキュベートしたGFPに低親和性ミトコンドリア標的コリンをトランスフェクションし、ミトコンドリアカルシウム濃度の生物発光イメージングを行いました。ここでは、ミトコンドリアカルシウムを反映した光放射が短期および長期の培養海馬ニューロンで放出されることを示す記録を示します。MDA 100マイクロモルは、老化したニューロンのミトコンドリアカルシウム濃度を増加させましたが、この手順の後、若い培養海馬ニューロンでは増加しませんでした。

フェアレフト評価などの他の方法は、ニューロン細胞に対する感受性、老化神経変性に関連するリード、虚血などの追加の質問に答えるために、同じ細胞内の蛍光および生物発光イメージングと組み合わせることができます。