Name: 細胞内のCaの蛍光と生物発光イメージング 2+高齢者における海馬ニューロン (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 24 s
Description: 学ぶ蛍光・生物発光イメージングを用いたラット海馬ニューロンの細胞質・ミトコンドリアカルシウム動態解析。老化におけるカルシウムリモデリングと興奮毒性のメカニズムを解明し、神経変性疾患治療標的の発見に貢献します。

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この作業は、スペインのMinisterio de Economìa y competitividad (BFU2012-37146) と Junta de Castilla y Leòn (BIO103/VA45/11, VA145U13 and BIO/VA33/13) の支援を受けました。MCRは、Junta de Castilla y Leòn(スペイン)とEuropean Social Fundの支援を受けました。故Philippe Brûlet博士(1947-2013)には、ミトコンドリアGFPイクオリンプラスミドを提供していただき、感謝いたします。

倫理声明：動物を対象とする手順は、欧州条約123 /欧州評議会と指令609分の86 / EECに一致バリャドリッド大学動物飼育施設によって承認されたプロトコルの下で処理されました。 ラット海馬ニューロンの1短期・長期の文化<ol><li>ポリ-D-リジンの製造は、12 mmのガラスカバースリップコーティング。 <ol><li>少なくとも24時間、エタノール中に直径12mmのガラスカバースリップを滅菌します。彼らは無菌条件下で乾燥することができます。 </li><li>ペトリ皿にパラフィルムのストリップ上にカバーグラスを配布します。 1 mg / mlのポリ-D-リジンの200μlで、各カバーグラスの表面を覆います。 O / Nを処理できるようにします。 </li><li>次の日は、無菌条件下で90分間蒸留滅菌水で15分毎にカバーガラスを洗います。 </li><li>神経基礎培養培地500μlで4ウェルmultidishプレートを埋めるウェルあたり。神経基礎培養培地を補足する必要があります10％ウシ胎児血清、2％のB27、を1μg/ mlのゲンタマイシンおよび2mM L-グルタミン。 </li><li> multidishプレートにカバースリップを置きます。加湿37ºC、使用するまで、5％CO 2インキュベーターでそれらを維持します。 </li></ol></li><li>新生ラットからの海馬神経細胞の単離。 <ol><li>無菌条件下でバイアル（20μL/ ml）に1.8ミリリットルパパイン溶液（直接購入）準備：20μlの最終濃度を得るために/ 1.8ミリリットルハンクスプラス0.6％BSA中で約40μlのパパイン追加ML（μlを計算する必要があります）サプライヤーの条件によって異なります。ハンクス0.6％のBSA、4％のウシ血清アルブミンの15 mlのHBSS培地85 mlと混合することにより調製される（BSA、100 mlのHBSS中でBSAを4g解決調製しました）。無菌フードでそれを準備します。 </li><li>使用前に37ºCで30分間ハンクスプラス0.6％BSA中のパパインをインキュベートします。使用前に0.22μmのフィルターを使用してソリューションをフィルタリングします。 </li><li>ダルベッコ添加することによりハムF-12培地を調製二重滅菌蒸留水900ミリリットルにイーグル培地粉末（1Lあたり13.5グラム）を修正しました。その後、6グラムHEPESを追加して、336ミリグラムのNaHCO 3及びNaOH 4 N. 1 L溶液を得るために、滅菌水を加え、0.20μmのポリエーテルスルホン（PES）ボトルトップフィルターを使用してフィルタリング使用し7.42のpHを調節します。無菌フード内でこのプロセスを実行します。最後に、使用前に無菌条件下でのCO 2で溶液を飽和させます。ストアソリューション4ºCで、冷却それらを使用しています。 </li><li>断頭により新生児（P0）仔ラットを安楽死させると、滅菌HBS培地で頭を洗います。滅菌はさみの助けを借りて、頭蓋骨を開きます。へらで脳を抽出し、HamのF-12培地中ですぐにそれを洗います。 </li><li>各半球（ 図1B）でメスの助けを借りて斜めカットを行い、ハムF-12培地を含むペトリ皿にそれを運びます。 </li><li>解剖鉗子の助けを借りて、拡大鏡の下で慎重に髄膜を捨てます。 </li> &lt;李は&gt;虫眼鏡を使用して、皮質の上に特徴凹状の場所に海馬を特定します。そして、1国境から慎重に引き出し、目のはさみを使用して、その位置からそれを除去することによって、皮質から海馬を分離。 </li><li>無菌ハンクス培地のCa 2+を欠くとMg 2+プラス0.6％BSAで満たされた4ウェルプレートに海馬組織を移し、海馬組織を洗います。培地を除去せずに、同じ目のはさみを使用して、（2×2ミリメートル程度）小片に組織を切断します。 </li><li> 1.8ミリリットルプレフィルタパパイン溶液を含有するバイアルに海馬の部分を転送します。そして時折、穏やかに振とうしながら37ºCでそれらを培養します。 15分後、（最終50μg/ mlの）のDNase I溶液の90μlを添加し、さらに15分間インキュベートします。 </li><li> 10ミリリットルの遠心チューブに組織を移し、新たな神経基礎培養培地で断片を洗います。 5mLのプラスチックピップを通して組織フラグメントを通過させることにより、細胞懸濁液を得ますETTE。 </li><li> 5分間160×gで遠心細胞懸濁​​液。プラスチック滅菌パスツールピペットを用いて上清を除去したNeurobasal培養培地1mlのピペットを自動1mlで注意深くペレットを一時停止します。 </li><li>ノイバウアーカウントチャンバーを用いて細胞密度を測定します。ノイバウアー室の上にカバーガラスを置きます。 10μlの細胞懸濁液を追加します。細胞懸濁液を均一かつ気泡を作るんチャンバに入ることを確認してください。 30×10 3細胞を含有する40-80マイクロリットルの適切な低下を得るために、顕微鏡下で細胞数をカウントし、対応する計算を実行します。細胞の総数は、使用される動物の数に依存します。 </li></ol></li><li>短期およびラット海馬神経細胞の長期培養。 <ol><li>それぞれに、約50マイクロリットルの低下に約30×10 3細胞を神経基礎培養培地500μlを含む4ウェルmultidishプレートの上に前に準備し、インキュベーター、プレートに保持1つのウェルポリ-D-リジンでコーティングされた、直径12mmのガラスカバースリップを含むmultidishプレートの。 </li><li>文化を変えることなく、実験の前に、インビトロでの 2-5日（DIV、短期、若い文化）または&gt; 15 DIV（長期熟成の文化）加湿37ºC、5％CO 2インキュベーター内で一次海馬細胞を維持メディア。 </li></ol></li></ol>細胞質Ca 2+濃度の2蛍光イメージング<ol><li>蛍光イメージングのための試験溶液の調製。 <ol><li> NaCl 145、KClの5、のMgCl 2 1、CaCl 2を1、グルコース10、ナトリウムHEPES 10（pHは7.42を）：MMで、含む外部HEPES緩衝生理食塩水（HBS）溶液を調製します。 </li><li> NaCl 146、KClの5、グルコースのCaCl 2 1、10およびHEPES 10（pHは7.42）：MMで含む外部、Mg 2+を含まない、HEPES緩衝生理食塩水（HBS）ソリューションを準備します。 </li><li> FINAでのMg 2+を含まない 、HEPES緩衝生理食塩水（HBS）にNMDAを解きますリットル、100μMの濃度と10μMのグリシンとそれを補います。 </li><li> KCl 145、MgCl 2を1、CaCl 2を1、グルコース10およびHEPES 10（pHは7.42）を：（MMで）解くことで代わりのNaClのKClを含むHBS溶液を調製します。 </li></ol></li><li>蛍光カルシウムプローブFURA2 / AMで海馬細胞の負荷。 <ol><li>インキュベーターからカバーガラスを含む細胞培養物を取り、ウェルあたりHBSを500μlを含む新しい4ウェルmultidishプレートにそれらを転送することにより、室温でHBS培地でそれらを洗ってください。 </li><li> FURA2で細胞をインキュベート/暗所でRT（25ºC）で60分間（同じHBS培地中で調製した）AM 4μM。 </li><li> 60分後、新鮮なHBS培地でカバーグラスを洗います。 </li></ol></li><li>培養細胞中の[Ca 2+]細胞質ゾルの蛍光画像を記録します。 <ol><li>ランプ、顕微鏡、灌流システム、蛍光カメラとコンピュータの電源を入れます。 </li><li>以下のためのサーモスタットのプラットフォームでカバースリップを置き倒立顕微鏡のステージ上でオープン12ミリメートルのガラスカバースリップとは、対物レンズ40倍（1.3油、NA）を使用して微細なフィールドを選択します。不在または試験物質の存在下で（37ºC）予め温めたHBS培地で連続的に細胞を灌流。 /分、約5〜10 mlとの速度で流れを維持します。 注：生きている細胞の細胞灌流システムは、オープン12ミリメートルのガラスカバースリップ用サーモスタットプラットフォームに装着されています。弁制御装置を搭載した8ライン重力駆動灌流システムは、溶液を灌流するために使用されます。真空ポンプは、過剰の培地を除去する責任があります。ソリューションは、内管の加熱システムを使用して加熱されます。 </li><li>シャッターが両方の励起波長で閉鎖して、背景画像をキャプチャします。 </li><li> 340および380 nmで交互に細胞をエピは、点灯します。レコード光が520nmのフラ-2ダイクロイックミラーによってフィルタリングされた蛍光カメラ、と5-10秒で放出されます。 </li><li>記録期間が終了すると、完全な配列のOを格納Fの画像は、さらなる分析のためにコンピュータ520 nmで放出されました。 </li></ol></li><li>記録された蛍光画像の解析。 <ol><li>実験ファイルを開きます。 AQUACOSMOSソフトウェアを使用して、「比率」をクリックして、所望の比率の範囲を選択します。比率画像のシーケンスを取得するために、得られた画像内の画素比率によってピクセルを計算します。 </li><li> 「背景除去」を調整することにより、バックグラウンドを減算します。プレス「スタート計算」。 </li><li>プレス「常にシーケンス」ボタンおよび利息（ROIを）の古代の領域を消去します。個々の細胞の定量的分析のために、個々のニューロンに対応する興味やROIの新しい領域を確立します。各ROIと各画像に対応する各画素の平均全比の値は、個々のROI（セル）用の比率の蛍光値の記録を取得します。 </li><li>グラフのprogrに各ROIに対応する比率の蛍光値をエクスポート個々の録画をグラフ化するには午前。 </li><li>適切なデータ分析やグラフ作成ソフトウェアを使用して、各刺激に応答して蛍光比の上昇の大きさを推定するために、対応する計算を行います。 </li></ol></li></ol>ミトコンドリアのCa 2+濃度の3生物発光イメージング<ol><li> mitGAmutプラスミドと培養海馬神経細胞のトランスフェクション。 注：細胞は、まず、ミトコンドリア標的化配列および緑色蛍光タンパク質（GFP）に融合した Ca 2+結合部位を欠く突然変異したエクオリンを含むmitGAmutプラスミドでトランスフェクトされています。この構造は、ミトコンドリアのCa 2+取り込みの大きな上昇を検出し、GFP蛍光によってトランスフェクトされた細胞の同定を可能にします。プラスミドが開発され、親切P.Brûletおよび共同研究者18（CNRS、パリ、フランス）から提供されました。 <ol><li>ウシ胎児血清を欠いている、神経基礎培養培地を含む、神経基本TFを準備し、B27、gentamicおよび2mM L-グルタミン。 </li><li>神経基礎TF50μlのプラスバイアル（溶液A）で2.5μlのトランスフェクション試薬を準備します。 50神経基本TFμlのプラス4μgのバイアル中mitGAmutプラスミド（溶液B）を用意します。振盪せず、20分の間に混合できるように溶液Aの上に静かにB液を追加します。 </li><li>新鮮な神経基礎TFの200μLを含む新しいmultidishプレートに海馬ニューロンを含むカバースリップを転送します。 </li><li>すべてのカバーガラスの上にドロップすることにより溶液A + B100μlのドロップを追加します。 30分間インキュベートします。メディアを削除します。新鮮な神経基本TFとの細胞1回洗浄。元の神経基礎培養培地にカバースリップを返します。 </li><li>効率的な発現およびプローブの標的を可能にするために、トランスフェクション後37ºC、5％CO 2でさらに24時間培養ニューロン。 </li></ol></li><li>生物発光イメージングのための試験溶液を調製します。 <ol><li> NMDA100μMのまたは145mMのKClを含むHBS溶液を調製します（ステップ2.1）上記。 10 mMのカルシウムを含む2+プラス100μMをジギトニンHBS溶液を調製します。 </li></ol></li><li>セレンテラジンnのミトコンドリアを標的とエクオリンの再構成。 <ol><li> HBSの200μLを含む4ウェルプレートにトランスフェクトされた海馬ニューロンを含むトランスファーカバースリップ。 </li><li> 4μMの最終濃度のために、HBSの200μlにセレンテラジン4μlのn個（200μm）を加え、穏やかに混合。 RT（25ºC）で2時間、暗所でインキュベートします。 </li></ol></li><li>ミトコンドリアの記録生物発光画像の[Ca 2+]。 <ol><li>顕微鏡、ランプ、灌流系、生物発光カメラとコンピュータの電源を入れます。 </li><li>サーモスタット（37ºC）灌流チャンバーに再構成カバースリップを転送し、5〜10ミリリットル/分の速度で予め温めHBS溶液で連続的に灌流。 </li><li>対物レンズ40倍（油、NA：1.3）を使用して、Aを発現する細胞を含む顕微鏡視野を選択FITCフィルターを用いて緑色蛍光タンパク質（GFP）の発現と関連した蛍光発光によって示されるようにpoaequorins。典型的なフィールドは、1-2トランスフェクトされた細胞を含有してもよいです。 CCDカメラを用いて、GFPの蛍光画像を取り込みます。 </li><li>顕微鏡光をオフにします。光の経路に位置するダイクロイック含有ボックスを削除します。励起光をオフにして、完全な暗闇のための暗ボックスを閉じます。 </li><li>とやテスト・ソリューションは、37ºCで事前に温めなしHBS培地5-10 ml /分で細胞を灌流。 </li><li>画像処理装置で処理光子計数カメラとフォトニック放出画像ごとに10秒をキャプチャします。 </li><li>各実験の最後に、残りのすべての光放射を放出するために、HBS中10mMでジギトニン0.1mMのCaCl 2で細胞を透過性。 注：これらのフォトニック排出量は総排出量のフォトニック、のCa 2+濃度の校正のために必要な値を推定するために加算されなければなりません&lt;。/ LI&gt; <li> GFP関連蛍光画像とコンピ​​ュータに保管して生物発光画像は、フォトンカウンティングイメージングの前に捕獲しました。 </li></ol></li><li>ミトコンドリアの[Ca 2+]を反映した生物発光画像の解析。 <ol><li>特定のソフトウェアを使用して、フォトニック排出量を定量化します。光子放出はBriniらによって記載されたアルゴリズムを使用して、ミトコンドリアの遊離Ca 2+濃度 （の[Ca 2+] MIT）に変換することができる。15。 </li><li>実験およびGFP蛍光画像を開きます。実験の開始時に取り込まれた蛍光画像に応じてトランスフェクトされた細胞の形状を描くことで、特定のソフトウェアの助けを借りて、興味（ROIを）の領域を選択します。 </li><li>すべての画像に同じのROIを貼り付けます。各ROIの総光子放出は、各時点で各セルの蛍光発光値（L）を得るために特定のソフトウェアを用いて計算されます。 </li><li>すべてのフォトニックemissを追加すべての光子放出を含む生物発光画像を得るために、特定のソフトウェアを使用して、透過性をジギトニン後に得られたものを含む生物発光画像中のイオン。 </li><li>計算のための特定のソフトウェアへの関心のあらゆる地域のためのフォトニック排出量の書き出し値。これを行うには、各時点でのすべてのROIのための生物発光値を計算するために、「グラフ」をクリックします。 「合計値」を選択し、「すべての画像に現在のROIを使用しています。押して、「計算します」。ワークシートに「txt.file &#39;とエクスポートデータを保存します。すべてのROIのために、の[Ca 2+] MITは、次のアルゴリズムを使用して計算されます。 [Ca 2+]（M）= [R +（R・K TR） - 1] / [K R - （R・K R）]; ここで、 R = [L /（L トータル λ）] 1 / N Lは、関心のある各領域の測定時に放出された発光です。 Lの合計があります各関心領域について測定時にその時点での組織中に存在する数を加えた後、残りのトータル発光。 λ、K TR、K Rおよびnは、値がエクオリン（野生型または変異）とcoelenterazin使用（野生型またはN型）だけでなく、記録温度16の組み合わせに依存する定数です。ここで使用される組み合わせについては37ºCで、（AEQとcoelenterzine nを変異させ）、我々は次の値を使用：K R = 8.47×10 7、K TR = 165.6×10 3を 、nは1204、λ= 0138 =。 </li></ol></li><li>適切なデータ分析を使用して、各刺激に応答して生物発光の上昇の大きさを推定し、ソフトウェアをグラフための対応する計算を行います。 </li></ol>

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どの著者も、競合する利益や相反する利益を持っていません。

細胞内Ca 2+の改造老化脳内の恒常性は、認知喪失に関係しているが、虚血性損傷、興奮毒性および神経変性に対する感受性を増加させました。 in vitroでこの仮説を調べるために、のCa 2+イメージング手順が用意されています。残念ながら、古い海馬ニューロンの生存可能な培養物は、信頼性がありません。最近では、ROSの蓄積、リポフスチン顆粒の形成、ヘテロ病巣、pJNKおよびp53 / p21の経路の活性化は、コレステロールの損失を含むインビボでの老化の典型的な特徴の存在ラット海馬神経細胞の長期培養が多く観察されており、そしてCa 2+チャネルの密度を変化させ、NMDA受容体は、14。したがって、ラット海馬ニューロンの若者と古い文化におけるCa 2+イメージング実験は、老化脳におけるCa 2+リモデリングの新たな洞察を提供することができます。培養hippocaのために重要である条件長期的にMPALニューロンは2倍です。まず、上記のように、非常に低密度で細胞をプレートすることが重...

興奮毒性は、虚血などの神経学的傷害であり、例えば、アルツハイマー病の1などのいくつかの神経変性疾患における神経損傷および細胞死に寄与する最も重要な機構の1つです。神経毒性のこのタイプは、主にカルシウムに作用するグルタメートにより媒介される2+ -permeable、イオンチャネル型NMDA受容体（NMDAR）2。グルタミン酸への培養神経細胞の曝露は、神経細胞のアポトーシス4を引き起こす興奮毒性3、につながることができます。我々と他の人は、以前、NMDA誘導性アポトーシスに対するニューロンの脆弱性は、in vitroでの開発と5-8の加齢に変更される可能性があることを報告しています。 これは、広く細胞質ゾルのフリーCa 2+濃度（の[Ca 2+] CYT）の増加は、細胞の活性化につながることが認められています。この上昇は高すぎ、および/ ​​または十分に持続する場合には、それは細胞死9をトリガすることができます。また、提案されていますその興奮毒性は、ミトコンドリアのCa 2+取り込み10、グルタミン酸誘発細胞死11に対するミトコンドリア脱共役保護ニューロンとニューロンの治療以降が必要です。ミトコンドリアはあまりにも多くのCa 2+を取る場合は、ミトコンドリア膜透過性遷移孔の開口部は、シトクロムcおよび他のプロアポトーシス因子の放出、およびアポトーシスを誘導につながる、発生することがあります。私たちは最近、このミトコンドリアのCa 2+取り込みを直接直接単一海馬ニューロン5におけるNMDA誘発性のミトコンドリアのCa 2+取り込み、この記事で報告されているメソッドを測定することにより、興奮毒性の年齢依存性の感受性に関連していることが示されています。このような学習、記憶およびその他の認知プロセス12のような生理学的プロセスに関与する海馬は、加齢と神経変性疾患13に対して非常に脆弱です。これは、 インビトロで数週間後、ことが提案されている、培養海馬ニューロンは、高齢者のニューロン14の典型的な特徴の数を示します。したがって、長期培養海馬神経細胞は老化で強化された興奮毒性のの Ca 2+媒介メカニズムを調査するための包括的なモデルを提供することができます。 提示された方法の全体的な目的は、長期培養海馬ニューロンにおけるNMDA受容体アゴニストによって誘発される差動の Ca 2+応答を含む老化脳における細胞内Ca 2+ホメオスタシス又はCa 2+リモデリングの実質的な変化を調査することです。この方法は、それぞれ、ラット海馬ニューロンの培養物の詳細な説明及び個々のニューロンにおける蛍光および生物発光イメージングによる細胞質ゾルおよびミトコンドリアの Ca 2+濃度のモニタリングを含みます。培養神経細胞における細胞質ゾルのCa 2+の蛍光イメージングは、標準的な手順です。しかし、この方法は、サブのための信頼性が低いですミトコンドリアのCa 2+を含む細胞のCa 2+測定。この理由も、mMのレベルに低μMレベルからミトコンドリアで変更される可能性のCa 2+濃度のための合成プローブの適切な標的と不適切な親和性の欠如を含みます。インスタンスエクオリンのようなタンパク質に基づいたCa 2+プローブの使用は、細胞内小器官への標的化し、特定のCa 2+結合部位15を欠く異なるセレンテラジンまたは変異プローブを用いて、異なる誘導体のCa 2+親和性の使用を許可されています。このように、ミトコンドリア標的エクオリンを発現する細胞の生物発光イメージングは、個々の神経細胞におけるミトコンドリアの Ca 2+濃度のモニタリングを可能にすることができます。しかし、この手順では、生物発光イメージングのために16-18光子計数カメラや超CCDカメラの使用を必要とするかもしれません。この方法は、よりestablに確認すべきである小説の結果を得ることが脳の老化のモデルは古い動物から、例えば、脳スライス、としてished。

<table><tbody><tr><td>神経基礎培養培地</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>HBSS 培地</td><td>Gibco</td><td>14170-088</td><td></td></tr><tr><td>ハム F-12 培地</td><td>Gibco</td><td>31330-038</td><td></td></tr><tr><td>DNase I (牛膵臓由来)</td> <td>Sigma</td><td>D5025-15KU</td><td></td></tr><tr><td>胎児ボビン血清</td><td>ロンザ</td><td>DE14-801E</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Gibco</td><td>15750</td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン</td><td>Gibco</td><td>25030-032</td><td></td></tr><tr><td>12 mm ガラス カバースリップ</td><td>Labolan</td><td>0111520/20012</td><td></td></tr><tr><td>Papain</td><td>Worthington</td><td>LS003127</td><td></td></tr><tr><td>4 ウェル マルチディッシュ プラーク</td><td>Nunc</td><td>176740</td><td></td></tr><tr><td>ペトリー料理</td><td>JD Catalan s.l.</td><td>2120044T</td><td></td></tr><tr><td>滅菌ピペット</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>431030</td><td></td></tr><tr><td>Fura2-AM</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ F1201</td><td></td></tr><tr><td>リポフェクタミン2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-027</td><td></td></tr><tr><td>セレンテラジン n</td><td>ビオチウム</td><td>BT-10115-2250 uG</td><td></td></tr><tr><td>ジジトニン</td><td>シグマ</td><td>D5628</td><td></td></tr><tr><td>NMDA</td><td>シグマ&nbsp;</td><td>M3262</td><td></td></tr><tr><td>グリシン</td><td>Σ</td><td>50046</td><td></td></tr><tr><td>ツァイス アクシオーバー S100 テレビ顕微鏡</td><td>カールツァイス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xcite照明システム</td>、<td>EXFO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ORCA ER蛍光カメラ</td>、<td>浜松</td><td></td><td></td></tr><tr><td>VIM、フォトンカウンティングCCDカメラ</td>、<td>浜松VC-8</td><td></td><td></td></tr><tr><td>、バルブコントローラー</td><td>、ワーナーインスツルメンツ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>、SH-27B、暖房システム&nbsp;</td><td>ワーナーインスツルメンツ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>アクアコスモスソフトウェア</td><td>浜松ホトニクス</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

細胞内のcaの蛍光と生物発光イメージング<sup&gt; 2+</sup&gt;高齢者における海馬ニューロン

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

神経変性および虚血に関連する神経細胞死に対する感受性は非常に高齢の脳で増加しているが、原因となるメカニズムはひどく知られています。興奮毒性、両方の傷害により誘発されるニューロン損傷に寄与すると考えプロセスは、 の Ca 2+流入およびミトコンドリアの Ca 2+過負荷を促進するグルタミン酸受容体の活性化によって媒介されます。 細胞内Ca 2+恒常性の細胞内Ca 2+ホメオスタシスや改造の実質的な変化は、古いニューロンにおけるニューロン損傷を好むことがあります。老化中のCa 2+リモデリングを調査するために、我々 は 、in vivoでの神経細胞を老化させ、いくつかの態様で似ているラット海馬神経細胞の長期培養でのライブセルイメージングを使用しています。このために、海馬の細胞は、最初の場所で、新鮮に生まれたばかりのラットの海馬から分散され、ポーリ-D-リジンコーティングされ、カバーガラス上にプレーティングしました。その後、培養物は数日または数ワットのために制御されるメディアに保管されていますそれぞれ、老若男女ニューロンを調査するためeeks。第二に、培養されたニューロンはFURA2にロードされ、デジタル蛍光比イメージングを使用して、細胞質ゾルCa 2+濃度の測定を行っています。第三に、培養神経細胞は、ミトコンドリアを標的とする低親和性エクオリンとGFPのタンデムを発現するプラスミドでトランスフェクトされます。 24時間後、細胞内でエクオリンはセレンテラジンを用いて再構成され、神経細胞は、ミトコンドリアのCa 2+濃度を監視するための生物発光イメージングに供します。この3段階の手順としては、例えば、細胞質ゾル、関連刺激に対するミトコンドリアのCa 2+応答のモニタリングを可能にするグルタミン酸受容体アゴニストNMDAこれら及び他の応答は、加齢によって影響を受けるかどうかを比較します。この手順では、どのように影響を与える細胞質とミトコンドリアのCa 2+選択刺激に対する応答だけでなく、神経細胞を防止することを目的とし選択される薬剤のエージング試験のように、新しい洞察をもたらすことができます加齢関連疾患で死亡。

ここでは、高齢者の神経細胞での[Ca 2+]のCa 2+改造および細胞質とミトコンドリアのNMDAの効果を評価するための簡単な方法を説明する。 図1は、新生ラット海馬神経細胞の単離および培養するための手順の概略を示しています。開始する前に、我々は、無菌の、ポリ-D-リジンコート、カバーガラスを準備し、4ウェルディッシュでそれらを検索する必要があります。その後、新生児ラットを殺し、脳を摘出しています。海馬を単離した後、組織を注意深くパパインを用いて分散されています。単離された細胞を洗浄し、コーティングしたカバースリップ上にプレーティングします。その後、細胞は、それぞれ2-5 DIVや若者や高齢者の文化を取得するには&gt; 15 DIV、培養され、およびCa 2+イメージング実験のために使用されます。 上記の戦略を使用して、若いcultu中の[Ca 2+] NMDAはサイトゾルに異なる効果を誘導するかどうか、例えば、テストするための同じ試料から老若男女ニューロンを...

老化における細胞内Ca2+リモデリングは、老化におけるCa2+オーバーロードによって媒介されるプロセスである興奮毒性とニューロン損傷に寄与する可能性があります。私たちは、神経細胞の老化モデルであるラット海馬ニューロンの長期培養における細胞質およびミトコンドリアのCa2+の蛍光および生物発光イメージングを用いて、老化脳におけるCa2+リモデリングの検討を目指しました。

細胞内のCaの蛍光と生物発光イメージング<sup&gt; 2+</sup&gt;高齢者における海馬ニューロン

Susceptibility to neuron cell death associated to neurodegeneration and ischemia are exceedingly increased in the aged brain but mechanisms responsible ...

この手順の全体的な目的は、神経老化のモデルとされるflat海馬ニューロンの長期培養において、細胞質およびミトコンドリアのカルシウムを蛍光および生物発光イメージングで観察し、老化脳におけるカルシウムリモデリングを調査することです。この手法は、細胞内カルシウムのリモデリングが、いずれもカルシウム過負荷に関連する興奮毒性やニューロン損傷にどのように寄与するかといった、老化分野における重要な疑問の解明に役立ちます。本手法の主な利点は、同一検体から得られた異なるDYS（Days In Vitro）の培養細胞を用いることで、個々のニューロンにおけるカルシウムリモデリングを詳細に追跡できる点にあります。この技術を応用することで、脳卒中や細胞変性疾患などの治療法やアプローチを検討でき、これらの加齢関連疾患におけるカルシウム過負荷に関連した新たな標的を探索することが可能です。このビデオを視聴後、ラット海馬ニューロンの短期および長期培養における、細胞質およびミトコンドリアのカルシウムの蛍光およびレミネセンスイメージングの実施方法について十分に理解することができます。この手順を開始するには、ペトリ皿の中のパラフィルムの上にカバーガラスを並べます。次に、各カバーガラスに1 mg/mLのポリD-リシンを200 µL塗布し、一晩処理します。翌日、滅菌条件下で、2回蒸留滅菌水を用いてカバーガラスを15分おきに90分間洗浄します。カバーガラスをマルチウェルプレートに入れ、使用するまで37°C、5% CO2の加湿インキュベーター内で保持します。海馬ニューロンを単離するために、滅菌済みハサミで新生ラットの頭蓋骨を開き、スパチュラで脳を摘出し、Ham's F 12培地で速やかに洗浄します。次に、メスで各半球に斜めに切り込みを入れ、顕微鏡下でhams F 12培地を含むペトリ皿に転移させます。髄膜は除去してください。皮質上の特徴的な凹みにある海馬を慎重に確認します。次に、眼科用鋏を用いて慎重に引き離し、海馬を皮質から分離します。その後、海馬の断片を1.8 millilitersのろ過済みペパネ溶液が入ったバイアルに移します。時折穏やかに振盪しながら、37 degrees Celsiusで15分間インキュベートします。次に、DNA溶液を90 µL加えます。50 µg/mLを添加し、さらに15分間インキュベートします。その後、組織を10 mL遠心チューブに移し、新鮮なNeurobasal培地で断片を洗浄します。組織片を5 mLのプラスチック製ピペットに通し、細胞懸濁液を得ます。次に、細胞懸濁液を160 Gで5分間遠心分離します。その後、滅菌プラスチック製パステールピペットを用いて上清を除去し、1 mLオートメーションピペットを用いて、ペレットを1 mLのNeurobasal培地で慎重に懸濁させます。次に、Neubauer計数盤を用いて細胞密度を測定します。細胞懸濁液を10 µL添加し、顕微鏡下で細胞数をカウントします。その後、適切な計算を行い、約30,000個の細胞を含む細胞懸濁液を40～80 µL分取します。500 µLの神経基底培地を含む4ウェルプレートの、ガラスカバースリップが入った各ウェルに、約30,000個の細胞を播種します。若年ニューロンの場合はin vitroで2〜5日間、高齢ニューロンの場合はin vitroで15日以上、インキュベーター内で培養します。この手順では、細胞をfewer 2:00 AMとともに室温・暗所で60分間インキュベートします。その後、カバーガラスを灌流チャンバーに移します。次に、カバーガラスを入れた灌流チャンバーを倒立顕微鏡のホルダーに設置します。観察視野を選択し、あらかじめ温めておいたHBSで細胞を連続的に灌流します。続いて、細胞を340および380ナノメートルでエピ照明します。次に、ダイクロイックミラーでフィルタリングした蛍光カメラを用いて、520ナノメートルで放出される光を5〜10秒ごとに交互に記録します。記録した蛍光画像を解析するには、まずAqua Cosmosソフトウェアを使用して実験ファイルを開き、「ratio」をクリックして、希望する比率範囲を選択します。得られた画像においてピクセルごとの比率を算出し、比率画像のシーケンスを作成します。次に、背景除去ボタンを調整して背景を差し引きます。その後、「計算開始（start calculation）」を押してください。次に、「all time sequence」ボタンを押し、個々の細胞の定量分析のために以前のROIを消去します。新しいROI、または個々のニューロンに対応するROIを設定してください。個別の記録をグラフ化するには、「graph」をクリックして、各ROIに対応する蛍光比値をOrigin labプログラムにエクスポートします。次に、「calculate（計算）」をクリックし、TXTファイルを保存します。その後、MIT変異型プラスミドを培養ニューロンに導入し、各刺激に応答した蛍光比の上昇幅を推定するための対応する計算を行います。まず、バイアルにトランスフェクション試薬を含む溶液Aを50 µL準備します。次に、MIT uteプラスミドを含む溶液Bを50 µL、バイアルに用意します。溶液Bを溶液Aに加え、20分間インキュベートします。その後、海馬ニューロンを含むカバーガラスを、200 µLの新鮮なneuro basal TFを含む新しいマルチディッシュに移します。次に、溶液AとBを各カバーガラスの上に100 µLずつ滴下し、30分間インキュベートします。30分後、培地を除去します。新鮮なneuro basal tfで細胞を洗浄します。その後、カバーガラスを元のneuro basal培養培地に戻し、プローブの効率的な発現と標的化を促すため、トランスフェクション後24時間培養します。次に、4 µMの最終濃度にするため、200 µLのHBSに4 µLのシーラントTEREZIN Nを加えます。穏やかに混合し、室温の暗所で2時間インキュベートします。2時間後、カバースリップを灌流チャンバーに移し、あらかじめ加温したHBS溶液で連続的に灌流します。ミトコンドリアカルシウム濃度のバイオルミネッセンス画像を記録するために、蛍光放出によって示されるAPO corinを発現している細胞を含む顕微鏡視野を選択します。次に、顕微鏡の照明を切ります。光路にあるダイクロイックミラーを含むボックスを取り除きます。次に、励起光を消灯し、ダークボックスを閉じて完全に遮光します。37 °Cに予熱した試験溶液を含む、または含まないHBS培地で細胞を灌流します。その後、画像処理装置で制御されるフォトンカウンティングカメラを用いて、10秒ごとに光放出画像をキャプチャします。次に、残りのすべてのフォトンの放出を促すため、digitoinを添加します。ミトコンドリアカルシウムを反映する生物発光画像を解析します。GFP蛍光画像を開きます。形質導入された細胞の周囲を囲むように描画し、個々のROIを選択します。次に、シークエンスのすべての画像に同じROIをコピーして貼り付けます。スクリーンキャプチャ。その後、各ROIの光子放出値を計算用の専用ソフトウェアにエクスポートし、グラフをクリックします。すべてのROIの値を算出するために、「total value」を選択し、「current ROI to all images」を適用します。続いて、「calculate」を押し、テキストファイルを保存してデータをエクスポートします。次に、提示された各刺激に応答したミトコンドリアカルシウム上昇量の推定に必要な計算を行います。以下は、100 $\mu$M MDAで刺激する前後の海馬ニューロンの短期培養および長期培養における代表的な明視野像および擬似カラー像である。暖かい色は細胞質カルシウム濃度の低下を示している。これらのトレースは、海馬ニューロンの短期培養および長期培養において、100 $\mu$M MDAに反応した細胞質カルシウム濃度の代表的な単一細胞記録を示している。細胞質カルシウム濃度の増加は、短期培養ニューロンよりも長期培養ニューロンにおいて大幅に大きいことに留意されたい。本実験では、培養海馬ニューロンに、GFPを融合させた低親和性ミトコンドリア標的型korinを導入し、4 µMの密封剤terezinでインキュベートした後、ミトコンドリア内カルシウム濃度の生物発光イメージングを行いました。ここでは、短期および長期培養海馬ニューロンにおける、ミトコンドリア内カルシウムを反映した光放出の放出を示す記録を提示します。この手順に従った結果、100 µMのMDAは、若年培養海馬ニューロンでは認められませんでしたが、老化ニューロンにおいてミトコンドリア内カルシウム濃度を上昇させました。fair left assessmentなどの他の手法を、同一細胞内での蛍光および生物発光イメージングと組み合わせることで、ニューロン細胞への感受性、老化に伴う神経変性、および虚血といった追加の疑問を明らかにすることが可能です。

fluorescence-bioluminescence-imaging-subcellular-ca2-aged-hippocampal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

このプロトコルでは、カルシウムイメージングの最近の進捗状況を更新...

視床下部マウス脳スライスのGFPタグニューロンにおけるイメージングカルシウム応答

出典:Ulivi, A. F., et.al.Longitudinal Two-Photon Imaging of Dorsal Hippocampal CA1 in Live Mice. J. Vis. Exp. (2019) }このビデオは、生きたマウスの蛍光標識されたピラミッド型ニューロンの縦方向の2光子イメージングを示しています。...

生きたマウス海馬における蛍光標識ニューロンの縦断的2光子イメージング

出典:カルボ・ロドリゲス、他.老化した海馬ニューロンにおける細胞内Ca2+の蛍光および生物発光イメージング。 J. Vis. Exp. (2015).

短期および長期ラット海馬培養におけるin vitroカルシウムイメージング

出典:Krishnamurthy, K. et al. 筋萎縮性側索硬化症のモデルにおけるシナプス機能のリアルタイム蛍光測定。J. Vis. Exp.

筋萎縮性側索硬化症のIn Vitroモデルにおけるシナプスカルシウムダイナミクスの蛍光イメージング

出典:Kamei, R., et al.、マウス海馬におけるミクログリアのIn vivo慢性二光子イメージング。J. Vis. 経験。(2022年)このビデオは、海馬CA1(Cornu ammonis 1)と歯状回におけるミクログリアダイナミクスのin...

マウス海馬におけるミクログリアダイナミクスのin vivo二光子イメージング

ここでは、生物発光レポーターを使用してアプローチを-imaging小説のCa 2+を提示します。このアプローチは、Ca 2+に結合し、励起光の必要性を排除し、光を発する融合構築物のGFPエクオリンを使用しています。重要なことは、この方法は、長い連続撮影、脳深部構造へのアクセス、高時間分解能を可能にします。...

生物発光カルシウムインジケーター、GFPエクオリンに基づいて生体内脳機能イメージングのアプローチで

全細胞のホールセルパッチク ランプ記録と急性脳スライスにおける神経樹状突起における Ca2 +過渡現象を記録する 2...

脳スライスにおける神経樹状突起における 2 光子カルシウム イメージング

この方法は、生きているマウスの海馬への光学的アクセスを可能にする慢性的な調製を記述する。この調製は、数週間の期間にわたって神経構造可塑性および活性誘発細胞可塑性の縦方向光学イメージングを行うために使用することができる。...

生きたマウスにおける後部海馬CA1の縦方向2光子イメージング

シナプス伝達に必要な細胞内事象を視覚化するために、2つの関連する方法が記載されている。これらのプロトコルは、 in vitro...

筋萎縮性側索硬化症のモデルにおけるシナプス機能のリアルタイム蛍光測定

本稿では、精密制御手術と二光子顕微鏡を用いて、マウス海馬CA1の静止ミクログリアをin vivo...

インビボ マウス海馬におけるミクログリアの慢性二光子イメージング

現在の方法は、容易に入手可能な遺伝的にコードされたカルシウム指標を使用して、カエノラブディティスエレガンスのin...

in vivoでの神経細胞カルシウムハンドリングの細胞内イメージング

学ぶ蛍光・生物発光イメージングを用いたラット海馬ニューロンの細胞質・ミトコンドリアカルシウム動態解析。老化におけるカルシウムリモデリングと興奮毒性のメカニズムを解明し、神経変性疾患治療標的の発見に貢献します。

細胞内のCaの蛍光と生物発光イメージング

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