Name: 脳の外植片にレーザー誘導神経トレース (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 40 s
Description: 学ぶレーザー誘導神経トレース法でマウス脳外植片のニューロンと軸索投射を標識し、脳核間の結合パターンと機能的意義を解明する。基本光学機器と蛍光標識マウスを用いて標的精度を向上させ、非侵襲的遺伝子型判定も可能にする神経回路研究手法である。

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NIH / NIDCD R01 DCでサポートされている011582.イメージング実験は大学で行ったのコロラドアンシュッツメディカルキャンパス高度な光学顕微鏡コアはNIH / NCRRコロラドCTSIグラント番号UL1 RR025780とロッキーマウンテンNeurlogical障害コアセンター助成NIH P30NS048154によって部分的にサポートされています。ソーク研究所から博士サシャ・デュ・ラックはGLYT2-GFPマウスを提供してくれました。

1.オプティカルジェノタイピングマウス子犬の1光学ジェノタイピング<ol><li>適切な励起波長のレーザポインタを使用してそれぞれの蛍光マーカーの発現を確認する（ここで説明した実験で405 nm）で励起波長を遮断するフィルタ眼鏡を対応するが、発光波長を通過させる（450 - ここで説明した実験で700 nm）の。ヘッドやマウスの仔の脊髄の背面にレーザーポインターを点（ 図1を参照）。目とレーザー光に対する皮膚の長い露出にレーザーを照射しないでください。 </li></ol>古い動物の2光ジェノタイピング<ol><li>深く腹腔内注射（120ミリグラム/ kg体重）を介して、ペントバルビタールの過剰摂取と（ここで説明した実験ではP138歳P14）は、マウスを麻酔。動物の反射神経をチェックして、適切な麻酔を確認してください（簡単番目の先端をつまみます電子耳や耳や足の後退反射を誘発するための後ろ足の1つ）。 </li><li>注意：動物はまだ理想的に生きているので、ペントバルビタールの過剰摂取の使用にもかかわらず（120ミリグラム/ kg体重）我々は、代わりに安楽死の「深麻酔」と注射手順を参照してください（ すなわち 、その心臓はまだ鼓動している）、時手術と灌流が開始されます。これは、脳を含む内臓のより効率的な灌流を保証します。 </li><li>動物は任意の反射を示していないならば、慎重に頭の後ろをカバーする皮膚の切開を作り、頭蓋骨の中央部に切断することにより頭蓋骨（ 図2A）を覆う皮膚を削除します。レーザー光に覆われていない頭蓋骨を露出させ、上記のようにフィルターゴーグルを通して蛍光を観察します。 GFP陽性シグナルが観察された場合、（第2 /私たちの次の安楽死の形を確保断頭を通じて動物を犠牲にし、いない場合は、ステップ2に進んでくださいIACUC規制）。 </li></ol>注：さらに古いマウスでは（&gt; 1ヶ月）の蛍光は、動物の目を通して観察することができます。 2. Transcardial灌流と脳の準備<ol><li>大部分から血液を除去するために、30gの注射針を使用して、氷冷リン酸緩衝食塩水（10mMの137 mMの、塩化カリウム：2.7ミリモル、KH 2 PO 4：1.76ミリモル、のNa 2 HPO 4のNaCl PBS）で経潅流動物。 <ol><li>まず、慎重に鋭いハサミで胸郭を開き、心臓の左心室に針を押し込みます。心臓や大動脈にPBSをポンプ起動し、すぐにこのステップが身体を終了し、血液を可能にするために、はさみで心臓の右心房を開き、次の。注：灌流5かかり - 動物のサイズに応じて10分。 </li></ol></li><li>灌流を介して放血した後、動物を刎ねる、ピンnにその頭を固定eedles（または30のG注射針）準備皿に目のソケットを介してそれらを貫通し、頭蓋骨から脳を削除することもできます。 <ol><li>ちょうど尾側動物の眼の側面にカットし、頭部の背側の正中線に沿って切断し、頭の後ろに小さな切開を行います。まず、頭蓋骨を重ねる肌を遮断するために、鋭いハサミを使用最後に、完全に頭の後ろの皮膚のフラップを除去するために、尾方向に切断。 </li><li>次に、頭蓋骨自体の同じカッティングパターンを繰り返し、これはかなり最終的に脳幹の除去を簡素化しますので、その過程で両方の蝸牛を取り外してください。この手順の後、脳の尾半分が完全に露出あるべきです。 </li><li>次のステップでは、小脳から約45°〜約2mmの吻側の角度で全前脳を切断するために鋭利なカミソリの刃またはメスを使用しています。 ABと脳の分離前半をかき出しますENTへら。 </li><li>その吻側端に脳の尾半分を高め、その後、まだ腹側脳幹に接続されている脳神経を切断するために、スパチュラを使用します。最終結果として、脳幹を含む脳の尾の半分は、準備された動物の頭の残りの部分から自由落下する必要があります。 </li><li> （ステップを参照してくださいその腹側を露出するために、脳の除去された尾の半分を反転し、台形体を含む腹側に位置する「電球」の（逆行注射用）ちょうど吻側（順行注射用）またはちょうど尾側前頭面に沿って切断2.3）。 <ol><li>常に組織に過度の機械的ストレスによる細胞死を最小限にするために切断手順のために鋭利なカミソリの刃またはメスを使用しています。最終結果として、長さが約1cmにまたがるし、他の脳領域に沿って完全な上オリーブ複合体を含む脳の外植が得られているはずです。 </li></ol></li></ol> &lt;/ LI&gt; </ol>注：このプロトコルは、聴性脳幹に位置台形本体内にトレーサーを注入するための手順を示しています。必要に応じて、切断面と注射部位の位置と向きを調整します。それらが同定され、脳を切断せずに注入することができるように、脳表面に十分に近い関心嘘の蛍光脳領域（ 図2Bを参照）場合、冠状切断工程を省略することができます。 <ol start="3"><li>台形体（VNTB）の腹側核を含む二腹目立つ「球根」と台形体を識別します。 </li></ol>注：これらの切断面のおおよその定位位置に関する更なる解剖学的参考のため、フランクリン＆Paxinos、2008年アトラスのパネル78、ブレグマ〜-5.7 mmは台形体（= MNTB）の内側核を示しているを参照してくださいTzを」と表示&quot;。パネル69は、台形BOの腹側核を示しています「MVPO」（medioventral periolivary核）19としてラベルDY（VNTB）。 3.順行/逆行トレース注：RT（25℃）で、次のすべての手順を実行します。 <ol><li> 125 mMの、のKCl：2.5mMの、のMgCl 2を1mM、のCaCl 2：0.1mMのグルコース切断した後、酸素（95％O 2、5％CO 2）解剖溶液（NaClを含む製剤皿に脳幹の外植片を配置：25mMの、のNaH 2 PO 4：1.25ミリモル、のNaHCO 3、25mMのアスコルビン酸：0.4 mMの、ミオイノシトール：3mMの、ピルビン酸：2mm）を、30gの注射針とそれを固定します。注射の面積が上を向いていることを確認します。 </li><li>ホウケイ酸ガラスから注入ピペットを引き、次の三つの解決策の一つでそれらを埋める：コレラトキシンサブユニットB PBS 12-13でアレクサフルオロフォア555に共役（主に逆行性輸送に使用される）、BのA）1.0 mg / mlのソリューション）1％-d万MWのデキストランTRITC 555の0.9％生理食塩水でのデキストラン（主に逆行性輸送に使用される3000メガワット）テトラメチルローダミン555またはc）1％-dilutionの0.9％生理食塩水でilution（主に）順行輸送に使用されます。 <ol><li> 4引っ張っサイクル - その注入ピペットの抵抗が2.5から3.5オームの範囲であり、それらが3で製造されていることを確認してください。ここに記載される実験のために、予めプログラムされたピペットプラー上でアルゴリズムを引っ張るを選択することによって、これを達成します。 </li></ol></li><li>適切な波長（;ここで説明した実験では、波長405nm、図3Aの項目番号2）の静的に取り付けられたレーザーポインタを使用して、脳の外植片を照らします。注射のためのガイドとしてのレーザーポインタを使用し、注入される蛍光標識された脳核または目的の細胞にレーザー光を目指しています。 </li><li> 70 - 互換性のあるフィルターゴーグル（450を装着したまま検索し、双眼顕微鏡を通して照射ターゲット領域を観察ここに記載した実験において0nmのバンドパスフィルタ）。関心領域にマイクロマニピュレーターを経由して注入電極を挿入します。 </li><li>トレーサー物質を注入します。脳切片内の関心領域（ROI）内に垂直に向け圧力噴射装置を用いて、50ミリ秒ごとに、15 psiで10圧力パルス - 注射は2から成ります。拡散する染料を可能にするために15秒 - 10の間隔で各圧力パルスを管理します。 </li><li>テトラメチルローダミン（TRITC）注射剤の場合には、付加的に（ここで記載した実験でMNTBとVNTB）関心のある脳領域に配置された電極をエレクトロポレーションを介して色素の取り込みを増強するために、電気的に刺激します。 <ol><li> 50ミリ秒パルス間の間隔で50ミリ秒、刺激によって駆動され、刺激分離ユニット（項目7号及び図3Bの 9）で55 Vに増幅するために8ボルトの8 TTLパルスを使用してください。このプロトコルの20回繰り返し、adminis - 10を使用してください数分7,8を介して結。適切に電極を接地していることを確認します - アース線は、浴溶液に接続する必要があります！ </li></ol></li><li>注射の成功のために確認してください。以来長い発光波長を有する蛍光トレーサーはまた、レーザーで領域を照射し、フィルターゴーグルを通して見ながら視覚的に注入された目標領域に色素取り込み/スプレッドをチェックし、より短い波長のレーザー励起により蛍光シグナルを発しています。 </li></ol> 4.インキュベーション<ol><li> 125 mMの、塩化カリウム：2.5 mMの、のMgCl 2：1 mMの、のCaCl 2：2 mMのグルコース：25mMの、のNaH 2 PO 4：1.25 mMの、塩化ナトリウム;注入後、酸素化人工脳脊髄液（ACSFでbrainstemsをインキュベートNaHCO 3、25mMのアスコルビン酸：0.4 mMの、ミオイノシトール：3mMの、ピルビン酸：2mMの、95％のO 2を通気-室温で5％のCO 2）1（RT、25℃） - 4時間、しばらく色素が輸送されています。バブル全体の潜伏期間中にソリューションを提供します。 </li><li>一晩（O / N）の後固定を可能にするために4℃でそれをし、インキュベートする;（PFA / PBS混合物のためにpH7の約100ml）で、続いて、PBSに溶解した4％パラホルムアルデヒド（PFA）でbrainstemsを転送します。 </li></ol> 5.組織スライスと取り付け<ol><li>次の日、PBSで3回（各洗浄工程のために5分に）脳幹を洗って、4％の寒天でそれをカバーして、50にカット - ビブラトーム上の80μmの厚さにスライス。ガラススライド、及びカバーガラスの取り付けメディアを使用してマウントスライス。 </li><li>必要に応じて、（：AB培地で100倍希釈で例えば青ニッスル）25分間蛍光ニッスルを持つセクションにラベルを付けます。 <ol><li> 、AB培地を調製0.2 Mリン酸緩衝液250mlを混合する（PB; 51 mMのKH 2 PO 4、150mMののNa 2 HPO 4）、15 mlの5 M NaClを、15 mlの10％のTriton-X、220ミリリットルのddH 2 Oそして5gのウシ血清アルブミン。 </li><li> PrecePBS中で3回の洗浄工程（10分毎）によるニッスル標識工程をデ、成功。 </li></ol></li></ol>注意：厚いセクションをマウントして分析する必要がある場合には（そのようなスライスここで説明した実験で100だった - より大きな距離での軸索の接続を維持するために、厚さ500ミクロン）、技術が組織のクリアと組み合わせることができます。我々はClearT2 12が成功した20であることが判明します。組織のクリアステップが含まれている場合には、セクションをマウントする前にそれを行います。

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<li>Tallini, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BAC+transgenic+mice+express+enhanced+green+fluorescent+protein+in+central+and+peripheral+cholinergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Genomics%22%5BJournal%5D)">BAC transgenic mice express enhanced green fluorescent protein in central and peripheral cholinergic neurons.</a> Physiol Genomics. 27 (3), 391-397 (2006).</li>
</ol>

我々は、開示することは何もありません。

、in vivoでのトレースの研究とは対照的に、in vitroでのトレーサーエレクトロポレーションの一般的な強さは、高価な定位（多くの場合、電気生理学）装置を必要としない、それは研究者に、したがって関心との脳領域へのより良いアクセスを与えることです。デキストランアミンとの他のトレーサーの使用に関する詳細なレビューを参照してください（in vivoでのトレーサー注射剤の場合には代わりの数日あるいは数週間-また、脳の外植片に必要な生存期間はわずか数時間（4 1）をまたがりますLanciegoとWouterlood、2011年22だけでなく、ロドリゲス・コントレラス、 ら 、2008 23） による生体注射で非常に 、失敗した注射は、早ければ注入処置中などを検出することができるように、または次の日に、遅くとも注入パラメータは、それに応じて調整することができます。脳の外植片のための短い生存期間はまた、間に小さい差が通常存在することを意味します&lt;em&gt;の実効（染料が順行のニューロン...

特定の神経細胞（マイクロ）回路を定義するためには、言った回路、及びその接続パターンの多様な参加者を見つけることによって開始する必要があります。以来lesioning 1を介して神経解剖学的トレーシング技術の多種多様なトレースneurofiberについてウォーラーの出版物は、確立されています。これらの技術のいくつかは、1971 5-6の発見として、他は、生きたニューロン中の染料の能動輸送に依存して、固定された組織の死後2-4に適用することができます。後者はさらに、（与えられた投影の源 、 すなわちへの注入領域から。地域請求する突出しているニューロンの細胞体）アクティブな逆行性の利点を活かした方法とを区別する2つのグループに細分化することができ、アクティブな順行性（注入からの指定された投影の対象の領域、 すなわち軸索投射および標識された神経細胞の軸索端末）輸送。また、場合によっては、TRACER材料は、他の例では、外植脳が注入されている間、（ 生体内のトレーサー注射で ）数日または数週間の注射を生き残るためには、人工脳脊髄液中に注入した後、数時間インキュベート生きた動物に注入された（in vitroでのトレーサー注射を） 。 このプロトコルでは、我々 は 、in vitroエレクトロポレーション技術7-8に 、既存のトレース物質としてコレラトキシンサブユニット-Bおよびテトラメチルデキストランを使用して、順行と逆行追跡実験で、神経細胞体とプロセスにラベルを付けるように変更。このプロトコルの全体的な目標は、トレーサー注射の間に精度を標的に増加させるために使用可能なトランスジェニックマウス系統と基本光学機器を利用しながら、異なる脳核の間の神経接続のパターンを追跡するための効率的なツールを使用して神経科学を​​提供することです。順行と逆行トレースを使用する方法が、コレラ毒素およびデキストランアミンおよびそれらのそれぞれの蛍光標識複合体は、（ 例えば 、エレクトロポレーションの方法であるとして。ハースら 14）新しい9-13ではないが、脳組織のブロックを含むin vitroでの準備でエレクトロポレーションとトレーサー注射の組み合わせより最近の開発7です。生きた動物でのトレーサー染料の同じタイプを使用して、神経トレーシング技術上の主な利点があるため、染料がエレクトロニューロンによって取り込まされていると、より高い効率の増加標識強度です。実験者は、注入の対象領域上の視覚的制御を持っているので、追加の利点は、トレーサ注入中（染料の輸送に必要）を短く潜伏期間であり、その増加目標精度。後者はまた、高価な定位装置は、関心の核または脳の領域を見つけるために必要とされないことを意味します。 ADDIへtionally精度をターゲットに増加、我々は、ニューロン15と405 nmの波長と一致するバンドパスフィルタゴーグルのハンドヘルドレーザポインタ（450からなる基本的な光学機器のそのグリシン部分集団でGFPを発現するトランスジェニックマウス系統、利用しました- 700 nm）で。したがって、我々は、蛍光シグナルを介して注入領域を識別することによって精度を標的にし、土着のGFPシグナルとトレーサーとの間の相互作用の観察を通して注入領域内の色素の広がりを制御するための微細な方法を提供することによって、かなりの更なる増加を達成し蛍光。私たちの技術は、トレーサーを充填したもの（他のマウス系統または興奮）GFP陽性抑制性ニューロンを識別することにより、その接続性とともに、回路の機能性を明らかにすることができます。 要約すると、我々はさらに脊椎動物の脳のコネクトームを研究し、Tを評価するための強力な神経科学のツールを強化しました彼与えられたneurocircuitの異なる神経解剖学的特徴。安価で広く入手可能な光学機器と一緒にトランスジェニックマウスを使用することにより、我々は大幅に私たちの注射のターゲットと精度を高めることができました。さらに、トランスジェニックマウスは、聴覚脳幹における阻害マイクロ回路の機能を明らかに役立っている、私たちは、トレース接続の種類を識別することができました。

<table><tbody><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td>特に明記されていない限り、すべての化学物質はSigma-Aldrich製です。</td></tr><tr><td>塩化カリウム&nbsp;</td><td></td><td>P9333</td><td></td></tr>リン酸<tr><td>カリウム一塩基性</td><td></td><td>P5655</td><td></td></tr>リン酸<tr><td>ナトリウム二塩基性</td><td></td><td>S907</td><td></td></tr><tr><td>塩化マグネシウム</td><td></td><td>M2670</td><td></td></tr>塩化<tr><td>カルシウム</td><td></td><td>C5080</td><td></td></tr>グル<tr><td>コース</td><td></td><td>G7528</td><td></td></tr>重<tr><td>炭酸</td><td></td>ナトリウム<td>S6297</td><td></td></tr><tr><td>アスコルビン酸</td><td></td><td>A4544</td><td></td></tr>ミ<tr><td>オイノシトール</td><td></td><td>I5125</td><td></td></tr>ピル<tr><td>ビン酸</td><td></td>ナトリウム<td>P2256</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td></td><td>A2153</td><td>オプション、追加の(免疫)組織化学</td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td></td><td>X100</td><td>オプション、追加の(免疫)組織化学</td></tr><tr><td>ポリ(エチレングリコール)、8000 MW</td><td></td><td>P2139</td><td>はオプション、脳のクリアリングは</td></tr><tr><td>Formamide</td><td>Fisher Scientific</td><td>F84</td><td>オプション、脳のクリアリングは</td></tr><tr><td>コレラトキシンサブユニット-b</td><td>分子プローブ</td><td>C-34776(Alexa 555)&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>デキストレンテトラメチル-ローダミン</td><td>分子プローブ</td><td>D-7162(Alexa 555)</td><td></td></tr><tr><td>蛍光ニッスル</td><td>Invitrogen</td><td>N-21479(青)</td><td>オプションの</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>SF93</td><td></td></tr>ア<tr><td>ガロース</td><td>Invitrogen</td><td>16520</td><td></td></tr>フル<tr><td>オロマウント-G</td><td>サザンバイオテック</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>ペントバービタル</td><td>・ボルテック・ファーマシューティカル</td>ズ<td>・フェイタルプラス&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ホウケイ酸ガラスフィラメントハーバー</td><td>ド装置</td><td>G150F-10</td><td></td></tr><tr><td>ピペットプーラー</td><td>ツァイツインスツルメンツ、ドイツ</td><td>DMZユニバーサルプーラー</td><td></td></tr><tr><td>灌流セットアップ</td><td>カスタムメイド</td><td></td><td></td></tr><tr><td>レーザーポインター&nbsp;</td><td>laserpointerpro.com、香港</td><td>HK-88007294(405 nm)</td><td></td></tr><tr><td>フィルター/安全ゴーグル</td><td>ドラゴンレーザー、中国</td><td>LSG09(バンドパス450-700 nm)</td><td></td></tr><tr><td>バイオノキュラー顕微鏡&nbsp;</td><td>スイス、ワイルドヘールブルグ</td><td>ワイルドM3</td><td>高強度イルミネーター(MI-150;Dolan-Jenner Inc.)&nbsp;</td></tr><tr><td>ピコスプリッツァー</td><td>パーカーインスツルメンツ</td> MC刺激ソフトウェアをインストールした<td>ピコスプリッツァーIII</td><td></td></tr><tr><td>PC</td> マルチ<td>チャンネルシステム(ソフトウェア)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2チャンネル刺激装置</td><td>マルチチャンネルシステム(ドイツ)</td><td>STG-1002</td><td></td></tr><tr><td>刺激アイソレーションユニット</td><td>A.M.P.I.(イスラエル</td><td>) Iso-Flex</td><td></td></tr><tr><td>マイクロマニピュレーター</td><td>成茂(日本)</td><td>YOU-1</td><td></td></tr><tr><td>ビブラートーム</td><td>ライカ ドイツ</td><td>VT1000S</td><td></td></tr></tbody></table>

脳の外植片にレーザー誘導神経トレース

Laser-guided Neuronal Tracing In Brain Explants

私たちは、処置中に対象となるレーザ照射と一致するフィルターゴーグルと脳の外植片にエレクトロポレーションを介して色素の取り込みを増加させるために、電気的および圧力一連のパルスを使用してin vitroでのトレーサー注入プロトコルを組み合わせた手法を提示します。それ自体でのin vitroエレクトロポレーションの記載された技術は、脳の特定の領域をターゲットするための比較的良好な視覚的なコントロールが得られます。レーザー蛍光遺伝子マーカーの励起とその読み出しバンド通過フィルタゴーグルを通して、遺伝的に標識された細胞/核と蛍光トレース色素の排出量を拾うことができ、研究者は、実質的に注射の精度を向上させることができるとそれを組み合わせることで関心領域を見つけ、はるかに効率的に注入領域における染料拡散/取り込みを制御することによって。また、レーザー照射技術はPROVによって与えneurocircuitの機能を研究することを可能にしますGFP発現は、神経細胞の亜集団によって発現される送信機の種類にリンクされている場合に、特定の領域に突出した神経細胞のタイプに関する情報をiding。

レーザーポインターとレーザーゴーグルは、迅速かつ安価にリターからのGFP陽性動物の遺伝子型を決定するために使用することができるか1および図2は図 。若いマウスの仔の例では、技術は、非侵襲的に頭蓋骨とその上の皮膚（ - D図1A）を介して動物の脳におけるGFPのラベルを識別するために使用することができます。放射された蛍光は、少なくともアップ生後3日目（ 図1C）に皮膚と仔マウスの頭蓋骨を通して見ることができます。手順は、私たちの緑色蛍光タンパク質（GFP） については、図1に示されているニューロン（GLYT2-GFP）のそのグリシン部分集団でGFPを発現するマウス系統をラベル。厚い頭蓋骨と色素沈着した皮膚の高齢動物では、GFPラベルは皮膚や骨を通してあまりよく示しているため、頭部および/ ​​または首の皮膚は、光学ジェノタイピング（ 図2A）の前に除去する必要があります。 <p class="jo...

我々は、in vitroでの調製物を用いて脳核に順行性または逆行性トレーサー注射を介して、神経細胞とそのプロセスを標識する技術が記載されています。我々 は 、nラベリング精度を高めるために、蛍光標識されたマウスの変異体および基本光学機器を利用して、トレーサーエレクトロ体 ​​外 I既存の方法を変更しました。

We present a technique which combines an in vitro tracer injection protocol, which uses a series of electrical and pressure pulses to increase dye uptake ...

本手法の全体的な目的は、神経細胞およびその軸索投射を標識し、目的とする標的またはソースの脳核への接続を追跡することです。この手法は、脳の異なる領域間や神経細胞サブポピュレーション間の接続パターン、および特定の神経回路におけるそれらの機能的意義など、神経科学における重要な疑問への回答に役立ちます。本技術の主な利点は、トレーサー注入時の標的精度の向上にあります。これは、基本的な光学機器を用いて蛍光標識された脳核を可視化することによって達成されます。この方法のもう一つの利点は、ニューロンプロモーターの制御下で蛍光タンパク質を発現するマウスの仔マウスに対して、非侵襲的なジェノタイピングが可能であることです。仔マウスのジェノタイピングを行う際は、適切な励起波長を持つレーザーポインターを用いて、それぞれの蛍光マーカーの発現を確認してください。同時に、励起波長を遮断し、蛍光波長を透過させるフィルターゴーグルを着用してください。対象となる幼仔の後頭部または脊髄にレーザーを照射します。幼仔の目にレーザーが入らないよう注意し、レーザーの照射時間は短く留めてください。励起された蛍光マーカーは皮膚を通して視認できるはずです。マウスが成長すると、採取した組織の個々のニューロンを識別できるようになります。マウスを麻酔し、反射がないことを確認した後、頭蓋骨上の皮膚を取り除き、頭部の後方から頭蓋骨の中央に向かって皮膚を切開します。1ヶ月以上のさらに高齢のマウスでは、動物の眼を通して蛍光を観察することができます。次に、30ゲージの針を用いて、氷冷PBSでマーカー陽性動物の経心腔灌流を行います。5〜10分後には、ほとんどの血液が除去されます。その後、脳を取り出し、目的の領域を切り出します。ここでは、脳の腹側領域にある2つの顕著な球状構造である台形体（trapezoid body）に、目的の領域が含まれています。台形体腹側核（VNTB）の操作は、摘出した脳の目的領域を、酸素供給済みの解剖用溶液が入ったディッシュに移すことから始まります。そこで、注入部位が上側でアクセスしやすいように、30ゲージの注射針を用いて摘出組織を固定します。注入には、3回または4回の引き伸ばしサイクルで製造されたホウケイ酸ガラス製の注入用ピペットを使用してください。ピペットに以下の溶液を充填します。主に逆行性輸送を目的とした、Alexa FLUORA 4 5 55 結合コレラトキシンサブユニットBです。レーザーポインターと注入用ピペットをすべて装着し、使用準備が整ったら、ビームを標識された脳領域または注入対象の細胞に向けます。バンドパスフィルター付きゴーグルを通して視野を観察し、注入用ピペットでどのニューロンを標的にするかを確認します。マイクロマニピュレーターを使用して、ピペットを目的の領域に配置します。次に、15 PSで50ミリ秒のパルスを注入するように設定した圧力インジェクターを用いて、トレーサー物質を2回から10回のパルスで注入します。注入した染料が拡散するように、パルス間に10秒から15秒の間隔を空けてください。テトラエチルルミニンを注入する際は、刺激電極を用いてTTLパルスを送り、その領域を電気刺激します。電極がバス溶液内で接地されていることを確認してください。8VのTTLパルスを、パルス幅50ミリ秒、パルス間隔50ミリ秒で8回出力します。数分間にわたり、10回から20回のパルス繰り返しで当該領域を刺激します。脳核は、大きさ、ニューロン密度、および細胞型が異なります。これは、特定の脳領域で最適な標識結果を得るためには、圧力または電気パルスの持続時間および回数を調整する必要があることを意味します。レーザーとゴーグルを用いて、蛍光トレーサー信号を確認してください。染料が細胞に取り込まれ、注入領域の周囲に拡散する必要があります。注入後、脳幹を室温で酸素供給した人工脳脊髄液中で1～4時間インキュベートします。インキュベート中は酸素供給を維持し、その後、組織を4%パラホルムアルデヒドで固定します。PBS中で4°Cにて一晩置いた後、翌日に組織をスライスして、台形体腹側核（VNTB）へのインターグレード注入を行います。テトラエチルロダミンデキストランを用いることで、VNTBからの投射が台形体内側核（MNTB）まで伸びていることが示されます。その後、MNTBにコリンサブユニットBを注入すると、VNTBが逆行性に強く標識されました。さらに詳細に見ると、次に糖質腸管VNTB細胞の細胞体が標識されているように見えました。MNTBには逆行性標識剤であるdextrin triが注入されました。CTB標識の点状パターンとは異なり、dextrin trit標識は高密度でGOGI様の形態を示しました。このビデオを視聴することで、ニューロンとその突起をより高い精度で標識する方法について十分に理解できるはずです。実演される手法を習得すれば、特定の神経回路に関与する脳領域やニューロンのサブポピュレーションを特定することが可能になります。適切に実施すれば、注射の手順は約30分で完了します。この手順は、免疫化学や脳透明化などの他の手法と容易に組み合わせることができ、ニューロン投射やその他のニューロン構造の形態、方向性、または機能に関するさらなる疑問を解決するのに役立ちます。

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

体外で分離された神経細胞を操作するためのレーザーピンセットを使用して

このプロトコルは、吻側渡り鳥ストリームにおける出生後の脳および神経芽細胞の遊走の高解像度のタイムラプスイメージングに最適化された器官スライスのアッセイを説明します。...

出生後の脳における神経細胞の移動の高分解能タイムラプスイメージングのための器官型スライスアッセイ

からの神経外植文化<em&gt;アフリカツメガエル</em

出典:武藤、A.、他.ゼブラフィッシュ幼生におけるカルシウムイメージングと行動記録を用いた2光子レーザーを用いた神経集団のアブレーションとその評価 J. Vis. Exp. (2018) }このビデオでは、...

ゼブラフィッシュララバにおける2光子顕微鏡を用いた標的ニューロンアブレーション

人間の神経前駆細胞（NPCの）が増殖している条件の下で拡大した。のNPCは、ニューロトロフィンの組み合わせの存在下での神経細胞が豊富な培養物に分化させた。ニューロンのマーカーは、免疫蛍光染色により検出した。ニューロンの純粋な集団を単離するために、PENのNPCは、メンブレンスライドに分化し、レーザーキャプチャーマイクロダイセクションを行った。...

文化における分化したヒト神経前駆細胞からの神経細胞のレーザーキャプチャーマイクロダイセクション

私たちは、光遺伝学的アプローチを使用して前脳回路の機能的トポグラフィーとシナプス特性を特徴付ける方法を記述し、in...

光遺伝学的に標的とした前脳回路のレーザー走査型光刺激

レーザーnanodissectionに結合された2つの光子イメージングは​​、細胞内の分解能で中枢神経系の変性と再生のプロセスを研究するための有用なツールである。このプロトコルは、ラベル画像、およびin vivoでの小脳皮質内の単一の登山繊維を分析する方法を示しています。...

小脳軸索のレーザーNanosurgery<em&gt;インビボ</em

ここでは、ゼブラフィッシュ幼虫からの 2 光子レーザーによる神経細胞の遺伝的標識個体をアブレーションするプロトコルを提案する.

二光子励起レーザーとゼブラフィッシュ幼虫におけるカルシウム イメージング法と行動記録を用いた評価を用いたニューロン集団のアブレーション

マウス脳スライスにおける長距離入力の光遺伝学的刺激のための生体内脳内立体注射

このプロトコルは、 その場で 軸索の成長および成長円錐ダイナミクスを研究するための簡単で堅牢な方法を実証する。 これは、生体外で...

その場で 急性 エクスビボ 胚性脳スライス培養における軸索成長および成長円錐ダイナミクスの可視化

我々は、マウス脳におけるルシフェラーゼ緑色蛍光タンパク質(GFP)を発現する二重レポーターベクターで形質導入されたヒト神経前駆細胞の実質内移植について説明する。移植後、ルシフェラーゼシグナルは、蛍光顕微鏡を用いて脳切片で同定された in vivo 生物発光およびGFP発現移植細胞を用いて繰り返し測定される。...

マウス脳におけるヒト神経前駆細胞の脳内移植と 生体 内生物発光追跡

学ぶレーザー誘導神経トレース法でマウス脳外植片のニューロンと軸索投射を標識し、脳核間の結合パターンと機能的意義を解明する。基本光学機器と蛍光標識マウスを用いて標的精度を向上させ、非侵襲的遺伝子型判定も可能にする神経回路研究手法である。

脳の外植片にレーザー誘導神経トレース

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