脳の外植片にレーザー誘導神経トレース

この方法の全体的な目標は、ニューロンとその軸索突起を標識して、目的の脳核を標的またはソースとする脳核への接続を追跡することです。この方法は、脳の異なる領域やニューロンの亜集団間の接続パターンや、特定の神経回路に対するそれらの機能的重要性など、神経科学における重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、トレーサー注入中のターゲット精度が向上することです。

これは、基本的な光学機器を使用して蛍光標識された脳核を視覚化することによって達成されます。この方法のもう一つの利点は、ニューロンプロモーターの制御下で蛍光タンパク質を発現するマウスポップの非侵襲的なジェノタイピングを可能にすることです。ジェノタイピングの際には、適切な励起波長のレーザーポインターを使用して、それぞれの蛍光マーカーの発現を確認します。

同時に、励起波長を遮断するフィルターゴーグルを着用しますが、発光波長を通過させます。レーザーを問題の子犬の頭の後ろまたは脊髄に向けます。P'Sの目にレーザーが当たらないように注意し、レーザーの露出を短く保ってください。

興奮した蛍光マーカーは、皮膚を通して見えるはずです。マウスが高齢になると、採取した組織の個々のニューロンを同定することができます。マウスに麻酔をかけ、反射がないことを確認した後、頭蓋骨の上の皮膚を取り除き、頭蓋骨の中央部まで後頭部に沿って皮膚を切ってください。

1か月を超えるさらに高齢のマウスでは、動物の目を通して蛍光を観察できます。次に、氷冷したPBSトランスカーディを使用して、30ゲージの針を使用してマーカー陽性動物を灌流し、5〜10分後、血液の大部分が除去されます。次に、脳を取り出し、関心のある領域を解剖します。

ここでは、脳の腹側領域にある2つの顕著な球状である台形体には、関心領域が含まれています。台形体またはVNTBの腹側核は、目的の外植脳領域を酸素化解剖液の皿に移すことから始まります。そこ。explanを30ゲージのシリンジ針で固定して、注射用の領域が上部にアクセスできるようにします。.

注射には、3回または4回の引っ張りサイクルで製造されたBoケイ酸ガラスプルインジェクションピペットを使用します。ピペットに次の溶液をロードします。Alexa FLUORA 4 5 55に結合したコレラ毒素サブユニットBは、主に逆行性輸送用です。

レーザーポインターとインジェクションピペットを使用して、すべて取り付けられ、すぐに使用できる状態になり、注入する標識された脳領域または細胞にビームを向けます。バンドパスフィルターゴーグルを通してフィールドを観察し、インジェクションピペットでどのニューロンを標的にするかを確認します。マイクロマニピュレーターを使用して、ピペットを対象領域に配置します。

次に、15 PSで50ミリ秒のパルスを送達するように設定された圧力インジェクターを使用して、トレーサー物質を2〜10パルスで注入します。パルス間の10〜15秒を経過させて、注入された色素が広がるようにします。テトラエチルルミンを注入すると、刺激電極がTTLパルスを送達して領域を電気的に刺激します。

電極が浴液に接地されていることを確認してください。8 ボルトの 8 つの TTL パルスを 50 ミリ秒間隔で 50 ミリ秒間隔で配信します。数分間にわたって10〜20回のパルス繰り返しで領域を刺激します。

脳核は、サイズ、ニューロン密度、および細胞の種類によって異なります。これは、特定の脳領域に対して最適なラベリング結果を得るために、圧力や電気パルスの持続時間と数を調整する必要がある可能性があることを意味します。レーザーとゴーグルを使用して、蛍光トレーサー信号を確認します。

染料は細胞に取り込まれ、注入された領域の周りに広がるべきです。注射後、脳幹を酸素化人工脳脊髄液中で室温で1〜4時間インキュベートします。インキュベーション中に酸素化を維持し、その後、組織を4%パラホルムアルデヒドに固定します。

翌日、摂氏 4 度で一晩 PBS で、組織をスライスし、台形体または VNTB の腹側核にグレード間注射を取り付けることができます。テトラエチルロダインデキストリンを使用すると、VNTBからの突起が台形体の内側核(MNTB)にまで及ぶことがわかります。次に、MNTBにコレトイン、サブユニットBを注入しました。これは、レトロにVNTBと大きくラベル付けされました。

より詳細には、次に、糖腸内VNTB細胞の体細胞が標識されているように見えました。MNTBは、逆行性ラベルdextrin triを注入しました。CTBラベリングの点状パターンとは異なり、デキストリントリットラベリングは緻密でGOGIのようでした。

このビデオを見れば、ニューロンとそのプロセスをより正確にラベル付けする方法を十分に理解できるはずです。実証された技術は、特定の神経回路に参加している脳領域とニューロン亜集団を特定するのに役立ちます 一度習得すると、適切に実行すれば、注射手順を約30分で行うことができます。この手順は、免疫化学や脳のクリアリングなどの他の方法と簡単に組み合わせて、ニューロンの投射やその他のニューロン構造の形態、方向性、または機能に関する追加の質問に答えることができます。