マルチチャンネルデュアル電界マイクロ流体チップを用いて、肺癌細胞の走電性の研究

このマイクロ流体実験の全体的な目的は、直接電界下での腫瘍細胞の遊走に対するキナーゼ阻害剤の影響を評価することです。したがって、本手法は、がん細胞の電界誘導遊走における決定的な経路は何かといった、細胞電気走性研究における重要な問いに答えるのに役立ちます。本技術の主な利点は、再現性が高く、時間を短縮でき、かつ容易に実施可能な電気走性研究であることです。

この手法の意義は、がんの転移能の診断にまで及びます。磁性を持つがん細胞の可動性は電界によって高めることができるため、本手法により腫瘍細胞の細胞内における電気的特性を評価することが可能です。

また、創傷治癒などの皮膚再生プロセスにも適用可能です。まず、製図・設計プログラムを使用して、個別のアクリル層パターンを作成します。パターンを保存し、レーザースクライバーの電源を入れます。

スクライバーを制御用ノートパソコンに接続し、設計済みのパターンファイルをクリックしてアクリル層のパターンを開きます。次に、レーザースクライバーのx, Y, Zステージに未加工のアクリルシートを配置し、対応するレーザースクライバー用自動アライメントスティックを使用して、レーザービームの焦点をシート表面に合わせます。

設計したパターンをレーザースクライバーに送り、アクリルシートを直接加工します。次に、ピンセットを用いてアクリルシートから保護紙を取り除き、窒素ガスで表面を清掃します。その後、シートを積層し、サーマルボンダーを用いて110 °Cで45分間、2 kg/cm²の圧力で接合し、流体電気刺激チャネルアセンブリを形成します。

同様の手順で両面テープを準備した後、洗浄済みのカバーガラスをフロー電気刺激チャネルアセンブリにテープで固定します。次に、瞬間接着剤を使用して、マルチチャネル二重電場（MDF）チップアセンブリの第1層にある個々の開口部に13個のアクリルアダプターを接着し、MDFチップのソルトブリッジネットワークを構築します。まず、培地入口および出口アダプターを介して、フロアプラスチックチューブをMDFチップアセンブリに接続します。

次に、中口径の入口および出口プラスチックチューブのルアーテーパーを3方コックに接続します。2.5 mLの二酸化炭素平衡PBSを含む3 mLシリンジを入口プラスチックチューブの3方コックに、空の3 mLシリンジを出口プラスチックチューブの3方コックにそれぞれ接続してください。白色のソリッドフィンガータイトナットを使用して、レイヤー1アクリルシート上の青色および緑色のアダプターの開口部を密封します。その後、気泡が入らないように注意しながら、塩橋チャネルと培養チャンバーに二酸化炭素平衡PBSを満たします。

チップを37°C、5% CO₂の細胞培養インキュベーターに一晩入れておき、翌朝、両面テープ内の溶解空気がチャンバー内で気泡となるようにします。2本のシリンジを用いてPBSを急速に流し、必要に応じてPBSを往復させて気泡を洗い流します。すべての気泡が除去されたら、培地流出口チューブに接続された3方活栓を使用して、チャネルからPBSを排出します。

次に、入口に接続されたシリンジを、2.5 mLのCO₂等量DMEMを含む3 mLシリンジに交換し、チャンバーが満たされるまで培地を補充します。グリーンアダプターからソリッドナットを取り外し、少なくとも70 °Cに加熱した3%アガロースをソルトブリッジチャネルに注入します。アダプターの開口部を通して、ホットアガロースがソルトブリッジを形成し、培養チャンバー間の培地列が確実に遮断されるようにします。

化合物がソルトブリッジチャネルの長さの4分の3まで満たされたところでアガロスの注入を停止し、ソリッドナットで孔を再密封します。次に、ブルーアダプターのソリッドナットを半透明のチューブ状フィンガータイトナットに交換し、チューブ状ナットにアロスを充填します。その後、アロスが凝固する前に、銀/塩化銀電極をチューブ状ナットに埋め込みます。

電気タクシス実験の準備として、アウトレットチューブからMDFチップに0.3 millilitersの細胞を注入し、チップを細胞培養インキュベーターに戻します。2〜4時間後、MDFマイクロ流体システムを透明な酸化インジウムスズ（ITO）ガラスヒーターの上に設置し、MDFチップと酸化インジウムスズガラスの間にK型熱電対を取り付けます。チップの温度を測定するため、比例積分微分（PID）コントローラーを使用してMDFマイクロ流体システムの培養温度を37 degree Celsiusに設定し、温度制御されたMDFチップアセンブリを倒立顕微鏡のコンピュータ制御XYZ電動ステージに装着します。

次に、4チャンネルシリンジポンプを用いて、完全培地を入口から培養チャンバーへ 20 microliters per hour の流速で分注します。培養廃液は出口からマイクロ遠心チューブに回収してください。その後、細胞を 37 degrees Celsius でさらに 16 to 18 hours インキュベートします。

翌日、各チャンバーの培地を、適切な濃度のキナーゼ阻害剤を添加した新鮮な培地に入れ替え、60分間処理します。次に、銀・塩化銀電極を介してDC電源をMDFチップに直列に接続します。MDFチップ内の電流をモニタリングするため、電気回路に電流計を接続します。

最後に電源を入れ、電圧を15〜19 Vに調整します。電流計の電流を86.94 µAに設定します。この代表的なMDFマイクロ流体システム実験では、さまざまな濃度のキナーゼ阻害剤で処理した肺がん細胞を使用しています。

Y 2 7 6 3 2は、電気刺激の有無にかかわらず、細胞移動速度に変化を示しませんでした。しかし、電場を加えた状態でY 2 7 6 3 2処理を行うと、がん細胞移動の方向性が有意に低下しました。実際に、50 µMの濃度において、このROCK阻害剤は細胞の移動速度に影響を与えることなく、細胞の方向性を持った移動を完全に消失させました。

さらに、適用した化学物質の濃度と方向性指標の間には用量依存的な相関が認められ、軸索の研究手法としてMDFマイクロ流体システムの信頼性と効率性が確認されました。習得すれば、開発後の適切な実施により、この手法は7〜8時間で完了させることができます。この技術は、電気生理学分野の研究者が皮膚へのアプローチを飛躍的に展開することを可能にします。

レーザースクレイパーでの作業は極めて危険であるため、本手順の実施中は常に十分な注意を払う必要があることを忘れないでください。