Name: 遺伝子発現に影響を及ぼすシグナル伝達経路を同定するために、ニワトリ胚手足の開発にビーズのグラフト (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 48 s
Description: 学ぶビーズグラフト法でニワトリ胚の手足発達における遺伝子発現に及ぼす成長因子と阻害剤の効果を評価する方法。この技術はシグナル伝達経路のin vivo研究に有用です。

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この仕事は、ノッティンガム大学のDSへの早期キャリア賞によって部分的に資金提供されました。RMは、イラクの教育開発のための高等委員会によって資金提供されています。

倫理の声明：すべてのこれらの実験は、動物のケアとノッティンガム大学の倫理指針に従ってください。 移植のためのヘパリンビーズの作製<ol><li>使用前に徹底的にPBSにヘパリンビーズを洗ってください。注：ビーズをPBS中のスラリーとして4℃で保存することができます。 <ol><li> 1mlのPBSのドロップに20μlのピペットを用いてストックからそれらを除去することによって、移植のためのビーズを選択します。後、3センチペトリ皿に20μlのPBSのドロップにビーズを転送するために2μlに設定し、マイクロピペットを使用しています。 P2ピペットチップで選択ビーズを転送し、解剖顕微鏡ステレオを使用して、サイ​​ズに基づいてビーズを選択し;直径100μmの周りの人々は理想的です。 </li></ol></li><li>ビーズからPBSを削除します。 20μlのピペットとファイン時計職人の鉗子で毛管作用により残液と液体の大部分を削除します。注：これは、成長事実上のように、可能な限り除去することが重要ですそれがビーズに添加したときrが希釈されていません。 </li><li>ビーズ上に直接成長因子をピペット。 FGF18のために、PBS中の0.1％BSA中に0.5mg / mlで再構成された組換えFGF18の0.5μlを添加します。蒸発から液体を防ぐために、皿の縁の周りに水を数滴を置きます。 </li><li> RTで1時間ビーズをインキュベートします。パスツールピペットで皿から水滴を削除し、移植のための準備ができて氷上に置きます。 </li><li> （透明のビーズのために）必要な場合は、それらを視覚化するために移植する前に、2％のフェノールレッドに4-5のビーズを転送します。胚に転送する前に、PBSですすいでください。 </li></ol>移植のためのAG 1-X2のビーズの調製<ol><li> 0.2 Nギ酸で誘導体化ビーズを使用する前に。 <ol><li>これを行うには、1.5mlの微小管にビーズを転送するために、スパチュラを使用しています。 0.2 Nギ酸の1ミリリットルを追加し、1時間振とうプラットフォーム上で洗います。 </li><li>そして、P1000ピペットでギ酸を除去し、1と交換mlの水。 1時間洗浄し、残りのギ酸を除去するために、6回繰り返します。 </li><li> P1000ピペットを用いて残りの液体を削除し、4℃でビーズを格納します。注：この段階で、すべての残留水を除去する必要はありません。 </li></ol></li><li> 3センチメートルペトリ皿に小さなへらを使用してストックから約5〜10マイクロリットル容量のビーズの小さなペレットを削除し、1mlのDMSOを追加（または薬物を溶媒に溶解させ方）。注意：これは、正しいサイズのものを選択するために、そこから数百のビーズを提供する必要があります。 </li><li>その後、別の3センチメートルシャーレ中の溶媒の20μlの低下に約100μmの直径のビーズを転送するために2μlに設定P2ピペットを使用しています。 </li><li> 20μlのピペットと2μlのピペットを用いて任意の残留溶媒で溶媒を除去。適用される薬剤20μlを交換してください。 注：整合性（またはこれまでに溶媒が使用される）DMSO中の100μMの濃度で薬物を溶解するために、いくつかの小分子阻害剤として-80℃で20μLとストアへのアリコートは不安定であり、それを繰り返し凍結融解を回避するのが最善です。必要な場合は、ビーズを浸漬する前に、所望の濃度に薬剤を希釈します。有効濃度は、各薬物のために経験的に決定する必要があるかもしれません。 </li><li> 1時間インキュベートします。これらの分子の多くは光感受性であるため、光から保護します。 </li><li>水に溶解した2％のフェノールレッドを20μlに2μlに設定P2ピペットで転送4-5ビーズを移植する前に。ビーズを可視化するために、ステレオ解剖顕微鏡を使用してこの手順を実行します。ファイン時計職人鉗子を持つ単一のビーズまたはワイヤループを削除し、胚に転送する前に、PBSですすいでください。これは活性の損失の原因となりますので、使用前に15分以上の場合は2％のフェノールレッド中のビーズを放置しないでください。 </li></ol> 3.準備タングステン針<ol><li> 3〜4cmのウェル長さに微タングステン線をカットします。の終わりに、ワイヤの一枚を挿入ガラスパスツールピペットや位置に固定するためにブンゼンバーナーで溶融。彼らが使用中に破損している場合、スペアがあることを確認するために10針まで準備します。 </li><li>ジェット機炎にワイヤの端部を配置し、（2〜3分程度）タングステンが白色に点灯し、先端が鋭利になるまでそこにそれを保持します。注：必要に応じて、使用中に針を洗浄することができ、ジェット機で再先鋭化。 注：これらの針はまた、ビーズを転送するためのループを作るために使用することができます。静かにベンチに針に触れ、それがループを形成するように曲げます。 </li></ol>ビーズ移植片のための胚の準備4 <ol><li>それらは所望の段階（ほとんどの肢芽の操作のための3〜5日）に達するまで、平滑末端を上にして卵をインキュベートします。鈍鉗子を使用すると、殻を破ると、シェルを削除し、胚を露出するために鉗子を使用するように平滑末端をタップします。卵殻膜も除去されることを確認します。 注：PBS 1-2 mlのを支援するためにパスツールピペットで追加することができますこの膜は、卵黄にこだわっている場合。静かに、卵黄の表面にPBSをピペットで卵黄を損傷しないように注意しながら、ピンセットで膜をつかみ、静かに卵から引き出します。 </li><li> 10ミリリットルの注射器と19 G針で卵から卵白を5 mlまで削除します。胚の生存率を減らすことができ、より大きなボリュームの除去などの卵を密封するために使用されるテープに接触しない胚を確保するために必要な分だけの取ります。 </li><li>胚は15 100 Uペニシリンを含むPBS mlのストレプトマイシンおよび0.1mg / mlにアーティスト墨汁の5-6滴を追加する視覚化するため。 0.5-1は直接1mlシリンジ及び25 G針で胚下mlで注入します。 </li><li>脱水しない胚を確保するために、卵子に1％ウシ胎児血清および100 Uペニシリンおよび0.1mgストレプトマイシン/ mlのPBSを2〜3mlのを追加します。先鋭化時計職人鉗子を使用すると、卵黄膜を除去し、開発肢芽の上に羊膜を開きます。胚が乾燥しないことを確認し、、必要に応じて、より多くのPBS / FCSを追加します。 注：肢芽が明らかに胚の脇腹に対になった派生物として見ることができます。これらの段階では胚は、右側が通常最上でオンになります。その結果、それが右の手足にビーズを移植片と反対側のコントロールとして残したものを使用する方が簡単です。 </li><li>ビーズが移植される肢芽の中に切開​​を作るために先鋭化タングステン線を使用してください。若い段階で、これは困難であるが可能な肢芽を介してすべての方法をカットしないでください。 注：古い胚（HHステージ22以上）においては、グラフト化が、肢自体が小さい芽、これはより困難であるより若い段階において肢芽の特定の領域を選択することが可能です。それは肢芽は、ビーズが四肢近位のままになり、特に若い段階で、そのようにグラフトされたビーズを越えて成長することを覚えておくことも重要です。 </li><li>極細WAのいずれかを使用して、成長因子または薬剤のいずれかからビーズをピックアップtchmakers鉗子やタングステン針から作られたループ。ビーズをDMSOまたはフェノールレッドのいずれかに浸漬されている場合は、胚に適用する前にPBSですすぎます。鉗子/ワイヤループで胚にビーズを転送します。その後、切開部にビードを挿入すると、鋭利なタングステン線を使用しています。 </li><li>胚が水和保たれていることを確実に卵にPBS / FCS 1-2 mlを加えたが、これは胚を損傷し、ビーズが脱落する原因となりますので、胚そのものに直接適用することは避けてください。テープで卵を密封し、インキュベーターに戻します。 </li></ol>

<ol><li>Davey, M. G., Tickle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chicken+as+a+model+for+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cytogenetic+Genome+Research%22%5BJournal%5D)">The chicken as a model for embryonic development.</a> Cytogenetic Genome Research. 117, 231-239 (2007).</li>
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<li>Brand-Saberi, B., Muller, T. S., Wilting, J., Christ, B., Birchmeier, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scatter+factor%2Fhepatocyte+growth+factor+%28SF%2FHGF%29+induces+emigration+of+myogenic+cells+at+interlimb+level+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Scatter factor/hepatocyte growth factor (SF/HGF) induces emigration of myogenic cells at interlimb level in vivo.</a> Developmental Biology. 179, 303-308 (1996).</li>
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<li>Abou-Elhamd, A., Cooper, O., Münsterberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Klhl31+is+associated+with+skeletal+myogenesis+and+its+expression+is+regulated+by+myogenic+signals+and+Myf-5%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Development%22%5BJournal%5D)">Klhl31 is associated with skeletal myogenesis and its expression is regulated by myogenic signals and Myf-5.</a> Mechanisms of Development. , 126-852 (2009).</li>
<li>Schmidt, M., Tanaka, M., Munsterberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+%28beta%29-catenin+in+the+developing+chick+myotome+is+regulated+by+myogenic+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Expression of (beta)-catenin in the developing chick myotome is regulated by myogenic signals.</a> Development. 127, 4105-4113 (2000).</li>
<li>Stavridis, M. P., Lunn, J. S., Collins, B. J., Storey, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+discrete+period+of+FGF-induced+Erk1%2F2+signalling+is+required+for+vertebrate+neural+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A discrete period of FGF-induced Erk1/2 signalling is required for vertebrate neural specification.</a> Development. 134, 2889-2894 (2007).</li>
<li>Martinez-Morales, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF+and+retinoic+acid+activity+gradients+control+the+timing+of+neural+crest+cell+emigration+in+the+trunk%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">FGF and retinoic acid activity gradients control the timing of neural crest cell emigration in the trunk.</a> Journal of Cell Biology. 194, 489-503 (2011).</li>
<li>Olivera-Martinez, I., Storey, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+signals+provide+a+timing+mechanism+for+the+FGF-retinoid+differentiation+switch+during+vertebrate+body+axis+extension%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Wnt signals provide a timing mechanism for the FGF-retinoid differentiation switch during vertebrate body axis extension.</a> Development. 134, 2125-2135 (2007).</li>
<li>Logan, M., Simon, H. G., Tabin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+of+T-box+and+homeobox+transcription+factors+suggests+roles+in+controlling+chick+limb-type+identity%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Differential regulation of T-box and homeobox transcription factors suggests roles in controlling chick limb-type identity.</a> Development. 125, 2825-2835 (1998).</li>
<li>Borycki, A. G., Mendham, L., Emerson, C. P. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+somite+patterning+by+Sonic+hedgehog+and+its+downstream+signal+response+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Control of somite patterning by Sonic hedgehog and its downstream signal response genes.</a> Development. 125, 777-790 (1998).</li>
<li>Sweetman, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF-4+signaling+is+involved+in+mir-206+expression+in+developing+somites+of+chicken+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">FGF-4 signaling is involved in mir-206 expression in developing somites of chicken embryos.</a> Developmental Dynamics. 235, 2185-2191 (2006).</li>
<li>Chapman, S. C., Collignon, J., Schoenwolf, G. C., Lumsden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+method+for+chick+whole-embryo+culture+using+a+filter+paper+carrier%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Improved method for chick whole-embryo culture using a filter paper carrier.</a> Developmental Dynamics. 220, 284-289 (2001).</li>
<li>Sweetman, D., Wagstaff, L., Cooper, O., Weijer, C., Münsterberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+migration+of+paraxial+and+lateral+plate+mesoderm+cells+emerging+from+the+late+primitive+streak+is+controlled+by+different+Wnt+signals%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The migration of paraxial and lateral plate mesoderm cells emerging from the late primitive streak is controlled by different Wnt signals.</a> BMC Developmental Biology. 8, 63(2008).</li>
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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

卵内の組織の開発に直接適用ビーズ移植片の使用は、それらが適用されるときの発達段階と暴露時間を超える圧倒的な制御を与え、開​​発中の増殖因子シグナル伝達の役割を分析するための強力なツールです。 分子の各タイプのビーズの選択は重要です。それは、経験的にこれらのビーズのそれぞれの阻害剤の有効性をテストする必要があるが、このようなここに記載の阻害剤及びレチノイン酸のような小さな疎水性分子は、通常、誘導体化AGによく1-X2ビーズに結合します。同様に、成長因子のためには、ビーズの異なるタイプをテストする必要があるかもしれません。いくつかのビーズは透明であり、そのように操作中に視覚化することは難しいことができますが、PBSですすぎ、続いてフェノールレッドと短い治療は移植を行うのに十分な長さのためにそれらをラベル付けします。 ビーズを調製する場合、特に阻害剤に浸漬されていますSは、できるだけ光から保護することが重要です。彼らの初期治療中および操作中に彼らを覆い、ビーズのみが転送されているときに削除する必要があります。これらの試薬のいくつかは...

鳥類胚は長年1の開発のための研究のための強力なツールを提供してきました。彼らの最も有用な特徴の1つは、操作が比較的容易であるということです。外部開発は、このような細胞の運命2,3を研究するための古典的なウズラ-ニワトリキメラシステムなどの例を含む様々なmicromanipulationsを胚にアクセスするために卵を開き、実行することが可能となり、開発4,5の間に特定の組織における過剰発現のためのレトロウイルスの注入発達シグナル源6を識別し、移植片培養。さらに最近では、GFPを発現するトランスジェニックニワトリのラインからの移植片とラベルなしホストとの間で発生するキメラは、古典的な移植や遺伝子修飾の組み合わせが開発7,8に重要な洞察を提供することができることを示しています。 鳥類胚を操作することができる容易さはそれを手足を研究するための優れたモデルをしました開発9。 in vivoでの開発手足に特定の成長因子の適用は、四肢のパターニング10,11を変化させ、このプロセス12への洞察を提供し続け因子を同定してきました。このアプローチはまた、筋肉の発達を調節する因子を研究するために使用されており、そのようなのWnt 13、BMPは14およびHGF 15などの多数の信号のための役割を明らかにしました。 最近、この技術は、肢芽に筋原性遺伝子発現を制御する信号を調査するために使用されており、FGF18とレチノイン酸との間の相互作用は、MyoDの発現16のタイミングを制御することができることを示しています。ビーズ上にロードした後、定義された発達段階で特定の組織に直接移植することができる成長因子および小分子の組み合わせを使用することで、開発中のほぼすべての時間と領域に介入する機会を与えてくれます。これはinveするために使用されています体節のパターニング17,18、神経仕様19、神経堤の移行20と軸延長部21を含む多くのプロセスをstigate。 ここでは、鶏の手足の開発に増殖因子または阻害剤のいずれかに浸したビーズを移植する方法について説明します。これは、in situハイブリダイゼーションと筋特異的遺伝子発現を分析することによって筋形成におけるこれらの信号の影響を決定するために使用されてきました。我々は、レチノイン酸または特定のシグナル伝達経路の小分子阻害剤のような小さな疎水性分子のための成長因子、またはAG 1-X2ビーズのために使用されるヘパリン浸したビーズのいずれかを使用して移植片を記載しています。しかし、他のビーズは、22のFGFおよびShhの23の両方を提供するために使用されているにもご利用いただけます。

<table><tbody><tr><td>ヘパリンアクリルビーズ</td><td>Sigma</td><td>H5263</td><td>使用されているアクリルヘパリンビーズは販売を終了しました。ただし、代替製品、ヘパリンアガロースビーズ、カタログ番号H6508が利用可能です。これらは透明であるため、取り扱いが困難ですが、AG 1-X2ビーズ、AG 1-X2ビーズ、</td></tr><tr><td></td><td>Bio-Rad</td><td>140-1231</td><td></td></tr>、<tr><td>Affi Gel、ブルービーズ</td>、<td>Bio-Rad</td><td>153-7301、153-7302</td>、<td>これらのビーズは、ShhやFGFsなどのさまざまな成長因子とともに使用されており、ヘパリンビーズ</td></tr><tr><td>FGF18</td><td>Peprotech</td><td>100-28</td><td>の代わりに使用できます。0/1% BSAでPBSに再懸濁し、0.5-1ulの単回使用アリコートを準備し、-80°Cで保存します。</td></tr><tr><td>U0126</td><td>Cell Signalling</td><td>9903</td><td>DMSOで20mMのストックにし、-80°Cの使い捨てアリコートに保管します。</td></tr><tr><td>BMS-493</td><td>Tocris Biosciences</td><td>3509</td><td>DMSOに再懸濁し、-80°Cの単回使用アリコートで保存します。</td></tr><tr><td>黒インドのインク</td><td>ウィンザーとニュートン</td><td>5012572003384(30ミリリットル)</td><td>この製品の代替品は、いくつかのインクが胚タングステン</td></tr><tr><td>ワイヤー、0.1ミリメートル直径99.95%</td><td>アルファAesar</td><td>10404</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>シグマ</td><td>P0781PBS</td><td>/インクとPBS / FCSで100Xを希釈する</td></tr>ので、注意を取る必要があります</tbody></table>

遺伝子発現に影響を​​及ぼすシグナル伝達経路を同定するために、ニワトリ胚手足の開発にビーズのグラフト

Grafting of Beads into Developing Chicken Embryo Limbs to Identify Signal Transduction Pathways Affecting Gene Expression

ニワトリ胚を使用して直接成長因子または遺伝子発現およびシグナル伝達経路の活性化におけるシグナル伝達経路の特異的阻害剤のいずれかの効果を試験することが可能です。この技術は、特定の時間に正確に定義された発達段階でのシグナル伝達分子の送達を可能にします。この胚を採取し、遺伝子発現は 、in situハイブリダイゼーション、または免疫染色で観察されたシグナル伝達経路の活性化により、例えば、検査することができる後。 U0126、MEK阻害剤に浸し、このFGF18に浸したビデオヘパリンビーズ、AG 1-X2ビーズでは、 卵内肢芽に移植されています。これは、FGF18はMyoDの及びERKのリン酸化の発現を誘導し、誘導された内因性の両方、およびFGF18のMyoD発現がU0126により阻害されることを示しています。レチノイン酸アンタゴニストに浸したビーズは、FGF18によって時期尚早のMyoDの誘導を増強することができます。 このアプローチは、私たちすることができます異なる増殖因子および阻害剤の広い範囲で編、容易に胚内の他の組織に適合されます。

HHステージでは21のMyoDは染色が開発体節（ 図1A）の筋節に見ることができるが、四肢の筋芽細胞の開発に表現されていない。 図1Bは、FGF18ビーズ移植以下のMyoD 6時間in situハイブリダイゼーションを示しています。対側肢では発現がないながらのMyoDは、ビーズの近くに筋芽細胞に誘導されます。 U0126、MEK、のMyoD（ 図1C）のブロックのFGF18誘導の特異的阻害剤に浸したビーズを共同グラフトします。同様にHHステージ21にU0126ビーズを移植し、24時間後のMyoD発現を探している未処理の対側肢（ 図1D、E）と比較してのMyoDの内因性発現を減少させます。 HHステージ19 FGF18での肢芽でのMyoD（ 図1F）を誘発しません。しかし、FGF18に浸したビーズの同時移植とBMS493は、これを克服することができ、異所性のMyoDが検出されたレチノイン酸アンタ...

成長因子またはシグナル伝達経路の特定の阻害剤に浸したビーズを発生中の胚に移植することにより、それらの効果を生体内で直接テストすることが可能です。このプロトコルでは、ビーズを四肢の芽に移植して、これらの分子が遺伝子発現とシグナル伝達に及ぼす影響を決定します。

Using chicken embryos it is possible to test directly the effects of either growth factors or specific inhibitors of signaling pathways on gene expression ...

この手順の全体的な目的は、成長因子および阻害剤が、発達中のニワトリ胚肢の遺伝子発現に及ぼす影響を決定する方法を示すことです。この手法は、シグナル分子が生体内（in vivo）での細胞の成長や分化にどのように影響するかといった、発生生物学における重要な疑問への回答に役立ちます。この技術の主な利点は、これらの因子を胚の中で直接的に検証する方法を提供できる点にあります。この手法は肢の発達に関する知見を得るために有用ですが、神経組織、体節、または原腸陥入などの他の系にも適用可能です。本手順の実演は、私の研究室の大学院生であるRebeea Mohammedが行います。まず、元のストック溶液から1 mLのビーズを新しいチューブに移します。ビーズを沈降させた後、液体を取り除き、1 mLのPBSに置換します。この工程を5回繰り返し、洗浄したビーズをPBS懸濁液として4 °Cで保存します。20 µLピペットを用いて洗浄済みストック溶液からビーズを回収し、1 mLのPBSに加えて、グラフト化に使用するビーズを選択します。実体顕微鏡を用いて、直径約 100 microns のビーズを選択します。選択したビーズを 2 µL の液体と共に、20 mL の PBS Next の滴が含まれる新しいペトリ皿に移し、ビーズから PBS を取り除きます。まず 20 µL ピペットを用いて取り除き、その後、時計職人用精密ピンセットを用いて毛細管現象により残留液体を除去します。成長因子をビーズに添加する際に希釈されないよう、可能な限り液体を除去することが重要です。成長因子をビーズ上に直接ピペッティングします。FGF18の場合、0.1% BSA含有PBSで0.5 mg/mLに再構成したリコンビナントFGF18を0.5 µL添加します。次に、液体の蒸発を防ぐために、ディッシュの縁の周囲に水を数滴垂らします。準備ができたら、ビーズを室温で1時間インキュベートします。インキュベート後、パストゥールピペットでディッシュから水滴を取り除き、ディッシュを氷上に置きます。まず、スパチュラを用いてビーズを1.5 mLマイクロ遠心チューブに移し、ビーズを誘導体化します。次に、0.2 Nギ酸を1 mL加え、シェイキングプラットフォーム上で1時間インキュベートします。続いて、ビーズを沈殿させ、ギ酸を除去し、代わりに水を1 mL加えます。シェーキングプラットフォーム上で1時間洗浄し、残留したギ酸を除去するためにこの洗浄を6回繰り返します。最後の洗浄後、残った液体を除去し、ビーズを4°Cで保存します。スパチュラを使用して、ストックから約5〜10 µLの少量のビーズを採取し、30 mLのペトリ皿に入れます。その後、DMSOを1 mL加えます。次に、2 µLに設定したP2ピペットを使用して、直径約100 µmのビーズを、別の30 mLペトリ皿に入れた20 µLの溶媒の滴に転移させます。溶媒の大部分を20 µLピペットで取り除き、残りの溶媒を2 µLピペットで取り除きます。次に、DMSOに溶解させた適用する薬剤 20 µL をビーズに加えます。ビーズを薬剤溶液中で1時間インキュベートします。多くの薬剤分子は光に敏感であるため、ビーズを遮光してください。ビーズを可視化しやすくするため、2 µLの液体中に4〜5個のビーズを移し、水に溶解させた2% フェノールレッド 20 µLに加えます。精密ピンセットでビーズを1個取り出し、PBSで洗浄します。洗浄前にフェノールレッド溶液中にビーズを15分以上放置しないでください。活性が失われる可能性があります。細いタングステン線を3〜4 cmの長さに切断します。次に、切断したワイヤーを1本ガラス製パステールピペットの端に挿入し、ブンゼンバーナーで加熱溶解させて固定します。破損した際の予備として、最大10本のニードルを用意します。続いて、ワイヤーの先端をトーチの炎に当て、タングステンが白く光り、先端が鋭くなるまで保持します。この操作には約2～3分かかります。100 unitsのPenicillinおよび0.1 milligramsのStreptomycinを1 mLあたりに含む15 millilitersのPBSに、アーティスト用インディアインクを5～6滴加えます。ニワトリ胚を準備するには、卵の鈍端を上にして、肢芽操作の多くで目的とされる段階（通常は3～5日目）に達するまで孵化させます。目的の時間に達したら、鈍端鉗子を用いて卵の鈍端を叩き、殻を割ります。次に、鉗子で殻を取り除き、胚を露出させます。この際、卵細胞膜も確実に除去してください。胚を可視化するため、1 mL シリンジと 21G 針を用いて、数滴のアーティスト用インディアインクを添加した PBS を胚の下に注入します。次に、胚を覆っている卵黄膜を精密ピンセットで除去します。その後、胚の脱水を防ぐため、1% ウシ胎児血清、100 units/mL のペニシリン、および 0.1 mg/mL のストレプトマイシンを添加した PBS を 2〜3 mL 卵の中に加えます。研磨した時計用ピンセットを使用して、発達中の肢芽上の羊膜を開きます。この段階では、通常、胚が回転し、右側が最上部になります。必要に応じて補完したPBS溶液を追加し、胚が乾燥しないようにしてください。胚を囲む羊膜を細いタングステン針を用いて開け、発達中の肢を露出させます。次に、研磨したタングステン線を用いて、ビーズを植え込む肢芽に切開を加えます。可能な限り、肢芽を完全に切り離さないように注意してください。ただし、より若い段階ではこれは困難です。超極細の時計職人用ピンセットを使用して、成長因子または薬剤がコーティングされたビーズを拾い上げます。ビーズをDMSOまたはフェノールレッドに浸していた場合は、胚に適用する前に必ずPBSで洗浄してください。ピンセットを使用してビーズを胚に移し、その後、研磨したタングステン針金を用いてビーズを切開部位に挿入します。胚の水分を保持するため、補充したPBS溶液をさらに1〜2 mL卵に加えます。この際、溶液を胚に直接かけないようにしてください。胚を損傷させたり、ビーズが脱落したりする可能性があります。次に、19ゲージの針を装着した10 mLシリンジを用いて、胚が卵の密封に使用するテープに接触しないようにするのに十分な量のアルブミンのみを除去します。針を殻の内側に沿わせて挿入し、卵黄を傷つけないように注意してください。最後に、卵をテープで密封し、インキュベーターに戻します。FGF18がMEKを介してERKをリン酸化させることができるかを確認するため、ビーズ移植の1時間後に胚を回収し、リン酸化ERKの有無を免疫染色しました。右の画像では、移植したビーズの周囲にリン酸化ERKが確認できます。HHステージ21では、発達中の肢芽筋芽細胞にMyoDは発現していません。ただし、発達中の体節の筋節では染色が認められます。FGF18ビーズを移植して6時間後、ビーズ近傍の筋芽細胞においてMyoDの誘導が認められます。一方、対照側の肢では発現は見られません。この発現は、U0126などのMEK阻害剤をコーティングしたビーズを同時に移植することで抑制できます。同様に、HHステージ21でU0126ビーズを移植すると、未処理の対側肢と比較して、24時間後のMyoDの内在性発現が低下します。肢芽において、HHステージ19ではFGF18はMyoDを誘導しません。しかし、FGF18とレチノイン酸アンタゴニストを浸漬させたビーズを共移植することでこれを克服でき、異所的なMyoDが検出されます。この手法を習得すれば、適切に行った場合に3〜4分で完了させることができます。この手法の開発により、発生生物学分野の研究者は、胚発生における成長因子のシグナリングを探索することが可能となりました。この手法を行う際は、胚を乾燥させないように注意することが重要です。このビデオを視聴することで、成長因子のシグナル伝達が発達にどのように影響するかを決定するために、発達中の胚にビーズを移植する方法について十分に理解することができます。

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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出典: Delalande, J., et.al.ニワトリGFP神経管移植とカルボシアニン色素DiI注射を用いたニワトリはい内の神経堤細胞と血管の二重標識J. Vis.

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