遺伝子発現に影響を​​及ぼすシグナル伝達経路を同定するために、ニワトリ胚手足の開発にビーズのグラフト

この手順の全体的な目標は、発生中のニワトリ胚の四肢の遺伝子発現における成長因子と阻害剤の影響を決定する方法を示すことです。この方法は、シグナル伝達分子がin vivoでの細胞の成長と分化にどのように影響するかなど、発生生物学における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、これらの因子を胚で直接テストする方法を提供することです。

この方法は四肢の発達に関する洞察を提供しますが、神経組織、体節、原腸陥入などの他のシステムにも適用できます。その手順を実演するのは、私の研究室の大学院生であるRebeea Mohammedです。まず、元のストック溶液から1ミリリットルのビーズを新しいチューブに移します。

ビーズが沈殿するのを待ってから液体を取り除き、1ミリリットルのPBSと交換します。この手順を5回繰り返し、洗浄したビーズを摂氏4度でPBSのスラリーとして保存します。20マイクロリットルのピペットを使用して洗浄したストック溶液からビーズを取り出し、1ミリリットルのPBSに入れることにより、移植するビーズを選択します。

ステレオスコープを使用して、直径約100ミクロンのビーズを選択します。選択したビーズを2マイクロリットルの液体で、20ミリリットルのPBS滴を含む新しいペトリ皿に移します次に、ビーズからPBSを取り除きます。まず、20マイクロリットルのピペットで、その後、高級時計メーカーの鉗子を使った毛細管現象で残留液を取り除きます。

ビーズに添加するときに成長因子が希釈されないように、できるだけ多くの液体を取り除くことが重要です。成長因子をビーズに直接ピペットで移します。FGF18については、0.5マイクロリットルの組換えFGF18を添加し、再構成してPBSに0.5ミリグラム/ミリグラムを0.1%BSAで添加します。

次に、液体が蒸発するのを防ぐために、皿の端の周りに数滴の水を置きます。準備ができたら、ビーズを室温で1時間インキュベートします。インキュベーション後、パスツールピペットで皿から水滴を取り除き、皿を氷の上に置きます。

まず、スパチュラを使用してビーズを1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移すことにより、ビーズを誘導体化します。次に、0.2の通常のギ酸を1ミリリットル加え、ビーズを酸中で1時間インキュベートします。次に、ビーズが沈殿するのを待ち、ギ酸を取り除き、1ミリリットルの水と交換します。

振とう台でビーズを1時間洗い、6回繰り返して残留ギ酸を取り除きます。最後の洗浄後、残りの液体を取り除き、ビーズを摂氏4度で保管します。へらを使用して、ストックから体積が約5〜10マイクロリットルのビーズの小さなパレットを取り出し、ビーズを30ミリリットルのペトリ皿に入れます。

次に、1ミリリットルのDMSOを追加します。次に、2マイクロリットルに設定されたP2ピペットを使用して、直径約100ミクロンのビーズを別の30ミリリットルのペトリ皿の20マイクロリットルの溶媒滴に移します。溶媒の大部分は20マイクロリットルのピペットで、残りの溶媒は2マイクロリットルのピペットで除去します。

次に、ビーズを20マイクロリットルの薬剤で覆い、DMSOに溶解します。ビーズを薬液中で1時間インキュベートします。多くの薬物分子は光に敏感であるため、ビーズを光から保護します。

ビーズを視覚化するには、2マイクロリットルの液体に4〜5個のビーズを、水に溶かした20マイクロリットルの2パーセントフェノールレッドに移します。高級時計職人の鉗子で1つのビーズを取り除き、ビーズをPBSですすいでください。ビーズをフェノールレッド溶液に15分以上放置してからすすぐと、活性が失われる可能性があるため、ビードを放置しないでください。

細いタングステンワイヤーを3〜4センチメートルの長さにカットし、次に、ワイヤーの1つをガラスパスツールピペットの端に挿入し、ブンゼンバーナーで溶かして所定の位置に固定します。針が損傷した場合に備えて、予備があることを確認するために、最大10本の針を準備します。次に、ワイヤーの端をブロートーチの炎に入れ、タングステンが白く光り、先端が鋭くなるまでそこに保持します。

これには約2〜3分かかります。100ユニットのペニシリンと1ミリグラムあたり0.1ミリグラムのストレプトマイシンを含む15ミリリットルのPBSに、アーティストインディアインクを5〜6滴加えます。ニワトリの胚を準備するには、鈍い端で卵を孵化させ、ほとんどの手足の芽の操作に必要な段階(通常は3〜5日)に達するまで卵を孵化させます。

希望の時点に達したら、鈍い鉗子を使用して卵の鈍い端をたたいて殻を壊します。次に、鉗子を使用して殻を取り外し、胚を露出させます。卵細胞膜も除去されていることを確認してください。

胚を視覚化するには、アーティストインディアインクを数滴補充したPBSを、1ミリリットルの注射器と21ゲージの針で胚の下に注入します。胚を覆っているビテリン膜は、その後、細い鉗子で除去することができます。次に、1パーセントのウシ胎児血清、ペニシリン1ミリリットルあたり100単位、およびストレプトマイシン1ミリリットルあたり0.1ミリグラムを、2〜3ミリリットルのサプリメントを卵に追加して、胚が脱水しないようにします。

研ぎ澄まされた時計職人の鉗子を使用して、発達中の手足のつぼみに羊膜を開きます。これらの段階では、通常、胚は回転するため、右側が一番上になります。胚が乾燥しないように、必要に応じて補充したPBS溶液をさらに追加します。

胚を取り巻く羊膜は、細いタングステン針を使用して開き、発生中の肢を明らかにすることができます。次に、鋭利なタングステンワイヤーを使用して、ビーズが埋め込まれる肢のつぼみに切開を行います。可能であれば、手足のつぼみを完全に切ることは避けてください。

若い段階ではありますが、これは困難です。ビーズを手に取り、成長因子または極細の時計職人の鉗子を使用して薬剤でコーティングします。ビーズがDMSOまたはフェノールレッドに浸されている場合は、胚に適用する前にPBSですすいでください。

鉗子を使用してビーズを胚に移し、次に鋭利なタングステンワイヤーを使用してビーズを切開位置に挿入します。サプリメントを添加したPBS溶液を卵子に追加1〜2ミリリットル追加して、胚が水分補給されるようにします。溶液を胚自体に直接塗布すると、胚が損傷し、ビーズが外れる可能性があるため、避けてください。

次に、19ゲージの針を備えた10ミリリットルの注射器を使用して、卵子を密封するために使用されるテープに胚が接触しないようにするために必要な量のアルブミンのみを除去します。針が卵黄をシェルの内側に滑り込ませて、卵黄を傷つけないようにします。最後に、卵をテープで密封し、インキュベーターに戻します。

FGF18がMEKを介してERKをリン酸化する作用があることを確認するため、ビーズグラフトの1時間後に胚を採取し、右図のグラフトビーズの周囲にリン酸化ERKが存在するかどうか免疫染色しました。HHステージ21では、MyoDは発達中の四肢筋芽細胞では発現しません。発育中の体節の筋節に染色が見られますが。

FGF18ビーズグラフトの6時間後、筋芽細胞のビーズ付近にMyoDが誘導されていることが分かります。反対側の肢には表現がありませんが。この発現は、U0126などのMEK阻害剤でコーティングされたビーズを共グラフトすることにより阻害することができる。

同様に、U0126ビーズをHHステージ21で移植すると、未治療の対側肢と比較して、24時間後のMyoDの内因性発現が減少します。四肢芽では、HHステージ19では、FGF18はMyoDを誘導しません。しかし、FGF18に浸したビーズとレチノイン酸拮抗薬を共移植することでこれを克服でき、異所性MyoDが検出されます。

一度習得すると、このテクニックは適切に実行されれば、3〜4分で完了します。この技術の開発により、発生生物学の分野の研究者は、胚発生におけるシグナル伝達を探求する成長因子を探求することができました。この手法を試すときは、胚を乾燥させないことを覚えておくことが重要です。

このビデオを見れば、成長因子のシグナル伝達が発生にどのように影響するかを判断するために、発生中の胚にビーズを移植する方法を十分に理解できるはずです。