光遺伝学機能MRI
April 19th, 2016
このプロトコルは、光遺伝学的機能的磁気共鳴画像法(ofMRI)を成功させるために必要なステップとデータ分析を説明しています。ofMRIは、高磁場fMRIの読み出しと光遺伝学的刺激を組み合わせた新しい技術であり、機能的な神経回路とそのダイナミクスを生きた脳全体にわたって細胞タイプ特異的にマッピングすることを可能にします。
このイメージング手順の全体的な目標は、F-MRIと光遺伝学的刺激を組み合わせて、機能的な神経回路とそのダイナミクスを生きている脳全体に細胞タイプ特異的にマッピングすることです。この方法は、全体的な脳活動の駆動における特定の脳回路要素の役割を決定するなど、神経科学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、細胞タイプ特異的な刺激と、全体的な脳活動の比較的高い空間分解能の読み出しを可能にすることです。
この手順を実演するのは、私の研究室の大学院生であるJia LiuとZhongnan Fangです。テキストプロトコルに記載されているように動物に麻酔をかけた後、電気かみそりで頭を剃り、ベタジンと70%エタノールリンスを使用して皮膚にトリプル外科的スクラブを行います。次に、動物の頭蓋骨を定位固定装置に固定します。
メスを使用して、頭皮の正中線を15〜20ミリメートル切開します。骨膜に取り付けられた外科用止血器を使用して頭皮を引っ込めます。頭蓋骨のラムダとブレグマの位置を特定し、ドリルビットを関心領域(ROI)上に配置します。
脳に穴を開けないように注意しながら、歯科用ドリルでROIに小さな開頭術をドリルで穴を開けます。マイクロリットルシリンジに取り付けられた針を開頭術を通して脳のROIにゆっくりと挿入します。次に、マイクロシリンジポンプコントローラーを使用して、2マイクロリットルのベクター溶液をROIに注入します。
注射が完了したら、10分待ってから、シリンジを毎分0.5ミリメートルの速度でゆっくりと取り外します。注射後、頭蓋骨の表面を乾かします。ROIの座標を確認し、フェルールインプラントを毎分0.5ミリメートルの速度で目標深度に挿入します。
最後に、歯科用セメントを使用してフェルールインプラントを頭蓋骨に取り付けます。歯科用セメントが固まったら、歯科用セメントキャップの周りの縫合糸で切開部を密封します。まず、光ファイバーパッチケーブルをレーザー光源に接続し、パッチケーブルのバレルの先端で出力をパワーメーターで測定します。
適切な電力レベルを調整して、脳内に埋め込まれた光ファイバーケーブルの先端で目的の出力を生成します。動物の目を覆うことにより、インプラントからの光漏れを防ぎます。次に、コイルを動物の頭の上に置きます。
フェルールスリーブを使用して、光ファイバーケーブルをフェルールインプラントにカップ保持します。動物が入ったクレードルをスキャナーの穴に挿入します。人工呼吸器を調整して生理学的値を適切な範囲内に保つことにより、実験全体を通して呼吸数と一回換気CO2および体温を監視します。
MRIスキャナーのトリガーポートからファンクションジェネレーターにBNCケーブルを接続します。位置決めシーケンスを選択し、操作ウィンドウで「スキャン」をクリックします。「続行」をクリックして、動物の頭の位置を画像化します。
脳がアイソセンタにない場合は、動物の頭の位置を調整し、脳がアイソセンタに来るまでポジショニングスキャンを繰り返します。高解像度の解剖学的画像を取得して、脳の全体的な完全性を確認し、光ファイバーインプラントの位置を確認します。次に、T2 重み付けシーケンスを選択します。
スライスの数を調整し、スキャンをクリックして、T2加重高解像度のコロナ解剖学的画像を取得します。最後に、エコーシーケンスをリコールしたマルチスライスグラディエントを選択し、続行をクリックして機能画像を取得します。このプロトコルでは、光遺伝学的 F-MRI を使用して、動物モデルの運動皮質を刺激します。
この活性化マップは、運動皮質と視床の活性化ボクセルを示しており、これらの領域間の長距離シナプス接続を示しています。ここでは、運動皮質の光遺伝学的刺激中に、運動皮質と視床の活性ボクセルについて太字の信号が示されています。視床の血行動態反応機能は、刺激後の運動皮質の反応に対して遅延反応を示します。
このビデオを見れば、移植手術や光遺伝学的機能的磁気共鳴画像法の実施方法についてよく理解できるはずです。このイメージング手順を習得すれば、2時間で完了することができます。この手順を試みる際には、動物を監視し、その生理機能を正常な範囲内に維持することが非常に重要です。
この手順に続いて、神経活動の時間的ダイナミクスを調査するための電気生理学や、オプシンの発現と特異性を検証するための免疫組織化学などの補完的な方法を使用できます。この技術の開発により、神経科学者は無傷の生きた脳の機能的結合性を調査する道が開かれました。MRIスキャナーでの作業は非常に危険であることを忘れないでください。
この手順に従うときは、磁気機器をスキャナーから十分に離すなどの予防策を常に講じる必要があります。
概要
このプロトコルは、高磁場fMRIとオプトジェネティックス刺激を統合する技術である、オプトジェネティック機能的磁気共鳴画像法（ofMRI）の実施手順とデータ分析を概説します。この方法により、研究者は細胞タイプ特異性をもって生きている脳内の機能神経回路とそのダイナミクスをマッピングすることができます。
主要な研究構成要素
科学分野
- 神経科学
- イメージング技術
- オプトジェネティックス
背景
- ofMRIはfMRIとオプトジェネティック刺激を組み合わせます。
- この技術により神経回路の正確なマッピングが可能になります。
- 脳回路機能に関する重要な疑問に答えます。
- 高い空間分解能はこの方法の大きな利点です。
研究目的
- 神経回路の研究にofMRIの使用を示す。
- 研究者向けの詳細なプロトコルを提供する。
- 手順中の生理学的パラメータのモニタリングの重要性を強調する。
使用された方法
- 動物の準備と麻酔。
- 頭蓋骨切開と脳へのベクター溶液注入。
- 光ファイバーケーブルの埋め込みとレーザー光源への接続。
- イメージングとデータ取得のためのMRIスキャナーの使用。
主要な結果
- 活性化マップは運動皮質と視床間の接続を示します。
- 視床での遅延した血行動態反応を示しました。
- イメージング中のオプトジェネティック刺激の成功した実施。
- 手順は約2時間で完了できます。
結論
- ofMRIは脳内の機能的接続性の研究に有用なツールです。
- 手順中は動物の生理を維持することが重要です。
- 補完的な方法は神経活動のダイナミクスの理解を深めることができます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Optogenetic functional MRI (ofMRI) enables cell-type-specific interrogation of neural circuits with whole-brain spatial resolution, supporting target validation in neuropsychiatric drug discovery. By linking precise circuit manipulation to global brain activity readouts, the method enhances mechanistic de-risking and predictive confidence in early-stage target hypotheses. This capability aids portfolio triage by clarifying functional connectivity relevant to disease models and therapeutic mechanisms.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of specific brain circuit elements in driving global activity, supporting therapeutic hypothesis testing.
- Operational Value: Provides cell-type-specific stimulation with high spatial resolution readout of brain dynamics.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates activation maps showing long-range synaptic connections, such as between motor cortex and thalamus, for circuit-based assay design.
- Operational Value: Delivers quantitative BOLD signal measurements enabling comparison of stimulation conditions and network responses.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports disease-relevant system modeling by mapping functional connectivity in intact living brains across healthy and diseased states.
- Operational Value: Facilitates continuity from discovery through preclinical validation via non-invasive, repeatable imaging of neuronal activity.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into discovery biology by enabling hypothesis testing of circuit function, into screening via assay-ready quantitative outputs, and into translational research through disease-relevant connectomic mapping.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing, pathway clarification, and biological de-risking of neural targets.
- Screening: Provides assay standardization, reproducibility, and quantitative BOLD readouts for compound evaluation.
- Analytics: Yields hemodynamic response function data and activation maps to compare circuit engagement across conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity via whole-brain monitoring in disease models.
- Enterprise Reuse: Represents a reusable platform for circuit-based target validation across neuroscience discovery programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity in circuit-based hypotheses.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of circuit-specific brain activation mapping.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk in neuropsychiatric programs.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on circuit-level target engagement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in neuroscience, optogenetics, and MRI physics for surgical implantation and image acquisition.
- Needs high-field MRI scanner, laser light source, fiberoptic implants, and physiological monitoring systems.
- Demands cross-team standardization for surgical protocols, light delivery parameters, and imaging sequences.
- Involves adaptation considerations across species, brain regions, and opsin expression systems.
- Includes practical limitations such as surgical invasiveness, light scattering in tissue, and hemodynamic signal interpretation complexity.
