光遺伝学機能MRI

このイメージング手法の全体的な目的は、f-MRIと光遺伝学的刺激を組み合わせることで、生体脳全体における細胞型特異的な機能的神経回路のマッピングおよびそのダイナミクスを明らかにすることです。本手法は、全脳活動を駆動させる特定の脳回路要素の役割の特定など、神経科学分野における重要な疑問への回答に寄与します。本技術の主な利点は、細胞型特異的な刺激が可能であること、および全脳活動を比較的高い空間分解能で読み出せることです。

本手順の実演は、私の研究室の大学院生であるJia LiuとZhongnan Fangが行います。テキストのプロトコルに従って動物を麻酔した後、電気シェーバーで頭部を剃毛し、Betadineと70% ethanolによる洗浄を用いて皮膚に3回の外科的洗浄を行います。次に、脳定位固定装置で動物の頭蓋骨を固定します。

メスを用いて、頭皮正中線に15～20 mmの切開を加えます。骨膜に外科用止血鉗子を装着し、頭皮を牽引します。頭蓋骨上のLambda（ラムダ）とBregma（ブレグマ）の位置を確認し、ドリルビットを関心領域（ROI）の上に配置します。

歯科用ドリルを用いて、ROI上の頭蓋骨に小さな穿孔を施します。この際、脳を穿刺しないよう注意してください。マイクロリッターシリンジに装着した針を、穿孔部から脳内のROIへゆっくりと挿入します。その後、マイクロシリンジポンプコントローラーを使用して、2 µLのベクター溶液をROIに注入します。

注入が完了した後、10分間待機し、その後0.5 millimeters per minuteの速度でゆっくりとシリンジを抜去します。注入後、頭蓋骨の表面を乾燥させます。ROIの座標を確認し、フェルールインプラントを0.5 millimeters per minuteの速度で標的深度まで挿入します。

最後に、歯科用セメントを用いてフェルールインプラントを頭蓋骨に固定します。歯科用セメントが凝固した後、歯科用セメントキャップの周囲を切開部位に沿って縫合し、密閉します。まず、ファイバーパッチケーブルをレーザー光源に接続し、パワーメーターを用いてパッチケーブルのバレルの先端における出力を測定します。

脳内に植え込まれたファイバー optic ケーブルの先端で目的の出力を得られるよう、適切な出力レベルに調整します。動物の目を覆うことで、インプラントからの光漏れを防ぎます。その後、動物の頭部にコイルを配置します。

フェルールスリーブを使用して、光ファイバーケーブルをフェルールインプラントに固定します。動物を乗せたクレードルをスキャナーのボアに挿入します。実験中は、人工呼吸器を調整して生理学的数値を適切な範囲内に維持しながら、呼吸数、潮式CO2、および体温をモニタリングします。

MRIスキャナーのトリガーポートからファンクションジェネレーターへBNCケーブルを接続します。ポジショニングシーケンスを選択し、操作ウィンドウの「scan」をクリックします。「continue」をクリックして、動物の頭部の位置を撮影します。

脳がアイソセンターに位置していない場合は、動物の頭部の位置を調整し、脳がアイソセンターに配置されるまでポジショニングスキャンを繰り返します。高解像度の解剖学的画像を撮影し、脳全体の完全性を確認するとともに、光ファイバーインプラントの位置を確認します。その後、T2強調シーケンスを選択します。

スライス数を調整した後、「scan」をクリックしてT2強調高解像度冠状断解剖学的画像を取得します。最後に、マルチスライス・グラジエント・エコー法を選択し、「continue」をクリックして機能画像を取得します。このプロトコルでは、動物モデルの運動皮質を刺激するために光遺伝学的f-MRIを使用します。

この活性化マップは、運動皮質と視床における活性化ボクセルを示しており、これらの領域間に長距離のシナプス接続があることを示しています。ここでは、運動皮質への光遺伝学的刺激中に活性化した運動皮質および視床のボクセルが、強い信号として表示されています。視床の血行動態反応関数は、刺激後の運動皮質における反応と比較して、遅延した反応を示しています。

このビデオを視聴することで、植込手術およびオプトジェネティック機能的磁気共鳴画像法の実施方法について十分に理解できるはずです。習得すれば、このイメージング手順は2時間で完了させることができます。この手順を行う際は、動物の状態を監視し、生理機能を正常範囲内に維持することが非常に重要です。

この手順に続き、神経活動の時間的ダイナミクスを調査するための電気生理学や、オプシンの発現と特異性を検証するための免疫組織化学などの補完的な手法を用いることができます。この技術の開発により、神経科学者が生存した脳の完全な状態で機能的結合を調査する道が開かれました。MRIスキャナーを使用した作業は極めて危険であることに留意してください。

本手順を行う際は、磁気機器をスキャナーから十分に離して配置するなど、常に十分な注意を払ってください。