Name: 感染症のためのモデルとしてのオルガノイド：人間の文化とマウス胃オルガノイドとピロリ菌のマイクロインジェクション (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: 学ぶ 胃オルガノイド培養とHelicobacter pyloriマイクロインジェクション技術。マウスおよびヒト由来の成体幹細胞から三次元感染モデルを構築し、病原体と上皮細胞の相互作用を詳細に解析する方法です。

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この研究は、EUマリー・キュリー・フェローシップ（EU/300686-InfO)からS.B.への支援を受け、また、H.C.へのUnited European Gastroenterology Foundationからの研究賞の支援を受けました。技術支援を提供してくださったHarry Begthel氏、Jeroen Korving氏、Hubrechtイメージングセンター、初期オルガノイド培養の支援を提供してくださったMeritxell Huch氏、ディスカッションを提供してくださったYana Zavros氏に感謝いたします。

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</ol>

Hans Cleversは、オルガノイド培養に関するいくつかの特許の発明者です。そうでなければ、著者は開示するものは何もありません。

このプロトコルは、感染生物学のための成体幹細胞からの絶えず拡大する形質転換されていない一次オルガノイドの使用について説明しています。重要なステップは、i)生存腺の単離、ii)オルガノイドの増殖、およびiii)マイクロインジェクションです。以下は、変更、トラブルシューティング、および技術的な考慮事項に関するいくつかの提案です。 
激しい振とうまたはピペッティングを使用して腺を放出し、同様に成功する他の単離方法と比較して、ここで紹介する技術には、組織からの腺の放出を顕微鏡下で直接観察できるという利点があります(ステップ1.2.14)。腺が放出されない場合は、EDTAでのインキュベーションを変えることができます(ステップ1.2.9を参照)。希望する場合は、激しい振とうを使用して腺を単離し、マウス腸陰窩26について説明されているように、顕微鏡下で上清中の腺の存在を制御しようとする。洗浄ステップ中に孤立した腺が崩壊しても、それは重要ではありません。オルガノイドは、以前に実証されたように、断片または単一の幹細胞からでも開始されます13,18,27。 ...

病原体の研究は、in vivoでの感染を模倣するための適切なモデル系に依存しています。使用されるシステムの一部が最適ほど遠いながらいくつかの感染症剤は、適切なモデル系が不足しています。一例としては、胃がんの発症に因果関係である胃の細菌ヘリコバクター・ピロリ （ ピロリ菌 ）、です。まだ癌カスケードの終点を表す癌発生用癌細胞株の根底にある分子メカニズムを分析することを目指して、より適切な細胞培養系の非存在下で、多くの研究。プライマリ、非形質転換細胞は、これらの研究のための優れたモデルとなります。しかし、初代細胞は、ドナーの数が少ないからのみ利用可能であり、より長い期間にわたって培養することができません。近年では、幹細胞研究は、感染生物学の研究のための主要な細胞培養のための新しいソースを提供するために重要な進歩を遂げました。 からの文化3幹細胞源が使用されている：胚性幹細胞（ESC）、人工多能性幹細胞（iPS細胞）または成体幹細胞。このような熱帯熱マラリア原虫 8またはトキソプラズマ原虫 9と7、寄生虫、およびそのようなバクテリオテタイオタオミクロン 10またはサルモネラ菌 11などの細菌、 -彼らは、このようなサイトメガロウイルス1,2またはC型肝炎ウイルスなどのウイルス、3の感染をモデル化するために使用されてきました。最近では、いくつかのアプローチがHで感染をモデル化するために公開されています15 - ESCまたはのiPS細胞12由来オルガノイド、マウスの成体幹細胞21,22またはヒト成体幹細胞13とピロリ菌 。 成体幹細胞からオルガノイド培養物の開発は、マウスの腸上皮から単離された単一の幹細胞が3次元マトリックスに播種された研究に由来すると骨形態形成タンパク質（BMP）16シグナリングを阻害するためにWntシグナル伝達とノギンを高めるためにマイトジェン、RスポンジンのようにEGFを含有する腸の幹細胞の環境を模倣媒体に埋め込 ​​まれました。特にこれらの培養物は、間葉系細胞との共培養を必要としません。これらの条件下では、幹細胞は増殖し、ドメインは腸陰窩細胞、および腸絨毛の細胞を含むドメインを保有して小さな構造を形成します。オルガノイドは、このようにin vivoでの状況を模倣するために、自己組織化。今日、多くのネズミと人間的な組織から成体幹細胞を in vitroで増殖させることができ、そのような小腸および結腸17、胃13,18、肝臓19,20、膵臓21と、それらのin vivoでの対応を、似ているオルガノイドに自己組織化前立腺22。 ここでは、成体幹CELから培養マウスまたはヒトの胃オルガノイドのビデオプロトコルを提供LSはHでそれらを顕微注入すると、 ピロリ菌 。このプロトコルは、以前の報告13,18に基づいています。この方法は、腸のオルガノイドのような他のオルガノイド培養を培養し、感染のために適合させることができます。

<table><tbody><tr><td>Medium</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Invitrogen</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>Invitrogen</td><td>12634-028</td><td></td></tr><tr><td>マトリゲル、GFR、フェノールフリー</td><td>BD</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Invitrogen</td><td>35050-079</td><td>ストック濃度 200 mM、最終濃度 2 mM</td></tr><tr><td>B27</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td>ストック濃度 50 x、最終濃度 1x</td></tr><tr><td>N-アセチルシステイン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165-5G</td><td>ストック濃度 500 mM、最終濃度 1 mM</td></tr><tr><td>マウス組換え EGF</td><td>Invitrogen</td><td>PMG8043</td><td>ストック濃度 500 & micro;g/ml、最終濃度 50 ng/ml</td></tr><tr><td>ヒト組換え体 FGF10</td><td>Peprotech</td><td>100-26</td><td>ストック濃度 100 & マイクロ;g / ml、最終濃度200 ng / ml</td></tr><tr><td>TGF&β;i A-83-01</td><td>トクリス</td><td>2939</td><td>ストック濃度500 & マイクロ;M、最終濃度2 &micro;M&nbsp;</td></tr><tr><td>ニコチンアミド</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0636</td><td>ストック濃度 1 M、最終濃度 10 mM&nbsp;</td></tr><tr><td>[Leu15]-Gastrin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9145</td><td>原液濃度 100 & マイクロ;M、最終濃度 1 nM</td></tr><tr><td>RHOKi Y-27632</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0503</td><td>ストック濃度 10 mM、最終濃度 10 & マイクロ;M</td></tr><tr><td>Wnt3A馴化培</td><td></td><td></td><td>地Clevers Labで作製した安定細胞株 最終濃度50%。細胞はハンス・クレバースから入手できます。</td></tr><tr><td>R-spondin1 馴化培</td><td></td><td></td>地 <td>Kuo Lab. 最終濃度 10% で生成された安定細胞株細胞株は、スタンフォード大学のCalvin Kuoから入手できます。</td></tr><tr><td>Noggin馴化培地</td><td></td><td></td><td>Clevers Labで作製した安定細胞株 最終濃度10%細胞はハンス・クレバースから入手できます。</td></tr><tr><td>R-spondin3</td><td>R&D</td><td>3500-RS/CF</td><td>R-spondinの代替ソース。これは、ヒト腸オルガノイド(1 &micro;g / ml)ですが、胃オルガノイドにはまだありません。</td></tr><tr><td>Noggin</td><td>Peprotech</td><td>120-10</td><td>nogginの代替ソース。これは、ヒト腸オルガノイド(100 ng/ml)で試験されていますが、胃オルガノイドではまだ試験されていません。</td></tr><tr><td>TrypLE express</td><td>Life Technologies</td><td>12605036</td><td>酵素解離ソリューション&nbsp;</td></tr><tr><td>クールセル&reg;アルコールフリー細胞凍結容器</td><td>biocision</td><td>BCS-405</td><td></td></tr><tr><td>Recovery Cell Culture Freezing Medium</td><td>Invitrogen</td><td>12648-010</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotics</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primocin</td><td>Invivogen</td><td>ant-pm-1</td><td>細菌や真菌に対する抗生物質組成物です。文化の開始後に役立ちます。長期的な培養のためには、他の抗生物質に切り替えるか、または何もしないかを選択できます。</td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td>ストック濃度 10,000/10,000 U/ml、最終濃度 100/100 U/ml。長期培養でプリモシンの代わりに使用できます。</td></tr><tr><td>その他</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ピンセット</td><td>Neolabs</td><td>2-1033</td><td>細い先端のピンセットは、組織から筋肉層を除去するのに役立ちます。</td></tr><tr><td>4ウェルマルチディッシュ</td><td>Thermo Scientific</td><td>144444</td><td>他のマルチディッシュを使用することもできます。これらは、外縁が低く、マニピュレーターの可動性が高いため、マイクロインジェクションに特に役立ちました。</td></tr><tr><td>マイクロマニピュレーター</td><td>成重</td><td>M-152</td><td></td></tr><tr><td>マイクロインジェクター</td><td>成重</td><td>IM-5B</td><td></td></tr><tr><td>実体顕微鏡</td><td>ライカ</td><td>MZ75</td><td></td></tr><tr><td>ワークベンチ</td><td>クリーンエア</td><td></td><td>ML2 条件の実体顕微鏡に合うようにカスタムメイド</td></tr><tr><td>ハーバー</td><td>ド大学装置</td><td>GC100T-10</td><td>外径 1mm、内径0.78mm。</td></tr><tr><td>マイクロピペットプーラー</td><td>サッターインスツルメンツ</td><td>フレーミングブラウン マイクロピペットプーラー</td><td></td></tr><tr><td>抗 CAG A 抗体</td><td>サンタクルーズ</td><td>sc-25766</td><td></td></tr></tbody></table>

感染症のためのモデルとしてのオルガノイド：人間の文化とマウス胃オルガノイドとピロリ菌のマイクロインジェクション

Organoids as Model for Infectious Diseases: Culture of Human and Murine Stomach Organoids and Microinjection of Helicobacter Pylori

最近、感染生物学者は、宿主と病原体の相互作用を研究するための新しいより良いモデルの必要性に応えるために、幹細胞由来の培養物を採用しています。胚性幹細胞(ESC)、人工多能性幹細胞(iPSC)、成体幹細胞の3つの細胞源が使用されています。ここでは、成体幹細胞に由来するマウスおよびヒト胃オルガノイドの培養について説明し、胃病原体ヘリコバクターピロリの感染に使用します。ヒト胃腺は、切除材料から単離され、地下マトリックスに播種され、成長因子、上皮成長因子(EGF)、R-スポンディン、ノギン、Wnt、線維芽細胞成長因子(FGF)10、ガストリンおよびトランスフォーミング成長因子(TGF)ベータ阻害剤を含む培地に埋め込まれます。これらの条件下では、胃腺は胃の4つの系統を含む3次元オルガノイドに成長します。オルガノイドは無期限に増殖し、細胞株と同様に凍結および融解できます。感染研究では、細菌をオルガノイドの内腔にマイクロインジェクションします。感染したオルガノイドはイメージングのために処理されます。記載された方法は、他のオルガノイドや他の細菌、ウイルスまたは寄生虫による感染に適応することができる。これにより、初代細胞の感染誘発性変化の研究が可能になります。

このプロトコルは、胃腺（ 図2）の単離を可能にします。腺は、腺はオルガノイド（ 図3）に成長できるように、ラミニンおよびコラーゲンが豊富な3次元フレームワークを提供し、ウェル内ドロップとして固化地下行列、中に播種されています。オルガノイドは、典型的には、小さな嚢胞を開始し、12〜16日以内に、彼らは50〜300ミクロン（ 図4）の直径を有する球状に展開します。いくつかのオルガノイドは、いくつかの小さなbuddingsを開発し、嚢胞性ままになります。後者は通常、健全な成長の文化のサインです。このプロトコルでは、24ウェルプレートの1ウェルは100腺基底行列の50μlの培地500μlのために使用されます。しかし、これは、上方または縮小することができます。 マイクロインジェクションの成功を容易に菌液をオルガノイド（ 図5）を充填し、曇ったように実体顕微鏡下で観察することができます。適切なインキュベーション時間の後、オルガノイドができます任意の所望の分析方...

幹細胞由来の培養物は、感染症をモデル化する大きな可能性を秘めています。ここでは、成体幹細胞に由来するマウスおよびヒト胃オルガノイドの培養について説明する。オルガノイドには、胃病原体であるヘリコバクター・ピロリをマイクロインジェクションします。

Recently infection biologists have employed stem cell derived cultures to answer the need for new and better models to study host-pathogen interactions. ...

この手順の全体的な目的は、オルガノイドを作製し、それを感染生物学の3次元モデルとして利用することです。数年前、私の研究室では、マウスの多くの異なる成体器官における幹細胞マーカーとしてLDR fiveを発見しました。そして、これらの器官から単一の幹細胞を取り出し、それらの器官の小型版であるオルガノイドの形態で培養する方法を習得して以来、オルガノイド技術を用いることで、がんを詳細に研究できるだけでなく、感染症の問題についても研究できることが示されました。がん細胞株を用いて感染生物学をモデル化する場合と比較して、この手法の主な利点は、非形質転換の一次上皮細胞を使用すること、および三次元構造が保持されることです。まず、約1cm²の新鮮な胃組織を用意します。乾燥した10cmのペトリ皿の中で、ピンセットを用いて粘液層と筋層を慎重に除去します。組織を冷たいキレート緩衝液で洗浄し、優しく前後に動かして洗います。洗浄した組織を、新しい乾燥した10 centimeterのディッシュに移します。組織を、1辺が約2～5 square millimetersの大きさの小さな断片に25～50個切り分け、ピンセットを用いて50 milliliterチューブに移します。10 milliliterピペットをキレートバッファーで湿らせた後、50 milliliterチューブにバッファーを10 milliliters加え、ピペッティングで激しく10回吸い上げ、断片を洗浄します。粒子を沈殿させ、上清を除去します。上清が透明になるまで洗浄を繰り返します。次に、1Xキレート緩衝液を20 milliliters分ピペットで加えます。組織片に10 millimolar EDTAを添加し、10分間インキュベートします。室温にて、インキュベーション後2分ごとにチューブを緩やかに転倒混和させ、ピペッティングで穏やかに混ぜ合わせます。10 milliliterピペットを用いて1回行い、組織片を沈殿させた後、上清を除去します。次に、組織片を清潔な10 centimeterディッシュに移し、液体をすべて取り除きます。組織片の上にガラススライドを置き、倒立顕微鏡を用いて10 xの倍率で組織を観察します。ディッシュを持ち上げ、ガラスに軽く圧力をかけます。組織の縁をスライドさせると、腺が放出されたことを示す白濁した状態になります。放出された腺と組織片を30 millilitersの冷 basal medium に回収します。組織片を沈殿させ、腺を含む上清を2本の15 milliliterチューブに回収します。チューブを4°Cで200 ×gで5分間遠心分離します。上清を捨て、得られたペレットを氷上で保存し、腺を確認します。ペレットを60 µLのベースメントマトリックスに懸濁し、氷上で保持します。滅菌済みの1.5 millil

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

このビデオでは、胃病原体ヘリコバクター・ピロリをオルガノイドの内腔にマイクロインジェクションすることにより、胃オルガノイド感染モデルを確立する方法を示します。このモデルは、胃細胞の感染誘発性変化の研究に役立ちます。...

病原菌による胃オルガノイドのマイクロインジェクションによる感染モデルの確立

三次元（3-D）環境中で増殖する細胞は、2-D環境（ 例えば 、フラスコまたはディッシュ）で細胞培養上顕著な改善を示します。ここでは、回転-壁容器（RWV）バイオリアクターが提供する微小重力下で培養ヒト腸粘膜の多細胞3次元器官モデルの開発について説明します。...

微小重力下で増殖させたヒト腸粘膜の多細胞三次元器官型モデルの開発

マウスは、感染症や消化管微生物によって引き起こされる病気を研究する非常に貴重な生体内でモデルを表します。ここで、細菌の植民地化およびピロリ菌のマウス ・...

ヘリコバクター ・ ピロリ感染と胃の病理のマウス ・ モデル

ここを確立する、2 次元の単分子膜に 3 D オルガノイドを転送する人間およびマウス由来 3 次元 (3 D) 胃...

再生の研究のための主な胃上皮単層培養のマウスおよびひと由来

ヒトが誘導した多能性幹細胞 (hiPSC) 由来の腸管オルガノイドは、インビトロで腸内疾患をモデル化する刺激的な機会を提供する。我々は、腸管オルガノイド (iHOs) への hiPSCs の分化、サイトカインによるこれらの iHOs の刺激、およびサルモネラサルモネラの iHO 内腔への微量注入を示し、これによって上皮浸潤の研究を可能にする病原...

サルモネラおよび他の病原体に対する上皮細胞保護を研究・修飾するためのヒト誘導多能性幹細胞由来腸管オルガノイドの使用

我々は、クリプトスポリジウムパルバムによるヒト腸および気道オルガノイドの感染を研究するための卵胞を調造し、スポロゾイツを精製するためのプロトコルを説明する。腸内臓器内膜への寄生虫のマイクロインジェクションとオルガノイドの免疫染色の手順を示す.最後に、オルガノイドから発生した卵胞の単離について述べた。...

マイクロインジェクションによる3D組織由来ヒトオルガノイド培養システムにおけるクリプトスポリジウム感染の研究

ここでは、腸管固有の相互作用のモデリングを可能にする2つのプロトコルを提示する。オルガノイド由来の腸単層および空気液体界面(ALI)培養は、光とバソララルの両方からアクセス可能な十分に分化された上皮の生成を促進する一方で、極性逆腸器官は彼らの極性側を露出させ、高スループットアッセイに適している。...

腸オルガノイドモデルを用いたアプリカル特異的相互作用を研究する培養法

このプロトコルは、単一細胞RNAシーケンシング(scRNAEq)技術を用いて、単細胞レベルで宿主/病原体相互作用を特徴付けるために、彼らの補助的またはバソラターレ側からヒト腸器官に感染する方法を説明する。...

バイオセーフティレベル3(BSL-3)条件下での病原体感染と単一細胞シーケンシングに対する消化管オルガノイドの適応

胃患者由来オルガノイドは研究での利用が増加しているが、標準化された播種密度を持つ単一細胞消化物からヒト胃オルガノイドを生成するための正式なプロトコルが不足している。このプロトコルは、上部内視鏡検査中に得られた生検組織から胃オルガノイドを確実に作成するための詳細な方法を提示します。...

良性胃体および外皮上皮の生検からの患者由来胃オルガノイドの確立と特性評価

このプロトコルは、2Dで培養されたマウス前立腺オルガノイドモデルの生成を記述しています。この検査には、オルガノイド解離、細胞シーディング、分化、上皮の完全性評価、そして尿路病原性大腸菌による体外感染が含まれます。このモデルは頂端のアクセス性を提供し、宿主と病原体の相互作用の研究に適しており、従来の3Dオルガノイドシステムの制約を克服します。...

宿主-病原体相互作用を研究するためのマウス前立腺オルガノイドモデルの生成

本研究は、組織幹細胞由来の腸オルガノイドを用いた細菌感染の in vitro 調査方法を提示します。このプロトコルは、2次元でオルガノイドを培養・分化する方法、浸潤性大...

宿主と細菌の相互作用を研究するための侵入膜抽出物または基底膜抽出物を用いた二次元オルガノイド培養

学ぶ 胃オルガノイド培養とHelicobacter pyloriマイクロインジェクション技術。マウスおよびヒト由来の成体幹細胞から三次元感染モデルを構築し、病原体と上皮細胞の相互作用を詳細に解析する方法です。

感染症のためのモデルとしてのオルガノイド：人間の文化とマウス胃オルガノイドとピロリ菌のマイクロインジェクション

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