フローサイトメトリーによって、A549細胞におけるインフルエンザAウイルスの添付ファイルと内在化を測定

この手順の全体的な目標は、インフルエンザの付着と内在化を測定することです。ウイルスは5 49肺上皮細胞に粒子化します。これは、インフルエンザ、ウイルスが5 49細胞に最初にコールド結合することによって達成され、これにより付着は可能になりますが、ウイルス粒子の取り込みが防止されます。

次に、ウイルスは温度を摂氏37度にシフトすることにより、内部化されます。次に、標識されていないstrp Adenが細胞表面に結合するブロッキングステップ。付着したウイルス粒子と内在化したウイルス粒子を区別するために、付着ウイルスが行われます。

最後に、細胞結合ビオチン化ウイルスをCY3標識ストレプトアビジンとインキュベートし、フローサイトメトリーを使用して染色されたウイルスを検出します。最終的には、付着したウイルスと内在するウイルスの相対的な量が計算されます。この方法では、インフルエンザ、つまり5 0 9細胞に付着して内部化するウイルスの相対的な量についての洞察を得ることができます。

それはまた、異なる細胞株または他のウイルスを使用して他のシステムに適用することができますビオチン化ウイルスを生成し、テキストプロトコルに従って標識ウイルス連鎖球菌DinおよびSI 3標識連鎖球菌Dinの必要量を決定した後、200,000、A 5 49細胞をそれぞれゼロ分として標識した4つの深い井戸チューブを準備します。0分とSTV、30分と30分とSTV。次に、チューブを回転させます。

上清を取り除き、200マイクロリットルのPBSを使用してペレットを再懸濁します。次に、チューブを再度回転させた後、細胞を再懸濁するために5 49標準増殖培地の200マイクロリットルを使用し、インキュベーション後37°Cで30分間インキュベートし、サンプルを遠心分離し、ペレットをPBSの200マイクロリットルに再懸濁します洗浄をもう一度繰り返した後、チューブを氷上で10分間冷却します。チューブが冷えたら、再度回転させ、感染PBSで希釈した100マイクロリットルのビオチン化ウイルスを使用して、氷上で1時間インキュベートした後、ペレットを再懸濁し、スピンを繰り返してPBSで2回洗浄し、ゼロ分サンプルに対して次のサンプルをできるだけ並行して処理します。

紡糸後、100マイクロリットルの3.7%パラフォームアルデヒドまたはPFAを使用して、細胞ペレットを再懸濁します。室温で10分間インキュベートしてから回転させ、固定後にPBSを使用して細胞を2回洗浄します。すべてのサンプルが処理されるまで、摂氏4度で保管してください。

ゼロミニッツプラスSTVサンプルを処理するには、チューブを回転させ、上清を除去し、PBS中の15マイクロリットルのSTV 2%BSAおよび0.1%アジナトリウムを使用して、細胞ペレットを氷上で30分間インキュベートします。次に、遠心分離機にかけ、PBSを使用して、PFAで固定した後、30分間のサンプルを摂氏4度でサンプルをドアにした直後に示したように、細胞を2回洗浄します。スピンしてスーパーネイトを取り除いた後、PBS 2%BSAを使用してサンプルを溶解します。

摂氏37度で30分間インキュベートした後、PBSで洗浄し、PFAで固定します。その後、サンプルを摂氏4度で30分間保存し、STVサンプルを加えます。ペレット化後、37°Cで30分間インキュベートした後、サンプルを200マイクロリットルのPBS 2%BSAに懸濁します。

50マイクロリットルのSTV、2%BSA、0.1%アジナトリウム、PBS中の細胞を回転させて再懸濁し、ICE上で30分間インキュベートしてから、洗浄して固定します。次に、すべてのサンプルを透過性にしてSTV SI threeで染色した後、テキストプロトコルの詳細に従って、サンプルを摂氏4度で保存しました。最後に、フローサイトメトリーでサンプルを分析します。

各サンプル中のCY3つの陽性細胞の割合を決定します。付着したウイルスの割合と、取り込まれたウイルスの相対的な量を計算します。ゼロ分サンプルに示されているテキストプロトコルによれば、ATEDウイルスは、St.V.SI 3つの染色によって視覚化されるように、標的細胞にコールド結合しています。

STVをブロッキングステップとして適用すると、細胞表面でのウイルスはS St.V.SI 3染色では検出できなくなり、シグナルが大幅に減少します。温度を37°Cに上げると、付着したウイルスが細胞に取り込まれます。内在化ウイルスは、非標識STVによるブロッキングに敏感ではないため、示されている30分間のプラスSTVサンプルでは、シグナル強度の劇的な低下は少なくなります。

これは、このビデオで説明されているすべての実験条件に対するSI3陽性細胞の割合です。模擬感染細胞は、実験の背景信号強度を与え、ウイルス付着のネガティブコントロールとして機能します。別のコントロールノイラミニダーゼは、未処理の細胞と比較してIAVの付着を90%強力に抑制します。

TPを枯渇させ、エンドサイトーシスを阻害するアジナトリウムは、感染中と感染後の両方でウイルス粒子の内在化を阻害し、ここに示すように、摂氏37度で30分間インキュベートしたアジナトリウム処理細胞は、同じ条件下でインキュベートされた未処理細胞と比較して内在化が劇的に低下しました。このビデオを見れば、5 0 9細胞内のウイルスであるインフルエンザの付着と内在化を測定する方法についてよく理解できるはずです。このプロトコルは、フローサイトメトリーによる簡便な読み出しを可能にし、他の実験設定にも容易に適応させることができます。