Name: 単一のタンパク質解像度で高並列ナノ細孔チップシステムにより分析膜輸送プロセス (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 55 s
Description: 学ぶナノ細孔アレイチップを用いた高並列膜タンパク質解析法。単一分子レベルでの膜輸送ダイナミクスと輸送挙動を蛍光読み出しで解明し、膜タンパク質スクリーニングの新たなアッセイ開発に貢献します。

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私たちは、SOPの確立に協力してくれたBarbara Windschieglに感謝します。Dennis Remme は NanoCalcFX ソフトウェアに関する彼の仕事に対して、Alina Kollmannsperger、Markus Braner および Milan Gerovac は原稿に関する有益な提案に対して。DFGと連邦教育研究省がR.T.に提供したドイツ・イスラエルプロジェクト協力(DIP)、および連邦経済技術省(ZIM R&Dプロジェクト)がR.T.とNanospot GmbHに提供したプロジェクト協力(DIP)がこの作業を支援しました。

<ol><li>Yildirim, M. A., Goh, K. I., Cusick, M. E., Barabasi, A. L., Vidal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug-target+network%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Drug-target network.</a> Nat Biotechnol. 25, 1119(2007).</li>
<li>Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+patch-clamp+techniques+for+high-resolution+current+recording+from+cells+and+cell-free+membrane+patches%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches.</a> Pflugers Arch. 391, 85-100 (1981).</li>
<li>Osaki, T., Suzuki, H., Le Pioufle, B., Takeuchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multichannel+simultaneous+measurements+of+single-molecule+translocation+in+%CE%B1-hemolysin+nanopore+array%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Multichannel simultaneous measurements of single-molecule translocation in α-hemolysin nanopore array.</a> Anal. Chem. 81, 9866-9870 (2009).</li>
<li>Carrillo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+membrane+capacitance+measurements+for+studying+endocytosis+and+exocytosis+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">High-resolution membrane capacitance measurements for studying endocytosis and exocytosis in yeast.</a> Traffic. , (2015).</li>
<li>Giacomini, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+transporters+in+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Membrane transporters in drug development.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 9, 215-236 (2010).</li>
<li>Castell, O. K., Berridge, J., Wallace, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+membrane+protein+inhibition+by+optical+ion+flux+in+a+droplet+interface+bilayer+array%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Quantification of membrane protein inhibition by optical ion flux in a droplet interface bilayer array.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 51, 3134-3138 (2012).</li>
<li>Zollmann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+liposome+analysis+of+peptide+translocation+by+the+ABC+transporter+TAPL%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Single liposome analysis of peptide translocation by the ABC transporter TAPL.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 112, 2046-2051 (2015).</li>
<li>Tamm, L. K., McConnell, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supported+phospholipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Supported phospholipid bilayers.</a> Biophys. J. 47, 105-113 (1985).</li>
<li>Sackmann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supported+membranes%3A+scientific+and+practical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Supported membranes: scientific and practical applications.</a> Science. 271, 43-48 (1996).</li>
<li>Castellana, E. T., Cremer, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solid+supported+lipid+bilayers%3A+From+biophysical+studies+to+sensor+design%5BTitle%5D)+AND+%22Surf.+Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Solid supported lipid bilayers: From biophysical studies to sensor design.</a> Surf. Sci. Rep. 61, 429-444 (2006).</li>
<li>Wagner, M. L., Tamm, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tethered+polymer-supported+planar+lipid+bilayers+for+reconstitution+of+integral+membrane+proteins%3A+silane-polyethyleneglycol-lipid+as+a+cushion+and+covalent+linker%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Tethered polymer-supported planar lipid bilayers for reconstitution of integral membrane proteins: silane-polyethyleneglycol-lipid as a cushion and covalent linker.</a> Biophys. J. 79, 1400-1414 (2000).</li>
<li>Naumann, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+polymer-supported+phospholipid+bilayer%3A+tethering+as+a+new+approach+to+substrate-membrane+stabilization%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">The polymer-supported phospholipid bilayer: tethering as a new approach to substrate-membrane stabilization.</a> Biomacromolecules. 3, 27-35 (2002).</li>
<li>Weiskopf, D., Schmitt, E. K., Klühr, M. H., Dertinger, S. K., Steinem, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-BLMs+on+highly+ordered+porous+silicon+substrates%3A+Rupture+process+and+lateral+mobility%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Micro-BLMs on highly ordered porous silicon substrates: Rupture process and lateral mobility.</a> Langmuir. 23, 9134-9139 (2007).</li>
<li>Watanabe, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arrayed+lipid+bilayer+chambers+allow+single-molecule+analysis+of+membrane+transporter+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Arrayed lipid bilayer chambers allow single-molecule analysis of membrane transporter activity.</a> Nat. Commun. 5, (2014).</li>
<li>Stamou, D., Duschl, C., Delamarche, E., Vogel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-Assembled+Microarrays+of+Attoliter+Molecular+Vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Self-Assembled Microarrays of Attoliter Molecular Vessels.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 115, 5738-5741 (2003).</li>
<li>Lohr, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Liposomes+Used+to+Study+the+Activity+of+Individual+Transporters%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Single Liposomes Used to Study the Activity of Individual Transporters.</a> Biophysical Journal. 106, 229a(2014).</li>
<li>Dunlop, J., Bowlby, M., Peri, R., Vasilyev, D., Arias, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+electrophysiology%3A+an+emerging+paradigm+for+ion-channel+screening+and+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">High-throughput electrophysiology: an emerging paradigm for ion-channel screening and physiology.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 7, 358-368 (2008).</li>
<li>Milligan, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robotic+multiwell+planar+patch-clamp+for+native+and+primary+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Robotic multiwell planar patch-clamp for native and primary mammalian cells.</a> Nat. Protoc. 4, 244-255 (2009).</li>
<li>Soga, N., Watanabe, R., Noji, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attolitre-sized+lipid+bilayer+chamber+array+for+rapid+detection+of+single+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Attolitre-sized lipid bilayer chamber array for rapid detection of single transporters.</a> Sci. Rep. 5, (2015).</li>
<li>Kleefen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+parallel+single+transport+recordings+on+nanopore+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Multiplexed parallel single transport recordings on nanopore arrays.</a> Nano Lett. 10, 5080-5087 (2010).</li>
<li>Wei, R., Gatterdam, V., Wieneke, R., Tampé, R., Rant, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+sensing+of+proteins+with+receptor-modified+solid-state+nanopores%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">Stochastic sensing of proteins with receptor-modified solid-state nanopores.</a> Nat. Nanotechnol. 7, 257-263 (2012).</li>
<li>Urban, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+parallel+transport+recordings+on+a+membrane-on-nanopore+chip+at+single+molecule+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Highly parallel transport recordings on a membrane-on-nanopore chip at single molecule resolution.</a> Nano Lett. 14, 1674-1680 (2014).</li>
<li>Kusters, I., Van Oijen, A. M., Driessen, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane-on-a-Chip%3A+Microstructured+Silicon%2FSilicon-Dioxide+Chips+for+High-Throughput+Screening+of+Membrane+Transport+and+Viral+Membrane+Fusion%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Membrane-on-a-Chip: Microstructured Silicon/Silicon-Dioxide Chips for High-Throughput Screening of Membrane Transport and Viral Membrane Fusion.</a> ACS Nano. 8, 3380-3392 (2014).</li>
<li>Hansen, J. S., Thompson, J. R., Hélix-Nielsen, C., Malmstadt, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+directed+intrinsic+membrane+protein+segregation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Lipid directed intrinsic membrane protein segregation.</a> J. Am. Chem. Soc. 135, 17294-17297 (2013).</li>
<li>Heinemann, F., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+Micrometer-Sized+Free-Standing+Membranes%5BTitle%5D)+AND+%22ChemPhysChem%22%5BJournal%5D)">Preparation of Micrometer-Sized Free-Standing Membranes.</a> ChemPhysChem. 12, 2568-2571 (2011).</li>
<li>Lazzara, T. D., Carnarius, C., Kocun, M., Janshoff, A., Steinem, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separating+attoliter-sized+compartments+using+fluid+pore-spanning+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+nano%22%5BJournal%5D)">Separating attoliter-sized compartments using fluid pore-spanning lipid bilayers.</a> ACS nano. 5, 6935-6944 (2011).</li>
<li>Winterhalter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Black+lipid+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Colloid+Interface+Sci%22%5BJournal%5D)">Black lipid membranes.</a> Curr. Opin. Colloid Interface Sci. 5, 250-255 (2000).</li>
<li>Koçer, A., Walko, M., Feringa, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+utilization+of+reversible+and+irreversible+light-activated+nanovalves+derived+from+the+channel+protein+MscL%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Synthesis and utilization of reversible and irreversible light-activated nanovalves derived from the channel protein MscL.</a> Nat. Protoc. 2, 1426-1437 (2007).</li>
</ol>

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

ここで紹介する手法は、膜タンパク質輸送の高度な並列分析を可能にします。再構成された膜タンパク質系は、直接、理論的にすべての膜輸送体またはチャネル可能の適応を行う、バイオチップに適用することができます。輸送解析は、唯一の直接蛍光変化（蛍光体の転座または蛍光標識された基質）または間接的な蛍光変化（pH感受性色素、二次酵素反応）のいずれかを介して、蛍光読み出しシステムの確立によって制限されます。後者は、しかし、まだ確立されなければなりません。 単一のタンパク質レベルでの膜チャネルまたはトランスポーターの機能解析は、この技術の主な焦点です。自動顕微鏡と組み合わせて、タンパク質エフェクターのスクリーニングアプリケーションの設置も可能です。アッセイのセットアップは、各チップ上に複数のアッセイポイントで、最大8チップの並列記録を可能にします。条件が確立された後ため、チップの完全な分離のために、それは、単一の実験内のコントロールを含む複数の実験の繰り返しを可能にする、真に平行です。 実験のセットアップ時に重要なステップは、チップ表面上のプロテ...

膜タンパク質の分析は、過去20年間で基礎および医薬品の研究のための関心が高まっになっています。新規薬剤の開発は、現在、制限要因の一つである、新たな標的の同定および詳細な特性に依存します。すべての薬物標的の約60％が膜タンパク質1であるという事実は、最も重要なその機能を解明するための技術の開発を行います。 4 -過去には、起電チャンネルおよびトランスポーターの研究のための技術は、多数の2で開発されてきました。逆における非起電性基板は、より多くの困難な課題を提示します。彼らはカスケード5のシグナル伝達に重要な受容体などの細胞膜と機能を横切る溶質および栄養素のフラックスを制御するように、彼らは、しかしプライム薬物標的としての特別な関心のです。 かなりの努力がトンの開発に置かれていますechniques膜輸送タンパク質6、7の機能を研究します。いくつか例を挙げると固体担持脂質二重層、繋留二重層11、12、microblackの脂質膜13、14およびネイティブベシクルアレイ15、16を含む10、 -固体支持膜を用いたシステムでは、このフィールド8として最も有望なツールを浮上しています。それらのいくつかは、市販のセットアップ17、18のようにしてもご利用いただけます。いくつかの実施例は、高度に並列に14、19、スクリーニング用途のための前提条件で単一の膜タンパク質を研究する能力を組み合わせること公開されています。しかし、これらの方法はほとんどの産業環境への基礎研究から橋渡しません。困難は、多くの場合、自動化するシステムの能力は、コストのかかる生産および/または面倒な準備にあります。アプローチoを上記の全ての障害をvercomingすることは、最終的な目標です。 22 -ここで紹介する手法は、単一のタンパク質レベル20に制御された環境で、in vitroで膜チャネルおよびトランスポーターを研究するために開発されました。 26または黒色脂質膜27 - LUVをに精製された膜タンパク質の再構成は、はるかにGUVs 23で同等のアプローチよりも確立されています。二重層の形成は自己集合プロセスを介して行われている場合、それらは直接チップ表面に適用することができます。ナノ多孔性チップ（ 図 1）のガラスボトム設計により、システムの簡単な自動化を可能にする空気顕微鏡を可能にします。電動ステージとの組み合わせで複数のチップを、分析のために密封された空洞の数千人を含むビューの各フィールドで、同時に測定することができます。 図 1。多重化されたナノ細孔のバイオチップの設計 A）は、シリコン・オン・インシュレータ（SOI）ウエハを反応性イオンエッチングにより構成されています。約1150個々のチップは、同一の特性と品質。B）各チップは、ナノ開口を備え25万個々のマイクロキャビティを備えるとともに、各ウェハから製造されます。スケールバー：200μmのC）各キャビティは、マルチスペクトル蛍光読み出しを経由してアドレス可能です。 intransparent上層倒立蛍光顕微鏡とバイオチップの互換性行うブロックバッファリザーバからの蛍光シグナルを、D）原子間力顕微鏡（AFM）イメージングが均一に配置された孔の開口部および3.6ナノメートルの二酸化ケイ素層の表面粗さを（明らかに、N = 40）小胞の融合のために最適。スケールバー：5μmのE）走査型電子マイクroscopy（SEM）画像は、シリコンチップ内のフェムトリットルの空洞へのアクセスを可能にするナノ細孔の断面を示しています。この数字は21から許可を得て再利用した。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53373/53373fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> すべてのデータ分析は、エンドユーザのための無制限のアクセスを保証するためにフリーウェアを使用して実行されます。時系列は、フリーの画像処理ソフトウェアとバッチ処理と曲線の複数の蛍光チャネルおよび何千も大きなデータセットの単純な相関関係を可能にするカスタムビルド曲線分析ソフトウェアを用いて分析します。 このプロトコルで使用されるモデルタンパク質は、E由来大コンダクタンス（MSCL）チャネルタンパク質の機械受容チャネルであります大腸菌 。それは、本質的に浸透圧ショックを放出する弁として機能するが、合理的にSYNT設計ように変更されましたhetic機能は、共有チャネルの収縮側に取り付けることができます。共有結合した活性化剤（MTSET）の電荷反発を経由してチャンネルがナノバルブを作成、開くようにトリガされます。イオン、水、小さなタンパク質だけでなく、小型の蛍光団のような小分子は、チャネルを介して透過することができます。ここでは、タンパク質は、タンパク質媒介転座を検出するシステムの能力を実証するためのモデルとして使用されます。

<table><tbody><tr><td>試薬</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>[2-(トリメチルアンモニウム)エチル] メタネチオスルホン酸</td><td>トロントリサーチケミカルズ株式会社</td><td>T792900</td><td>MTSET; 水によって加水分解されます。乾燥プーダーアリコートとして-80°Cで保管し、緩衝液に可溶化した後すぐに(30分)使用してください。</td></tr><tr><td>1 ml ガスタイト シリンジ</td><td>ハミルトン</td> <td>#1001</td><td></td></tr><tr><td>10 ml ラウンド フラスコ</td><td>ショット デュラン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2.7 mm ガラス ビーズ</td><td>ロス</td><td>N032.1</td><td></td></tr><tr><td>2-プロパノール</td><td>ロス</td><td>9866.5</td><td></td></tr><tr><td>30 cm ルアーロック延長チューブ</td><td>サーシュテット</td><td>744304</td><td></td></tr><tr><td>アセトン</td><td>ロス</td><td>5025.5</td><td></td></tr><tr><td>バイオビーズ SM-2吸着剤</td><td>Bio-Rad</td><td>152-3920</td><td>は、CaCl</td></tr><tr><td>2 Dihydrat</td><td></td><td>Roth HN04.3</td><td></td></tr><tr><td>Calcein</td><td>Sigma</td><td>C0875</td><td>storeが -20 °C で暗い状態になる前に活性化する必要があります。C</td></tr><tr><td>クロロホルム試薬グレード</td><td>VWRケミカルズ</td><td>22711324</td><td></td></tr><tr><td>DOPEATTO390</td><td>ATTO-TEC</td><td>AD 390-165</td><td>-20 >C</td></tr><tr><td>エタノール アブソリュート</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>32205</td><td></td></tr><tr><td>Injekt シングルユース シリンジ</td><td>ブラウン</td><td>460 60 51V</td><td></td></tr><tr><td>Injekt-F シングルユース シリンジ</td><td>ブラウン</td><td>91 66 017V</td><td></td></tr><tr><td>ケック クリップ</td><td>ショット</td><td>KC29</td><td></td></tr><tr><td>L-&α;-ホスファチジルコリン、20% (大豆)</td><td>アバンティ極性脂質</td><td>5416016</td><td>-20 >C</td></tr><tr><td>NaCl 99.5% 年率</td><td>Roth</td><td>3957.2</td><td></td></tr><tr><td>Nanopore E100 wafer/tips</td><td>Micromotive (Mainz/Germany)</td><td></td><td>ご要望に応じて入手可能</td></tr><tr><td>Nucleopore Track-Etch Membrane 0.4 &micro;m</td><td>Whatman</td><td>800282</td><td></td></tr><tr><td>Oregon Green Dextran 488 (70 kDa)</td><td>life Technologies</td><td>D-7173</td><td>store dark at -20 &deg;C</td></tr><tr><td>Oy647</td><td>ルミナルティス (M&uuml;nster /ドイツ)</td><td>OY-647-T-1mg</td><td>-20°Cで暗いC</td></tr><tr><td>ロチラボシリンジろ過、非滅菌、細孔サイズ0.22 &micro;m</td><td>Roth</td><td>P 818.1</td><td></td></tr><tr><td>Sephadex G-50</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5080</td><td>サイズ排除クロマトグラフィー用カラム材料</td></tr><tr><td>Silastic MDX4-4210</td><td>ダウ コーニング</td><td></td><td>カバーガラスへのチップ固定用硬化剤 ガラスサポート</td></tr><tr><td>スティッキー-スライド 8 ウェル</td><td>同上</td><td>80828</td><td>マルチウェルチャンバー スライドガラス (チップホルダー)</td></tr> 3 <tr><td>方向ストップコック ブルー</td><td>Sarstedt</td><td>744410001</td><td></td></tr><tr><td>Tris Pufferan 99.9% Ultra Quality</td><td>Roth</td><td>5429.2</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Roth</td><td>6683.1</td><td></td></tr><tr><td>Whatman 0.2 & micro;mセルロース硝酸塩膜</td><td>フィルターRoth</td><td>NH69.1</td><td></td></tr><tr><td>名前</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>B&uuml;chi 461ウォーターバス</td><td>B&uuml;</td><td></td><td></td>chi</tr><tr><td>B&uuml;chi Rotavapor RE 111</td><td>B&uuml;</td><td></td><td></td>chi</tr><tr><td>Cary Eclipse 蛍光分光計&nbsp;</td><td>Varian</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LiposoFast ミニ押出機</td><td>Avestin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>メンブレン ポンプ&nbsp;</td><td>Vaccubrand</td><td>15430</td><td></td></tr><tr><td>Nanosight ナノ粒子追跡顕微鏡</td><td>マルバーン/Nanosight</td><td>LM 14C</td><td></td></tr><tr><td>NyONE 顕微鏡 Synentec</td><td></td><td></td><td>ご要望に応じて利用可能</td></tr><tr><td>ポンプ制御</td><td>Vaccubrand</td><td>CVC 2II</td><td></td></tr><tr><td>ソニケーターバス ソノレックス RK100H</td><td>ブランデリン 電子</td><td>31200001107477</td><td></td></tr><tr><td>真空ポンプ RC5</td><td>Vaccubrand</td><td>1805400204</td><td></td></tr><tr><td>ウォーターバスW13</td><td>Haake</td><td>002-9910</td><td></td></tr><tr><td>プラズマクリーナーPDC-37G</td><td>ハリックプラズマ</td><td>PDC-37G</td><td></td></tr><tr><td>名前</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>ソフトウェア</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>オープンソース</td><td></td> <td>http://imagej.nih.gov/ij/ 科学画像処理ソフトウェア</td></tr><tr><td>NanoCalcFX</td><td>フリーウェア</td><td>http://sourceforge.net/projects/nanocalc/ 大量</td><td>輸送速度論データセットのデータ解析・評価ソフトウェア</td></tr><tr><td>NTA 2.3 解析ソフトウェア</td><td>Nanosight</td><td></td><td>ナノ粒子追跡用データ取得・解析ソフトウェア顕微鏡</td></tr><tr><td>NTA 2.3 温度通信</td><td>ナノ粒子追跡顕微鏡用</td><td>Nanosight</td><td></td>温度制御ソフトウェア</tr></tbody></table>

単一のタンパク質解像度で高並列ナノ細孔チップシステムにより分析膜輸送プロセス

Membrane Transport Processes Analyzed by a Highly Parallel Nanopore Chip System at Single Protein Resolution

転位した基板は、非起電性である場合、単一のタンパク質レベルでの膜タンパク質の輸送はまだ、詳細な分析を忌避します。かなりの努力がこの分野で行われているが、膜トランスポーターの解析に必要な溶媒を含まない脂質二重層の技術と組み合わせて、自動化ハイスループットトランスポート分析を可能にする技術はまれです。トランスポーターのこのクラスは、しかし、細胞の恒常性において非常に重要なので、薬剤開発や新たな洞察を得るための方法論における重要な目標は必死に必要です。 ここで紹介する原稿は、単一のトランスポーター解像度で膜タンパク質媒介輸送プロセスの分析のための新規バイオチップの確立と取り扱いについて説明します。バイオチップは、その設計において非常に平行であり、工業用グレードおよび量で製造することができるナノポアで囲まれたマイクロキャビティから構成されています。プロテイン保有するリポソームは、直接に適用することができますSSM-技術（固体担持脂質膜）を用いた自己組織化細孔スパニング脂質二重層を形成するチップ表面。膜のポア貫通部分は、中またはリアルタイムでマルチスペクトル蛍光読み出しを続けることができ、キャビティ空間のうち基板転位のためのインターフェースを提供し、自立しています。標準作業手順書（SOP）の設立は、機能的に再構成することができる事実上すべての膜タンパク質のチップ表面上のタンパク質-保有脂質二重層の簡単な設置を可能にします。唯一の前提条件は、非起電輸送基質用の蛍光読み出しシステムの確立で​​す。 ハイコンテンツスクリーニング用途は、並行して複数のチップを記録し、自動化倒立蛍光顕微鏡を使用することによって達成できるです。大きなデータセットを自由に利用できるカスタム設計解析ソフトウェアを用いて分析することができます。三色のマルチスペクトル蛍光読み出し、さらに、偽陽性の結果を排除し、別のイベントクラスに公平なデータ判別を可能にします。 チップ技術は、現在のSiO 2表面に基づいているが、金でコーティングされたチップ表面を使用してさらに官能化することも可能です。

ポア貫通膜は容易に自己集合したようにナノ構造チップ表面上に作成することができます。しかし、根本的なプロセスはまだ繊細でリポソームのサイズ、リポソーム集団の単分散性、ラメラ、脂質や塩分濃度と化学的表面特性のような多くのパラメータの影響を受けています。これらのパラメータのほとんどは、慎重に特徴付けられ、上記のプロトコルで標準化されています。他のパラメータは、しかし、成功した実験を確実にするために、すべての新規作成時にチェックする必要があります。これらは、リポソームのサイズ分布及び集団の分散度（ 図 2 A）です。最適な細孔膜貫通形成のために、よく細孔径上記キャビティ空間リポソームサイズにリポソーム侵入を避けるためには必需品です。また、単分散のリポソーム製剤は、膜拡散及びFUSIで最良の結果をもたらすことが示されていますに。すべての準備のためにチェックしなければならないもう一つの重要なステップは、再構成後のタンパク質活性です。 MSCL G 22...

提示されたプロトコルは、細孔スパンの溶媒を含まない脂質二重層を使用した単一トランスポーターレベルでの膜タンパク質媒介輸送の分析を説明しています。これは、大量生産されたナノポアアレイチップの作成と、高度に並列化されたデータ取得および分析を組み合わせることで達成され、膜タンパク質エフェクタースクリーニングの将来の確立が可能になります。

Membrane protein transport on the single protein level still evades detailed analysis, if the substrate translocated is non-electrogenic. Considerable ...

このナノ構造チップベースのプラットフォームの全体的な目的は、膜タンパク質の機能を単分子レベルで高度に並列的に解析することです。単一タンパク質を分解能高く識別できる能力により、膜輸送およびフラックスに関する新たな知見が得られます。この手法は、単一のチャネルやトランスポーターの導電性や輸送挙動、特に非電位発生性の貨物を運ぶものなどの、膜タンパク質分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。この技術の主な利点は、数十万個のナノポアを備えたナノ構造チップ設計と、輸送イベントの蛍光読み出しによる高い並列性にあります。この技術の意義は、膜タンパク質の効果的なライブラリを用いた最適なアッセイの構築にまで及びます。これは、チップベースのプラットフォームにより、高度に並列化された自動輸送記録が可能になるためです。一般的に、この手法に初めて取り組む方でも、提示されたテクニックを迅速に習得することができます。誰もが導入できるよう、常にユーザーフレンドリーなアッセイを構築することに焦点を当てました。この膜輸送アッセイでは、反応性イオンエッチングを用いて設計されたシリコンオンインシュレーター（SOI）ウェハーを使用しています。1枚のウェハーから約1,000個のアッセイチップが作製されます。各チップには250,000個のマイクロキャビティが含まれています。これらのキャビティは、目的の輸送タンパク質を含む脂質二重層によって封止されます。膜はセンサーインターフェースを構成します。当初、蛍光物質は脂質二重層の一方の側、すなわちそれらが構成するリポソームの内部に封じ込められています。各キャビティは、マルチスペクトル蛍光読み取りによってアドレス指定可能です。不透明な最上層がバッファーリザーバーからの蛍光信号を遮断するため、このバイオチップは倒立蛍光顕微鏡での使用が可能です。原子間力顕微鏡を用いた測定により、均一に配置されたポア開口部および二酸化ケイ素層の表面粗さは3.6 nanometersであり、小胞融合に最適であることが確認されました。走査電子顕微鏡では、シリコンチップ内部のフェムトリットルキャビティへと繋がるナノポアの断面が示されています。このビデオでは、プロテオリポソームの調製、アッセイ用チップの調製、および基本的なアッセイの実施方法を示します。エタノールで洗浄した丸底フラスコをロータリーエバポレーターに接続します。300 millibar、ウォーターバス温度 30 °C、最大回転速度で40分間脂質フィルムを乾燥させ、フラスコのガラス壁面上に均一な脂質フィルムを形成させます。次に、高真空ポンプを用いて、室温でさらに30分間脂質フィルムを乾燥させます。続いて、バッファー5 mLとエタノール洗浄済みのガラスビーズ8個をフラスコに加え、多層小胞を調製します。フラスコをロータリーエバポレーターに接続し、真空をかけずに50 °Cの最高速度で回転させます。45分後、溶液は乳白色になり、壁面に脂質の膜が残っていない状態になります。フラスコを不活性ガス条件下で超音波洗浄機に移し、室温で4分間ソニケーションを行います。ソニケーションによりリポソームが破壊され、単層ラメラ構造になります。次に、LUV溶液を1 mLずつ分注し、液体窒素と40 °Cのウォーターバスを用いて凍結融解サイクルを5回繰り返します。これにより、リポソームの破裂、再編成、および増大が起こります。最後の凍結ステップの後、すべてのサンプルを-80 °Cで保存します。LUVのアリコートを再構成する前に、ミニエクストルーダーを用いて、アリコートを400 nanometerのポリカーボネートフィルターメンブレンに17回通過させ、リポソームをエクストルードします。次に、溶液中に0.25%となるように4%Triton X-100を添加し、LUVを不安定化させます。この混合物を50 degrees Celsiusで5分間インキュベートします。次に、精製・修飾したMscL 1部分を、界面活性剤飽和リポソーム 20部分に混ぜ合わせ、さらに30分間インキュベートします。インキュベーション後、100 µLの分注液を採取し、同量の30 mM calcineを加えます。この混合物を50 °Cで5分間インキュベートしてください。次に、カルシン処理済みおよび未処理のサンプルから界面活性剤を除去します。それぞれにTris緩衝液で湿らせたバイオビーズを加え、回転プレートを用いて4°Cで一晩インキュベートします。実験の前に、活性測定法を用いて調製状態を確認してください。まず、エラストマーベースを硬化剤に混ぜ合わせ、混合物が完全に乾燥するまで脱水させます。接着剤は、準備完了後30分以内に使用する必要があります。その間、注意を払いながら、ガラスシリンジを用いて5 mLのクロロホルムでカバーガラススライドを洗浄し、スライドを乾燥させます。次に、10 µL ピペットを使用して、調製した接着剤をカバーガラス上に滴下します。その後、精密ピンセットを用いて、ウェハーボードからチップを慎重に取り出します。チップのコーティング面を上に向けた状態で接着剤の上に置き、スライドに軽く押し当てて、接着剤を均一に分散させます。気泡が下に閉じ込められたり、接着剤がチップの上に付着したりしないように注意してください。また、アセンブリが8チャンバースライドホルダーに適合するように組み立てます。次に、キャビネット dryerを用いて、65 °Cで2時間、アセンブリを乾燥させます。その後、54 °Cで溶媒洗浄を数回行い、チップ上の保護層を除去します。まず、マウントしたチップをスライドホルダーに入れます。次に、3種類の溶媒浴にそれぞれ10分間浸漬します。イソプロパノール、アセトン、そしてイソプロパノールを用います。次に、チップを超純水で注意深く、かつ十分に洗浄します。最後に、窒素ガスの緩やかな気流でチップを乾燥させ、工程を完了します。次に、8ウェルの粘着スライドを準備し、ベンチ上に裏返して置きます。その後、カバーグラスを慎重に持ち上げ、チップがウェル側を向くように粘着スライド上に押し付けます。次の工程に進む前に、この状態で数分間静置してください。転位アッセイに進む前に、テキストプロトコルに記載されている通りにチップアセンブリを十分に洗浄し、最後にTris緩衝液での浸漬処理を行います。次に、バス溶液を、5 mMの塩化カルシウムと1 µMのOy647染料を含むDOPE添加Tris緩衝液に交換します。続いて、最終濃度が1 mg/mLになるようにプロテオリポソームをチップチャンバーに添加し、1時間待ちます。1時間後、チップをカルシウムフリーのTrisバッファー400 µLで4回洗浄します。次に、各ウェルにコントロール色素を5 µMになるように加え、アッセイを進めます。続いて、チップホルダーをエピ蛍光顕微鏡に取り付け、ナノポアチップの縁に焦点を合わせてマイクロキャビティを探します。マイクロキャビティにピントが合ったら、ナノポアアレイをスキャンして、シーリング比（ceiling ratio）が最も高い領域を探します。詳細はテキストプロトコルに記載されています。リポソームを調製し、そのサイズ分布と分散性を確認しました。調製したリポソームが、アッセイの孔径よりも大きくなることが不可欠です。また、リポソームが単分散であることも望ましいです。実験前に、リポソーム調製における修飾MscLタンパク質を蛍光デクエンチングアッセイを用いて確認しました。活性化した変異型MscLを保持するリポソームの割合は、転移実験を進行させるのに十分であった。バイオチップ上において、変異型MscLチャネルを介した蛍光標的分子の溶質転移が観察された。化学修飾剤であるMTSETを用い、静電反発によって構築したMscLチャネルを開口させた。続いて、キャビティ空間内の蛍光の減少をモニタリングした。このプロセスは再現性が高く、流出イベントが非常に一貫していることが示された。得られた流出曲線は、単一チャネルまたはマルチチャネルの転位イベントに対応する、2つの明確な集団に分類された。本システムでは、最大3色の異なる蛍光色素をリアルタイム解析で追跡することが可能です。これにより、陽性結果、単一指数関数的な排出イベント、複雑なキネティクス、脂質の侵入、および膜の破裂を正確に識別できます。この手法を習得すれば、チップの作製、試料の調製、イメージング、および解析という連続したステップで実行できるため、プロトコル全体をモジュール化することが可能です。

membrane-transport-processes-analyzed-highly-parallel-nanopore-chip

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JoVE Journal

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生物学

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ナノポアシーケンシングは、遠隔地でのコスト効率の高いシーケンシングと、リソースの乏しい設定を可能にする新しいテクノロジーです。ここでは、このような条件に適合する全血からの mRNAs...

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このプロトコルは、iSCATベースの画像処理と単粒子追跡アプローチを記述し、脂質膜と相互作用する高分子の分子量と拡散挙動の同時調査を可能にします。サンプル調製、質量コントラスト変換、ムービー取得、および後処理に関するステップバイステップの手順が、潜在的な落とし穴を防ぐための指示とともに提供されます。...

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全反射蛍光(TIRF)顕微鏡を用いた脂質二重膜の横方向移動度とイオンチャネル活性の1分子イメージング(英語)

学ぶナノ細孔アレイチップを用いた高並列膜タンパク質解析法。単一分子レベルでの膜輸送ダイナミクスと輸送挙動を蛍光読み出しで解明し、膜タンパク質スクリーニングの新たなアッセイ開発に貢献します。

単一のタンパク質解像度で高並列ナノ細孔チップシステムにより分析膜輸送プロセス

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