単一のタンパク質解像度で高並列ナノ細孔チップシステムにより分析膜輸送プロセス

このナノ構造チップベースのプラットフォームの全体的な目的は、膜タンパク質の機能を単分子レベルで高度に並列的に解析することです。単一タンパク質を分解能高く識別できる能力により、膜輸送およびフラックスに関する新たな知見が得られます。この手法は、単一のチャネルやトランスポーターの導電性や輸送挙動、特に非電位発生性の貨物を運ぶものなどの、膜タンパク質分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。

この技術の主な利点は、数十万個のナノポアを備えたナノ構造チップ設計と、輸送イベントの蛍光読み出しによる高い並列性にあります。この技術の意義は、膜タンパク質の効果的なライブラリを用いた最適なアッセイの構築にまで及びます。これは、チップベースのプラットフォームにより、高度に並列化された自動輸送記録が可能になるためです。

一般的に、この手法に初めて取り組む方でも、提示されたテクニックを迅速に習得することができます。誰もが導入できるよう、常にユーザーフレンドリーなアッセイを構築することに焦点を当てました。この膜輸送アッセイでは、反応性イオンエッチングを用いて設計されたシリコンオンインシュレーター（SOI）ウェハーを使用しています。

1枚のウェハーから約1,000個のアッセイチップが作製されます。各チップには250,000個のマイクロキャビティが含まれています。これらのキャビティは、目的の輸送タンパク質を含む脂質二重層によって封止されます。

膜はセンサーインターフェースを構成します。当初、蛍光物質は脂質二重層の一方の側、すなわちそれらが構成するリポソームの内部に封じ込められています。各キャビティは、マルチスペクトル蛍光読み取りによってアドレス指定可能です。

不透明な最上層がバッファーリザーバーからの蛍光信号を遮断するため、このバイオチップは倒立蛍光顕微鏡での使用が可能です。原子間力顕微鏡を用いた測定により、均一に配置されたポア開口部および二酸化ケイ素層の表面粗さは3.6 nanometersであり、小胞融合に最適であることが確認されました。走査電子顕微鏡では、シリコンチップ内部のフェムトリットルキャビティへと繋がるナノポアの断面が示されています。

このビデオでは、プロテオリポソームの調製、アッセイ用チップの調製、および基本的なアッセイの実施方法を示します。エタノールで洗浄した丸底フラスコをロータリーエバポレーターに接続します。300 millibar、ウォーターバス温度 30 °C、最大回転速度で40分間脂質フィルムを乾燥させ、フラスコのガラス壁面上に均一な脂質フィルムを形成させます。

次に、高真空ポンプを用いて、室温でさらに30分間脂質フィルムを乾燥させます。続いて、バッファー5 mLとエタノール洗浄済みのガラスビーズ8個をフラスコに加え、多層小胞を調製します。フラスコをロータリーエバポレーターに接続し、真空をかけずに50 °Cの最高速度で回転させます。

45分後、溶液は乳白色になり、壁面に脂質の膜が残っていない状態になります。フラスコを不活性ガス条件下で超音波洗浄機に移し、室温で4分間ソニケーションを行います。ソニケーションによりリポソームが破壊され、単層ラメラ構造になります。

次に、LUV溶液を1 mLずつ分注し、液体窒素と40 °Cのウォーターバスを用いて凍結融解サイクルを5回繰り返します。これにより、リポソームの破裂、再編成、および増大が起こります。最後の凍結ステップの後、すべてのサンプルを-80 °Cで保存します。

LUVのアリコートを再構成する前に、ミニエクストルーダーを用いて、アリコートを400 nanometerのポリカーボネートフィルターメンブレンに17回通過させ、リポソームをエクストルードします。次に、溶液中に0.25%となるように4%Triton X-100を添加し、LUVを不安定化させます。この混合物を50 degrees Celsiusで5分間インキュベートします。

次に、精製・修飾したMscL 1部分を、界面活性剤飽和リポソーム 20部分に混ぜ合わせ、さらに30分間インキュベートします。インキュベーション後、100 µLの分注液を採取し、同量の30 mM calcineを加えます。この混合物を50 °Cで5分間インキュベートしてください。

次に、カルシン処理済みおよび未処理のサンプルから界面活性剤を除去します。それぞれにTris緩衝液で湿らせたバイオビーズを加え、回転プレートを用いて4°Cで一晩インキュベートします。実験の前に、活性測定法を用いて調製状態を確認してください。

まず、エラストマーベースを硬化剤に混ぜ合わせ、混合物が完全に乾燥するまで脱水させます。接着剤は、準備完了後30分以内に使用する必要があります。その間、注意を払いながら、ガラスシリンジを用いて5 mLのクロロホルムでカバーガラススライドを洗浄し、スライドを乾燥させます。

次に、10 µL ピペットを使用して、調製した接着剤をカバーガラス上に滴下します。その後、精密ピンセットを用いて、ウェハーボードからチップを慎重に取り出します。チップのコーティング面を上に向けた状態で接着剤の上に置き、スライドに軽く押し当てて、接着剤を均一に分散させます。

気泡が下に閉じ込められたり、接着剤がチップの上に付着したりしないように注意してください。また、アセンブリが8チャンバースライドホルダーに適合するように組み立てます。次に、キャビネット dryerを用いて、65 °Cで2時間、アセンブリを乾燥させます。

その後、54 °Cで溶媒洗浄を数回行い、チップ上の保護層を除去します。まず、マウントしたチップをスライドホルダーに入れます。次に、3種類の溶媒浴にそれぞれ10分間浸漬します。

イソプロパノール、アセトン、そしてイソプロパノールを用います。次に、チップを超純水で注意深く、かつ十分に洗浄します。最後に、窒素ガスの緩やかな気流でチップを乾燥させ、工程を完了します。

次に、8ウェルの粘着スライドを準備し、ベンチ上に裏返して置きます。その後、カバーグラスを慎重に持ち上げ、チップがウェル側を向くように粘着スライド上に押し付けます。次の工程に進む前に、この状態で数分間静置してください。

転位アッセイに進む前に、テキストプロトコルに記載されている通りにチップアセンブリを十分に洗浄し、最後にTris緩衝液での浸漬処理を行います。次に、バス溶液を、5 mMの塩化カルシウムと1 µMのOy647染料を含むDOPE添加Tris緩衝液に交換します。続いて、最終濃度が1 mg/mLになるようにプロテオリポソームをチップチャンバーに添加し、1時間待ちます。

1時間後、チップをカルシウムフリーのTrisバッファー400 µLで4回洗浄します。次に、各ウェルにコントロール色素を5 µMになるように加え、アッセイを進めます。続いて、チップホルダーをエピ蛍光顕微鏡に取り付け、ナノポアチップの縁に焦点を合わせてマイクロキャビティを探します。

マイクロキャビティにピントが合ったら、ナノポアアレイをスキャンして、シーリング比（ceiling ratio）が最も高い領域を探します。詳細はテキストプロトコルに記載されています。リポソームを調製し、そのサイズ分布と分散性を確認しました。

調製したリポソームが、アッセイの孔径よりも大きくなることが不可欠です。また、リポソームが単分散であることも望ましいです。実験前に、リポソーム調製における修飾MscLタンパク質を蛍光デクエンチングアッセイを用いて確認しました。

活性化した変異型MscLを保持するリポソームの割合は、転移実験を進行させるのに十分であった。バイオチップ上において、変異型MscLチャネルを介した蛍光標的分子の溶質転移が観察された。化学修飾剤であるMTSETを用い、静電反発によって構築したMscLチャネルを開口させた。

続いて、キャビティ空間内の蛍光の減少をモニタリングした。このプロセスは再現性が高く、流出イベントが非常に一貫していることが示された。得られた流出曲線は、単一チャネルまたはマルチチャネルの転位イベントに対応する、2つの明確な集団に分類された。

本システムでは、最大3色の異なる蛍光色素をリアルタイム解析で追跡することが可能です。これにより、陽性結果、単一指数関数的な排出イベント、複雑なキネティクス、脂質の侵入、および膜の破裂を正確に識別できます。この手法を習得すれば、チップの作製、試料の調製、イメージング、および解析という連続したステップで実行できるため、プロトコル全体をモジュール化することが可能です。