Name: リン脂質単層の二次元拡散を測定するためにドロップレットをマージした後蛍光回復 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 54 s
Description: 学ぶ ドロップレットマージ法によるリン脂質単層の二次元拡散測定技術。蛍光回復法でDOPCの拡散係数を定量し、細胞膜の流動性と界面活性剤の相互作用を解析する。

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この作品は、韓国国立研究財団（NRF- 2012R1A6A3A040395、NRF-2013R1A1A2057708、NRF- 2012R1A1A1011023）を通じて2014年KAIST資金によるK-バレーRED＆Bプロジェクトと基礎科学研究開発プログラムでサポートされています。

注意：発ガン性アセトンとクロロホルムの使用前に製品安全データシート（MSDS）を参照してください。 フラット空気 - 水界面でのリン脂質単分子膜の作製<ol><li>リン脂質単分子層の形成<ol><li>リン脂質溶液の調製<ol><li>アセトン、エタノール、および脱イオン水を少なくとも3回を使用して、ポリテトラフルオロエチレンコーティングされたキャップでバイアル、および水を取り除くためにバイアル中に充分に窒素ガスを吹き付けるmlの4を清掃してください。 </li><li>濃度1mg / mlのを得るために、バイアル中のクロロホルム1mlにリン脂質1mgの（例えば、ジオレオイルホスファチジルコリン、DOPC）を溶解します。安全のためにヒュームフード内でこの手順を実行します。必要に応じて、リン脂質溶液のより低いまたはより高い濃度を使用してください。 </li><li>染料を追加したリン脂質のソリューの1モル％未満でリン脂質（例えば、ローダミンジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ローダミンDPPE）をタグ付けン、蛍光顕微鏡を用いてリン脂質単分子層を可視化するためです。安全のためにヒュームフード内でこの手順を実行します。 </li><li>溶媒の蒸発を防止するために、ポリテトラフルオロエチレンテープでバイアルをラップし、-20℃の冷凍庫でサンプルを保存します。 </li></ol></li><li>空気 - 水界面へのリン脂質の沈着<ol><li>ペトリ皿（直径55ミリメートル、高さ12ミリメートル）エタノール、および脱イオン水を少なくとも3回清掃してください。 </li><li>空気 - 水界面を作成するために、脱イオン水10mlでペトリ皿を埋めます。 </li><li>所望の表面圧力を達成するためにクリーンなインターフェイス上にマイクロシリンジを用いてリン脂質溶液の数マイクロリットルを広げ、実験前をやっに、溶媒を完全に蒸発させるために、少なくとも30分間待ちます。 注：ラングミュアトラフは、表面圧力の正確な制御が必要な場合に代えて、ペトリ皿を用いることができます。 </li></ol></li></ol></li><li>蘇rface圧測定<ol><li>ウィルヘルミー板張力を有するリン脂質単分子膜の表面圧を測定します。濾紙をウィルヘルミー板として使用されている場合は、フィルター紙は十分に湿らせ得るために、少なくとも30分間待ちます。詳細なプロトコールは、クーンらで利用可能です。20。 </li><li>正確に面圧を制御するために、リン脂質の付着量を調整します。 〜5 MN / mの表面圧の場合、インタフェースの30.25センチメートル2 -areaにDOPC溶液（1mg / ml）の4μLを追加が必要です。 注：濾紙が完全に湿潤していない場合は、面圧が原因濾紙の重量変化を、実験の最初の30分の間に劇的に変化します。 </li></ol></li><li>単層の対流の最小化<ol><li>の対流を抑制するために、ペトリ皿の大部分に接続された2つの薄いチャネルを有する3mmのリザーバーを含み、円錐状の装置を使用して形態イメージングと面圧測定を妨害することができ、単層、。 </li><li>リン脂質は、空気 - 水界面にリン脂質を堆積させる前に、全領域にわたって自由に移動することを確実にするために、円錐状の装置の内部と外部との間の水のレベルが一致することを確認します。 </li></ol></li></ol>液滴の曲面でリン脂質単分子膜の作製<ol><li>マイクロピペットプラーを使用して、ガラスキャピラリーのプロセスを先細り<ol><li>マイクロピペットプラーのキャピラリーホルダーにガラスキャピラリー（OD 1ミリメートル、ID 0.78ミリメートル、長さ100ミリメートル）を配置します。 </li><li>適切なパラメータ値（：ランプ、引き出し：60、ヴェル：70、ディレイ：熱70と圧力200）と毛細血管を引くためのプログラムを設計し、製造業者のプロトコルに従って設計されたプログラムとの毛細血管を引っ張ります。 注：キャピラリーは数マイクロメートル、直径で終了すると、APPLによって100μmの液滴を形成する必要があります〜10キロパスカルで圧力をYING。キャピラリの先端が、非常に高い圧力、&gt; 600 kPaで小さすぎる場合は、大きすぎるキャピラリ先端で液滴のサイズを制御することは困難であるが、液滴を得るために必要とされます。 </li></ol></li><li>液滴表面へのリン脂質の吸収 注：液滴の湾曲した界面でのリン脂質単分子層を形成するために、染料なしのリン脂質溶液は、リン脂質をタグ付け強度コントラストを得るために使用される、平坦な単層に対して、また、手順1で調製手順2.2.1及び2.2の両方0.2は、ここで許容されています。液滴表面での面圧の精密な制御が必要な場合は、手順2.2.2を強くお勧めします。しかし、そうでない場合は、手順2.2.2よりもはるかに簡単な方法である手続き2.2.1は、便利です。 <ol><li>先端のリン脂質の塗布工程<ol><li>少なくとも3倍、アセトン、エタノール、および脱イオン水を使用したスライドガラスを清掃してください。 </li><li> PL洗浄スライドガラス上のテーパーキャピラリをエース、および先端をスライドガラスに触れ容易にするために、毛細血管を傾けます。 </li><li>ガラスシリンジを使用してスライドガラスに接着され、キャピラリの先端にリン脂質溶液（1mg / ml）の数滴を落とし、そして溶媒を完全に蒸発させるために少なくとも30分待ちます。 注意：先端の周囲のみが毛細管力によって先端部にリン脂質の液滴を保持するには小さすぎるので、それは非常に手続き2.2.1.3中にガラススライドにキャピラリの先端を接着することをお勧めします。 </li></ol></li><li>ベシクル溶液の調製<ol><li>バイアルを清掃して、手順1.1.1.1で導入されたように、バイアルから水を除去します。 </li><li>穏やかに窒素ガスを適用することにより、リン脂質溶液（1mg / ml）2mlの体積を乾燥し、残りの溶媒を除去するために室温で1時間、バイアルを乾燥させます。安全のためにヒュームフード内でこの手順を実行します。 </li><li> 2を追加乾燥した脂質を含有するバイアルに、脱イオン水のmlであり、1時間60℃のオーブン中でバイアルをインキュベートします。 </li><li>小胞を得るために30分間（370 W：40 kHzの、電源までのHF周波数）、および超音波処理バイアルを数回振ります。 </li><li>単分散単層小胞を得るために、押出及び凍結融解処理を実行します。小胞を調製するための詳細なプロトコールは、メイヤーらに記載されている。21。 注：液滴界面の面圧が単分散の単層小胞を含んでいる小滴を形成した後に待機時間を調整することにより正確に制御されます。ペンダントドロップ法22を用いて、前の実験を行うには、時間に応じて面圧の変化を測定する必要があります。 </li></ol></li></ol></li><li>曲面でのリン脂質単分子層を含んでいる小滴の形成<ol><li> procedurからの脱イオン水10μlのテーパーキャピラリーに記入E 2.2.1。また、手順2.2.2からベシクル溶液10μlを使用しています。 </li><li>液滴を形成するための圧力を提供するために、自動化されたマイクロインジェクタにキャピラリを接続します。 </li><li>正確に、キャピラリの位置を制御するマイクロマニピュレーターにマイクロインジェクタに接続されているキャピラリーをマウントします。 </li><li> CCDカメラでキャピラリーの側面図を撮像するための：明視野顕微鏡（10倍NA 0.3顕微鏡1、対物レンズ）を準備します。顕微鏡1は、このようにz軸に沿って液滴の正確な位置を観察し、液滴の大きさを推定することが可能となります。 </li><li>適当な大きさになるまで（〜100、先端部の側面図はよくマイクロマニピュレーターを用いて顕微鏡1によって可視化された位置に先端を移動し、キャピラリーの先端に可変圧力（〜100ヘクトパスカル）を適用液滴の直径がμm）が形成されています。 注：これは、自動化されたマイクロインジェクターやマイクロマニピュレーターが使用することをお勧めしますD、液滴の液滴の大きさと位置の微調整が必​​要な場合。これは手動のものを使用することも可能です。 </li></ol></li></ol>液滴マージ後の3イメージング蛍光回復注意：このプロトコルの基本原理は、液滴合一プロセスを除いて、FRAP技術のものと同一です。 FRAPの詳細なプロトコルおよび関連する理論は、A・ロペスら 15およびDアクセルロッドら 16でご利用いただけます。 <ol><li>液滴の位置を監視し、制御します<ol><li>ローダミンDPPES（560 nmでの励起、583 nmでの発光）のための適切なフィルターセットを蛍光顕微鏡の両方を可能にします（：10×NA 0.3、結像レンズの焦点距離17センチメートル顕微鏡2、対物レンズ）セット倒立顕微鏡を準備そして明視野顕微鏡。蛍光顕微鏡メートルで、液滴の上面図を可視化するために、ここでCCDカメラを使用してくださいODEと明視野顕微鏡モード。 </li><li> z軸に沿ってフラット空気 - 水界面にリン脂質でコーティングされた小滴を移動しますが、マイクロマニピュレーターを使用して、まだ液滴をマージしません。液滴の側面図を可視化する顕微鏡1を使用します。 </li><li>マイクロマニピュレーターを使用して、平らな単層の上面図の中心に小滴の位置を確認します。平らな単層の上面図を可視化するために、顕微鏡2の明視野顕微鏡モードを使用します。 </li></ol></li><li>フラット空気 - 水界面への液滴のマージ<ol><li>液滴がマイクロマニピュレーターを使用して、インターフェイス上にマージされるまで平坦な界面に向けて更なる液滴を移動します。マージ処理が正常に行われた場合、白い背景に囲まれた円形状の暗領域は、顕微鏡2の蛍光モードを用いて観察されます。 </li><li>ミクロスの蛍光モードを使用して、液滴をマージした後、時間による蛍光画像の系列を記録します2.ここでは、単層の拡散時間スケールよりも速いフレームレートを使用して対処します。 DOPC単層では、それは完全に200μmの暗い領域内に拡散するために数分かかります。 </li></ol></li></ol> 4.画像解析によって拡散係数の決定注意：以下に説明するように、一連の画像から拡散係数を決定するために、画像解析用にカスタマイズされたプログラムが組み込まれています。このプログラムの詳細なソースコードは、Joveのウェブサイトで利用可能です。 <ol><li>関心の円形領域の検出<ol><li>関心領域の中心の検出<ol><li>円形暗い領域と白の背景を含むリカバリプロセス中に記録された蛍光画像のシリーズを入手して、基準画像としてシリーズの最初の画像を設定します。ここで、R Dは、参照画像内の暗い領域の半径です。 </li><li>誰白丸で参照画像を畳み込みますSE強度が全領域にわたって均一です。ここでは、カスタマイズプログラム行124のソースコードに示すように、コンボリューションのための「CONV2 &#39;という名前の埋め込 ​​み機能を使用して、白い円の半径はR Dよりもわずかに小さいです。 </li><li>畳み込み演算の最小値を示す位置を検索し、参照画像内の関心領域の中心としてこの位置を設定します。 </li></ol></li><li>関心のある領域の半径を決定します<ol><li>全領域にわたって手順4.1および均一な強度によって決定される中心位置を含み、白丸で参照画像を畳み込みます。ここで、R Sは、白い円の半径です。使用反復ような &#39;の&#39;またはカスタマイズされたプログラム行109から102のソースコードに示すように白丸を作るために円の方程式と「しばらく」など。 </li><li>少し持っている別の白丸で参照画像を畳み込みますR Sよりも大きな半径（5％-10％）であり、R L、。カスタマイズされたプログラム行120から113のソースコードに示すように円を作るための手順4.1.2.1と同様の方法を使用します。 </li><li> 4.1.2.1と4.1.2.2の2畳み込み計算の間の値の差を取得します。 </li><li>ピクセルレベルでR SとR Lの両方を増加させることにより、R、S = 2R Dに R S = R D / 2から上記の手順を繰り返します。繰り返すように4.1.2.3に手順4.1.2.1からの全ソースコードが含まれている反復を行います。 </li><li> 2畳み込み計算の間の値の最大差を示すR Sの半径を検索します。このRは、このように、参照画像内の暗い領域の半径を示し、S 149にカスタマイズしたプログラム行148のソースコードに示すように半径を見つけるために、「最大」という名前を使用し、組み込み関数は、値の最大差を示しています。 </li></ol></LI&gt; </ol></li><li>分数の強度の計算<ol><li>関心領域として手順4.1によって決定中心位置と半径を、含まれている円を設定します。 </li><li>時間に応じて蛍光画像の一連の関心領域の平均強度を計算します。関心のある領域で各フレームを畳み込むと平均強度を計算するために、関心領域の面積で割り。詳細はJoveのウェブサイトで提供されてカスタマイズされたプログラムのソースコードで提供されています。 </li><li>次式のように定義分数強度を計算し、F（t）は時間に応じて関心領域である円内の平均強度であり、F iは円の中に最初の強度であり、F oはの強度であり、白い背景。 F（T）=（F（T） - F I）/（F O - F i）を （式1）。 </li></ol></li><li> FフィッティングFRAP理論にractional強度<ol><li> I 1はフィッティングプログラムを使用して、ベッセル関数を変更され、τは特性拡散時間とI 0である下記式、で端数強度を取り付け、τを得ます <img alt="式（2）" src="/files/ftp_upload/53376/53376eq2.jpg" /> （式2）。 </li><li> Dは拡散係数であり、暗い領域の半径である関係、τに基づいて、拡散係数= 2/4 Dを 、取得します。 注：フィッティングプロセス中に、回復プロセスは、すでに画像を記録する前に、開始されたときに、時間軸に沿って分数強度プロファイルをシフトすることが可能です。 </li></ol></li></ol>

<ol><li>Van Meer, G., Voelker, D. R., Feigenson, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+lipids%3A+where+they+are+and+how+they+behave%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Membrane lipids: where they are and how they behave.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9 (2), 112-124 (2008).</li>
<li>Christon, R., Even, V., Daveloose, D., Léger, C. L., Viret, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+of+fluidity+and+lipid%E2%80%94protein+relationships+in+pig+intestinal+brush-border+membrane+by+dietary+essential+fatty+acid+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta+-+Biomembr%22%5BJournal%5D)">Modification of fluidity and lipid—protein relationships in pig intestinal brush-border membrane by dietary essential fatty acid deficiency.</a> Biochim. Biophys. Acta - Biomembr. 980 (1), 77-84 (1989).</li>
<li>Stubbs, C. D., Smith, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+modification+of+mammalian+membrane+polyunsaturated+fatty+acid+composition+in+relation+to+membrane+fluidity+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta+-+Rev.+Biomembr%22%5BJournal%5D)">The modification of mammalian membrane polyunsaturated fatty acid composition in relation to membrane fluidity and function.</a> Biochim. Biophys. Acta - Rev. Biomembr. 779 (1), 89-137 (1984).</li>
<li>Holthuis, J. C. M., Menon, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+landscapes+and+pipelines+in+membrane+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Lipid landscapes and pipelines in membrane homeostasis.</a> Nature. 510 (7503), 48-57 (2014).</li>
<li>Alonso, C., Waring, A., Zasadzinski, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keeping+lung+surfactant+where+it+belongs%3A+protein+regulation+of+two-dimensional+viscosity%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Keeping lung surfactant where it belongs: protein regulation of two-dimensional viscosity.</a> Biophys. J. 89 (1), 266-273 (2005).</li>
<li>Kim, K., Choi, S. Q., Zell, Z. a, Squires, T. M., Zasadzinski, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+cholesterol+nanodomains+on+monolayer+morphology+and+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+%28U.+S.+A.%29%22%5BJournal%5D)">Effect of cholesterol nanodomains on monolayer morphology and dynamics.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. (U. S. A.). 110 (33), E3054-E3060 (2013).</li>
<li>Hormel, T. T., Kurihara, S. Q., Brennan, M. K., Wozniak, M. C., Parthasarathy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+Lipid+Membrane+Viscosity+Using+Rotational+and+Translational+Probe+Diffusion%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+Letters%22%5BJournal%5D)">Measuring Lipid Membrane Viscosity Using Rotational and Translational Probe Diffusion.</a> Phys. Rev. Letters. 112 (18), 188101(2014).</li>
<li>Ding, J., Warriner, H. E., Zasadzinski, J. a, Schwartz, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+needle+viscometer+for+Langmuir+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Magnetic needle viscometer for Langmuir monolayers.</a> Langmuir. 18 (13), 2800-2806 (2002).</li>
<li>Dhar, P., Cao, Y., Fischer, T. M., Zasadzinski, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+interfacial+shear+microrheology+of+aging+protein+films%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+Letters%22%5BJournal%5D)">Active interfacial shear microrheology of aging protein films.</a> Phys. Rev. Letters. 104 (1), 1-4 (2010).</li>
<li>Kim, K., Choi, S. Q., Zasadzinski, J. A., Squires, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interfacial+microrheology+of+DPPC+monolayers+at+the+air-water+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Interfacial microrheology of DPPC monolayers at the air-water interface.</a> Soft Matter. 7 (17), 7782-7789 (2011).</li>
<li>Choi, S. Q., Steltenkamp, S., Zasadzinski, J. A., Squires, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+microrheology+and+simultaneous+visualization+of+sheared+phospholipid+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Commun%22%5BJournal%5D)">Active microrheology and simultaneous visualization of sheared phospholipid monolayers.</a> Nature Commun. 2 (5), 312(2011).</li>
<li>Caruso, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+lateral+diffusion+coefficients+in+air-water+monolayers+by+fluorescence+quenching+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Determination of lateral diffusion coefficients in air-water monolayers by fluorescence quenching measurements.</a> J. Am. Chem. Soc. 113 (16), 4838-4843 (1991).</li>
<li>Filippov, A., Orädd, G., Lindblom, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+cholesterol+on+the+lateral+diffusion+of+phospholipids+in+oriented+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">The effect of cholesterol on the lateral diffusion of phospholipids in oriented bilayers.</a> Biophys. J. 84 (5), 3079-3086 (2003).</li>
<li>Schwille, P., Korlach, J., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+correlation+spectroscopy+with+single-molecule+sensitivity+on+cell+and+model+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Fluorescence correlation spectroscopy with single-molecule sensitivity on cell and model membranes.</a> Cytometry. 36 (3), 176-182 (1999).</li>
<li>Lopez, A., Dupou, L., Altibelli, A., Trotard, J., Tocanne, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+recovery+after+photobleaching+%28FRAP%29+experiments+under+conditions+of+uniform+disk+illumination.+Critical+comparison+of+analytical+solutions%2C+and+a+new+mathematical+method+for+calculation+of+diffusion+coefficient+D%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) experiments under conditions of uniform disk illumination. Critical comparison of analytical solutions, and a new mathematical method for calculation of diffusion coefficient D.</a> Biophys. J. 53 (6), 963-970 (1988).</li>
<li>Axelrod, D., Koppel, D. E., Schlessinger, J., Elson, E., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mobility+measurement+by+analysis+of+fluorescence+photobleaching+recovery+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Mobility measurement by analysis of fluorescence photobleaching recovery kinetics.</a> Biophys. J. 16 (9), 1055-1069 (1976).</li>
<li>Vaz, W. L., Clegg, R. M., Hallmann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+diffusion+of+lipids+in+liquid+crystalline+phase+phosphatidylcholine+multibilayers.+A+comparison+of+experiment+with+theory%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Translational diffusion of lipids in liquid crystalline phase phosphatidylcholine multibilayers. A comparison of experiment with theory.</a> Biochemistry. 24 (3), 781-786 (1985).</li>
<li>Wu, E. S., Jacobson, K., Papahadjopoulos, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lateral+diffusion+in+phospholipid+multibilayers+measured+by+fluorescence+recovery+after+photobleaching%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Lateral diffusion in phospholipid multibilayers measured by fluorescence recovery after photobleaching.</a> Biochemistry. 16 (17), 3836-3841 (1977).</li>
<li>Peters, R., Beck, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+diffusion+in+phospholipid+monolayers+measured+by+fluorescence+microphotolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+%28U.+S.+A.%29%22%5BJournal%5D)">Translational diffusion in phospholipid monolayers measured by fluorescence microphotolysis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. (U. S. A.). 80 (23), 7183-7187 (1983).</li>
<li>Kuhn, H., Mobius, D., Bucher, H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKuhn%2C+H+%22Physical+Methods+of+Chemistry%22">Physical Methods of Chemistry</a>. Crawley, J. N., et al. 1, Part 3B, 651-653 (1972).</li>
<li>Mayer, L. D., Hope, M. J., Cullis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicles+of+variable+sizes+produced+by+a+rapid+extrusion+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta+-+Biomembr%22%5BJournal%5D)">Vesicles of variable sizes produced by a rapid extrusion procedure.</a> Biochim. Biophys. Acta - Biomembr. 858 (1), 161-168 (1986).</li>
<li>Rotenberg, Y., Boruvka, L., Neumann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+surface+tension+and+contact+angle+from+the+shapes+of+axisymmetric+fluid+interfaces%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Colloid+Interface+Sci%22%5BJournal%5D)">Determination of surface tension and contact angle from the shapes of axisymmetric fluid interfaces.</a> J. Colloid Interface Sci. 93 (5), 169-183 (1983).</li>
<li>Jeong, D. W., Kim, K., Lee, S., Choi, M. C., Choi, S. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+recovery+after+merging+a+surfactant-covered+droplet%3A+a+novel+technique+to+measure+the+diffusion+of+phospholipid+monolayers+at+fluid%2Ffluid+interfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Fluorescence recovery after merging a surfactant-covered droplet: a novel technique to measure the diffusion of phospholipid monolayers at fluid/fluid interfaces.</a> Langmuir. 30 (48), 14369-14374 (2014).</li>
</ol>

著者らは、競合する金銭的利益を宣言していない。

FRAMは、特に特定の領域を漂白した後蛍光回復を測定するため、FRAPとの基本原則の多くを共有するが、FRAMは、漂白の領域を形成するために平坦な界面上に液滴をマージする代わりに、強い光を適用するプロセスを使用しています。マージ処理は、このようにFRAMの中で最も重要なステップであり、特に、液滴をマージした後のフラット化単分子膜で暗い染みの形状は、拡散率測定の精度を決定します。具体的には、現在の方法に基づいて、我々は唯一の手順4に示した暗い染色の平均強度を計算する関心領域として半径Rの円を設定し、円形状からあまり偏差がある場合、これは、拡散係数の正確な測定を妨げるであろう。したがって、円形の暗領域を得るために必要であるが、非円形の形状が原因で、いくつかの理由のために時折形成されています。まず、ペットにおける対流が存在する場合里皿を、暗い領域の形状は、流れの方向に沿って細長いなります。手順1.3で述べたように、円錐形装置は、対流を抑制するのに役立ち、そしてこの伸びを最小限に抑えることになります。キャピラリの先端がマージプロセス中に平坦な界面に触れるとキャピラリー端がマージ処理を中断するので秒、暗い領域は、様々な形状に形成されています。唯一の毛細管の最後からぶら下がっている液滴を取得することにより、この中断を防止することができます。具体的には、キャピラリーの疎水化処理は、キャピラリの最後に座って液滴をするのに役立ちます。したがって、上記のトラブル銃撃や修正をより正確に拡散特性を測定することが可能となります。 このよくtroubleshotプロセスは、このようにFRAMは、FRAPの上にいくつかの重要な利点を持つことができます。まず、FRAMは、FRAPに比べて簡単な装置を必要とします。 FRAMのために、簡単な蛍光MICROSを使用するのに十分です代わりに波長色素の吸収スペクトルと一致している必要があり、高出力レーザーで高価な共焦点顕微鏡で、対応いたします。また、FRAMは、液滴サイズ、液滴表面の面圧を調整することにより、容易に領域のサイズを制御しながら、FRAPで漂白領域の大きさを調整するために追加の装置を使用する必要があります。第二に、FRAM中の染料の様々な種を使用することが可能です。 FRAPは、その漂白プロセス、拡散プロセスよりもはるかに高速である色素分子を使用しています。染料の拡散が漂白工程中に発生した場合、それは正確に拡散特性を推定することは困難です。 FRAMは、しかしながら、染料を漂白するための方法を必要とせず、これは、このように蛍光イメージングにおける染料の様々なタイプの使用を可能にします。また、FRAPは、追加の高出力レーザーを必要とするフィルタは、FRAMにフィルタセットを交換することだけが必要であるが、染料の種類を変更する設定します。最後に、FRAPのみを測定しながら、液滴表面と平坦な界面で単分子層は、このように相互拡散の調査を可能にする、またはB型の単層に型単層をマージすることによって、2つの異なる脂質単層との混合、独立して形成することができるので単分子層の自己拡散。 これらの利点にもかかわらず、フラットな空気 - 水界面上に液滴をマージするプロセスは、潜在的に、このような2単層との間の面圧の不一致などの懸念があるかもしれないいくつかの問題に起因するこの技術では、マージ処理の時間スケールを制限することができます、および液滴をマージした後平らな単分子膜の表面圧の増加。これらの問題は、しかし、次の理由により、大幅に拡散測定には影響を与えません。まず、二つの異なる単層における面圧が非常に異なっていても、平衡化プロセスは、回復プロセスの間、非常に早い段階で終了します。例えば、T彼は、液滴表面に単分子膜の面圧が平坦な空気 - 水界面で単分子層よりも高い、暗い領域は、表面圧平衡になるまで膨張します。このプロセスは、10ミリ秒以内に完了しているので、それはかなり拡散プロセスに影響を与える前に、面圧が平衡化されます。マージ処理の時間スケールが十分に高速であれば第二に、それは全く拡散測定を制限するものではありません。幸いなことに、典型的なマージプロセスは、10ミリ秒以内に完了されます。トラフの表面積は、液滴の表面積よりもはるかに大きいため、最終的に、平坦な界面に液滴の偶数倍マージは、表面圧を増加させません。トラフのサイズおよびプロトコルに記載の液滴によると、分子当たりの面積は、液滴をマージして0.015％未満を増加させます。従って、原因分子当たりの面積の変化に対する面圧の上昇がnegligiblで0.1％未満でありますEウィルヘルミー板張力計によって測定され、それは、面圧で、典型的な誤差よりはるかに小さいからです。 要約すると、我々は平坦な界面上に液滴単層をマージすることにより、リン脂質単層の横方向の拡散特性を測定するための新しい方法を導入しました。この技術は、比較的単純な設備を必要とし、また色素種の各種の使用を可能にします。 FRAMは、流体 - 流体界面でのリン脂質、ブロックコポリマー、タンパク質、さらにはナノ粒子を含む任意の表面活性剤の拡散を測定するためにこのように潜在的に適用可能です。さらに、我々はFRAMは、2つの異なる界面活性剤との間の相互拡散や混合を研究する新しい方法を提供することを期待しています。

<html>リン脂質は細胞膜および細胞小器官の膜の主要成分であり、これらの膜層の流動性は、多くの場合、膜タンパク質1の活性を変化させることによって細胞機能に影響する- 3。例えば、膜&#160;脂質ホメオスタシスは、膜タンパク質によって検出される膜の流動性を調整することによって達成され、流動性の異常なレベルは、脂肪肝及び胆汁うっ滞4などの重篤な疾患を引き起こします。また、エア肺胞流体界面でのリン脂質単分子膜の流動性は、その機能において重要な意味を持ちます。低流動性が呼気5,6の間に肺胞内に収まるように層を可能にする一方、肺サーファクタントリン脂質単層の高い流動性は、吸入の間層の広がりを促進します。これは、それらの役割を理解するために、リン脂質層​​の流動性を推定することが重要です。 _content &quot;&gt;流動性の直接測定は、粘度であり、かつリン脂質層の粘度は、ミクロンサイズのコロイド7、磁性針8,9、および磁性マイクロボタン6,10,11を用いて測定された。しかしながら、これらの技術比較的剛性のフィルムに限定され、かつ粘性の低いフィルムを測定することができない。このような場合、拡散率はリン脂質層​​の流動性を定量化するための代替手段であろう。数十年のために、リン脂質層​​の拡散特性を測定するための様々な技術が開発されていますこのような蛍光消光法12、パルス磁場勾配NMR 13、および蛍光相関分光法（FCS）14として最も代表的な方法の一つは、（FRAP）15,16を光退色後蛍光回復である。これにより、測定手順の単純さと関連しますリン脂質層​​の拡散特性の理論、いくつかの研究では、FRAPを使用して行われてきました<suP&gt; 17から19まで。しかし、FRAPは、通常、高出力レーザーで高価な共焦点顕微鏡のセットアップが必要です。 ここでは、（FRAM）をマージした後蛍光回復と呼ぶリン脂質単層の横方向の拡散を測定するための新しい手法を提示します。 FRAPとFRAMの主な違いは、光退色のステップをドロップ合体により置換されていることです。蛍光標識された平らな単層上に非蛍光単分子膜で覆われた液滴をマージするので、光退色のステップと同じ初期状態を設定し、明るいフラット化単分子膜上に円形の暗い染みを残します。それから、横方向の拡散率を測定するための時間と暗い染色での蛍光回復を観察します。ドロップ合体によるこの新しい「漂白」のステップは、FRAP上で重要な利点を提供します：FRAMは、蛍光顕微鏡ではなく、FRAPに必要な高出力レーザで高価な共焦点顕微鏡を必要とします。私n個の追加、それが光退色過程を伴わないため、FRAMは、蛍光色素の幅広い選択をしています。 FRAPのみが単層の自己拡散を測定しながら、最終的に、二つの異なる単層、液滴単層および平坦化単分子膜は、このように相互拡散を測定することができるように、独立して調製することができます。 FRAMは、高粘性の物質からほぼ非粘性材料に拡散測定の広い範囲を提供します。原則として、FRAMは、拡散がドロップ合体プロセス（〜10ミリ秒）の時間の間に100ミクロンによって領域にわたって100μmで発生した場合、既存の技術に匹敵する10 6μmの2 /秒、最大拡散率を測定することができます。単層が固体でない限り、また、遅い拡散プロセスを容易に測定することができます。 FRAMであれば、適切な蛍光タグ付き分子が利用可能であるような表面活性物質、任意の種類のために使用することができます。

<table><tbody><tr><td>アセトン</td><td>OCIコーポレーション</td><td>アセトン3.8L エクストラピュア</td><td>純度:99.5%以上 ご使用前にMSDS(Material Safety Data Sheets)をご参照ください。</td></tr><tr><td>エタノール</td><td>OCI株式会社</td><td>エタノール3.8L エクストラピュア</td><td>純度:94%以上 ご使用前にMSDS(Material Safety Data Sheets)をご参照ください。</td></tr><tr><td>ジオレオイルホスファチジルコリン、DOPC</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850375C</td><td>ご使用前に製品安全データシート(MSDS)をご覧ください。クロロホルムは発がん性があります。</td></tr><tr><td>クロロホルム</td><td>リクロソルブ</td><td>クロロホルム超高純度 (A3633)</td><td>純度: &ge; 99.8%、ご使用前に製品安全データシート(MSDS)をご参照ください。発がん性</td></tr><tr><td>ローダミンDPPE</td><td>アバンティ極性脂質</td><td>810158C、810158P</td>光退色ウィルヘルミープレート張力計R&<td>を防ぐために直接光の露出を避け</td></tr>てください<tr><td></td><td>。K超薄型有機膜技術</td><td>ウィルヘルミー張力計</td><td>http://www.rieglerkirstein.de/index.htm</td></tr><tr><td>マイクロピペットプーラー</td><td>サッター機器</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>マイクロインジェクター</td><td>エッペンドルフ</td><td>フェムトジェット</td><td></td></tr><tr><td>マイクロマニピュレーター</td><td>エッペンドルフ</td><td>マイクロマニピュレーター 5171</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡 1</td><td>対物レンズ:オリンパス</td><td>対物レンズ:UPlanFl 10x</td><td>対物レンズ:10X NA 0.3</td></tr>顕微鏡<tr><td>2</td>対<td>物レンズ:オリンパス、チューブレンズ:Thorlabs</td>対<td>物レンズ:UPlanFl 10x</td><td>対物レンズ:10X NA 0.3、チューブレンズ:焦点距離17 cm</td></tr><tr><td>CCD 顕微鏡用1</td><td>Jai</td><td>CV 950カメラ</td><td></td></tr><tr><td>CCD 顕微鏡用CCD 2</td><td>Andor</td><td>iXon3 EMCCD</td><td></td></tr><tr><td>フィルターセット</td><td>クロマテクノロジー</td><td>カタログセット49004:ET545、T565、ET605</td><td>染料分子に適した調製</td></tr><tr><td>ソニケーター</td><td>ダイハンサイエンティフィック</td><td>ワイズクリーン WUC-D06H</td><td></td></tr></tbody></table>

リン脂質単層の二次元拡散を測定するためにドロップレットをマージした後蛍光回復

Fluorescence Recovery after Merging a Droplet to Measure the Two-dimensional Diffusion of a Phospholipid Monolayer

私たちは、融合後の蛍光回復(FRAM)と呼ばれる、流体-流体界面における界面活性剤単層の横方向の拡散率を測定する新しい方法を導入します。FRAMは、特に特定の領域を漂白した後の蛍光回復を測定するために、光退色後の蛍光回復(FRAP)技術と同じ原理を採用していますが、FRAMは光退色色素分子の代わりに液滴合体を使用して、色素分子の化学電位勾配を誘導します。私たちの技術には、FRAPに比べていくつかの利点があります:高出力レーザーを搭載した共焦点顕微鏡ではなく、蛍光顕微鏡のみが必要です。それは本質的に蛍光性染料の選択から自由です。また、測定された拡散領域を定義する自由度がはるかに高くなります。さらに、FRAMは、液滴表面と平坦な空気/水界面の単層が異なる種で独立して調製されている場合、2つの異なる界面活性剤の混合または相互拡散を研究するためのルートを提供する可能性があります。

図1に記載されている蛍光画像のシリーズは、フラットDOPC単層上DOPC単層で被覆された小滴を併合した後、リカバリ処理時間で得られた。平らな空気-水界面におけるDOPC単層を少量ドープしましたローダミンDPPE、これは、このようにそれが可能な新たに平坦な界面に追加明るい色と暗い領域と背景を可視化するために作られました。そこでは、回復プロセスは、23 MN /固定面圧のMで観察されました。時間に応じて分数強度の変化に式（1）の適合は、図2に示されている。このフィットのR 2値は0.999であり、このフィットは、依然としてより低いまたはより高い表面圧力でうまく機能します。このフィットから得られたDOPC単層の拡散係数は、表面圧は23mN / mで27.54ミクロン2 /秒でした。 FRAMのさらなる検証、DOの拡散係数についてPC及びジパルミトイルホスファチジルコリン（DPPC）の単層は、表面圧に従って測定しました。 LE（液体が膨張）相転移が10を発生し、値- 図3に示すように 、FRAMは、LC（液体凝縮）面圧の〜9 MN / mにおけるDPPC単層の拡散係数の急激な低下を捕捉拡散係数はまた、ピーターズらによって以前に測定値とよく一致している。19。また、面圧で拡散係数の指数関数的減衰は、DOPC単層で観察されたが、この傾向はカルーソら 12により測定したものとほぼ同じです。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53376/53376fig1.jpg" /> 図1（A）FRAMの模式図（マージした後蛍光回復）技術。リップとしてIDの単層コーティングされた液滴が平らな空気 - 水界面にマージされ、蛍光のない脂質単層は、脂質は、フラット蛍光脂質単層内に挿入されるタグを付けました。表面圧は23mN / mで（スケールバー= 100ミクロン）でDOPC単層の回復プロセス中の時間と（B）の蛍光顕微鏡画像。 DOPC単層の暗い領域は完全に数分以内に、拡散プロセスによって回収される。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53376/53376fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53376/53376fig2.jpg" /> 時間対2フラクショナル強度図 。黒丸とグレーの点線は、時間の経過とともに、分別強度に画像解析（手順4.1および4.2）と式1のフィットから得られた端数強度の値を示しますそれぞれ、手順4.3に示す。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53376/53376fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/53376/53376fig3.jpg" /> DOPC（三角形）とDPPC（空の角）面圧の関数として単層の図3.拡散係数。明るいグレー色のダークグレー色のラインが以前ピーターズらによって報告された拡散係数の値を示しています。そして、カルーソら 、それぞれ。この図は、チョンら 23から変更されています。チョンらラングミュア 。30（48）、14369から14374の許可を得て転載。著作権2014年米国化学会。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53376/53376fig3large.jpg" target="_blank">彼女をクリックしてください</a>この図の拡大版を表示するには、E。

液滴単層を平らな単層に融合させることにより、流体-流体界面における表面活性種の横方向の拡散を測定する新しい技術を提示します。

We introduce a new method to measure the lateral diffusivity of a surfactant monolayer at the fluid-fluid interface, called fluorescence recovery after ...

この手法の全体的な目的は、2種類の異なる界面活性剤の二次元混合を観察し、そこから拡散係数を抽出することです。この手法は、細胞膜における異なる種の流動性や相互作用、および表面活性剤間の相互作用など、生物物理学および表面科学分野における重要な疑問への回答に役立ちます。この手法の主な利点は、任意の2つの表面活性単分子層の混合を直接観察できることです。リン脂質単分子層を形成するために、非常にシンプルなセットアップを用いて、両者が独立して制御されます。まず、PTFE（ポリテトラフルオロエチレン）コーティングのキャップが付いた4Lバイアルを洗浄し、リン脂質溶液を調製します。アセトン、エタノール、および脱イオン水で少なくとも3回ずつすすいでください。その後、バイアル内に窒素ガスを十分に吹き込んで水分を除去し、1 mgのリン脂質を1 mLのクロロホルムに溶解して、1 mg/mLの濃度にします。次に、リン脂質溶液の1%未満となる量のdagリン脂質を添加します。蛍光顕微鏡でリン脂質単分子層を可視化するために、溶媒の蒸発を防ぐようバイアルをポリテトラフルオロエチレンテープで巻き、サンプルを-20 °Cの冷凍庫で保存して、気液界面にリン脂質を堆積させます。まず、ペトリ皿をエタノールと脱イオン水で少なくとも3回洗浄します。次に、ペトリ皿に脱イオン水を10 milliliters注入し、気液界面を作成します。マイクロシリンジを用いて、目的の表面圧を得るためにリン脂質溶液を数µL、きれいな界面上に広げ、実験を行う前に溶媒が完全に蒸発するまで少なくとも30分間待ちます。Wilhelmプレートテンシオメーターを用いて、リン脂質単分子層の表面圧を測定します。単分子層の対流は、形態やイメージング、表面圧の測定を妨げる可能性があるため、3 mmのリザーバーと、ペトリ皿の広いセクションに接続された2本の細いチャネルを備えた円錐形状の装置を使用します。これにより対流を抑制します。また、テーパー状のガラスキャピラリーの先端にリン脂質をコーティングします。まず、アセトン、エタノール、および脱イオン水を用いて、ガラススライドを少なくとも3回洗浄します。テーパー状のキャピラリーを清潔なガラススライドの上に置き、キャピラリーを傾けて先端をガラススライドに接触させます。ガラス製シリンジを用いて、ガラススライドに密着しているキャピラリーの先端にホスホリピッド溶液を数滴滴下し、溶媒が完全に蒸発して曲面にホスホリピッド単分子層を含む液滴が形成されるまで、少なくとも30分間待ちます。テーパーキャピラリーに脱イオン水 10 µLを充填します。液滴を形成させるための圧力を供給するため、キャピラリーを自動マイクロインジェクターに接続します。キャピラリーの位置を精密に制御するため、マイクロインジェクターに接続したキャピラリーをマイクロマニピュレーターに取り付けます。CCDカメラを使用してキャピラリーの側面を撮影するため、明視野顕微鏡を準備します。これを顕微鏡1とし、Z軸に沿った液滴の正確な位置の観察および液滴サイズの推定を可能にします。マイクロマニピュレーターを使用して、チップの先端を側面から見える位置まで移動させます。顕微鏡1で先端を十分に観察し、適切なサイズの液滴が形成されるまで、キャピラリーの先端に可変圧を加えます。液滴の位置を監視および制御するため、テキストプロトコルに従い、マイクロマニピュレーターを用いた顕微鏡2として使用する倒立顕微鏡を準備します。リン脂質でコーティングされた液滴をZ軸に沿って平坦な気液界面まで移動させますが、まだ液滴を合体させないでください。顕微鏡1を使用します。液滴の側面像を可視化するため、フラットモノレイヤーの上面図の中心に液滴を配置してください。マイクロマニピュレーターを使用します。顕微鏡2の明視野顕微鏡モードを使用して、フラットな単層の上面を観察します。拡散係数をより正確に算出するためには、マージによって形成されるTacho領域が円形である必要があるため、ペトリ皿内の流れを制限し、チップの先端が界面に接触しないようにすることが重要です。液滴を平坦な気水界面に合一させるには、マイクロマニピュレーターを使用して液滴を平坦な界面に向けてさらに移動させ、液滴が界面に合一するまで操作します。顕微鏡の蛍光モードを用いて、液滴の合一後の経過時間に従って一連の蛍光画像を記録します。画像解析については、テキストプロトコルを参照してください。回復過程中の時間経過に伴う一連の蛍光画像を取得しました。A-D-O-P-C単分子層でコーティングされた液滴を平坦なDOPC単分子層に合一させた後、23 millitant per meterの固定表面圧において回復過程を観察しました。時間に対する分率強度の変化のフィッティングをここに示します。このフィッティングのR2値は0.999です。このフィッティングから得られたDOPC単分子層の拡散係数は、表面圧23 mN/mにおいて27.54 µm²/sでした。さらなる検証のため、ここに示すように、表面圧に応じたDOPCおよびDPPC単分子層の蛍光回復後拡散（FRAP）拡散係数を測定しました。FRAPでは、液体凝縮相から液体拡張相への相転移が起こる表面圧約9 mN/mにおいて、DPPC単分子層の拡散係数が急激に減少することが捉えられています。拡散係数の値は、先行研究の測定結果とよく一致しました。さらに、DOPCモノレイヤーにおいて、表面圧に伴う拡散係数の指数関数的な減少が観察され、これは既報の研究結果と一致していました。習得すれば、適切に実施することでこの手法は2時間で完了させることが可能です。この手順に従います。2種類の異なる脂質種の混合は、一方をゲルマン表面に、もう一方を平坦なエアロゲル界面に、それぞれ異なる単分子層を形成させることによっても観察でき、これにより、各展開後の異なる脂質種間の相互作用などの追加的な疑問に答えることが可能です。この手法は、生物物理学および表面科学の分野の研究者が、細胞膜における異なる種の流動性と相互作用、および界面活性剤間の相互作用を探索するための道を切り開きました。クロロホルミルの取り扱いは非常に危険であるため、本手順の実施中は常にフィルムフードを使用するなど、適切な予防策を講じてください。

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Research

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Bioengineering

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リン脂質単層の二次元拡散を測定するためにドロップレットをマージした後蛍光回復

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