フローサイトメトリーによるマウス精子細胞のステップ固有のソート

この手順の全体的な目標は、マウスの精子細胞を4つの異なる集団に分離し、精子形成の分子研究を可能にすることです。この方法は、クロマチックモデリングがゲノムの完全性に与える影響など、鏡像再現分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、相互汚染なしに精子を純粋な細胞集団に分離できることです。

この方法のアイデアを最初に思いついたのは、細胞ソーティングの前日に、ハプロパラメータのクロマチンリモデリング中にDN染色強度の重要な変動を観察したときでした。5ミリリットルのポリプロピレン丸底、および15ミリリットルと50ミリリットルのポリプロピレン円錐管に1〜2ミリリットルの熱不活性化FBSを追加します。次に、翌日のローテーターで摂氏4度の一晩の反転によりチューブをゆっくりとコーティングします。

P 200ピペットを使用してFBSを慎重にデカントし、15ミリリットルと50ミリリットルのチューブから残留FBSを除去し、5ミリリットルのチューブに100〜200マイクロリットルのFBSの小さな残留量を残して、細胞の日に精製された細胞を収集します。選別は、500マイクロリットルの選別緩衝液にカプセル化された試験片をミンチにします。次に、切頭マイクロピペットチップを使用して、組織片を1.5ミリリットルのチューブに移します。

精細管から生殖細胞を穏やかな上下ピペッティングで洗い流し、続いて無傷の先端で洗い流します。次に、40ミクロンのセルストレーナーを使用して、FBSコーティングされた50ミリリットルの円錐管に濾液を集めた破片と塊を取り除きます。フィルターを総容量3ミリリットルまでの選別バッファーで一度洗浄し、濾液をFBSコーティングされた15ミリリットルのコニカルチューブに移します。

次に、細胞懸濁液のミリリットルあたり16マイクロリットルのEDTAを細胞に加え、10ミリリットルのピペットを使用して、低速の渦巻きながら100%エタノールの3つの容量で1分間にわたって細胞をゆっくりと固定します。細胞を氷上で15分間インキュベートし、時折反転させます。次に、細胞懸濁液を遠心分離し、パレットを2ミリリットルのソーティングバッファーに再懸濁し、ソーティングの直前に生殖細胞を4マイクロリットルのCyto 16 DNADで染色します。

50ミクロンのフィルターで細胞をろ過し、FBSコーティングされたファックスチューブに入れ、1〜2ミリリットルのソーティングバッファーでフィルターを広範囲に洗浄します。固定した生殖細胞を488ナノメートルのレーザー搭載セルソーターにロードします。次に、Alexa floor 4 88 エリアに対するイベント数を表すヒストグラムでイベント総数を表示し、陽性 DNA 染色細胞をゲートします。

次に、このゲートのセルを、前方散乱領域プロットとゲートに対して側面散乱領域に表示します。示されているように、セルは、Alexaフロア4 88エリア、プロットおよびゲートに対して前方散乱エリアにこれらのゲートセルを表示する。その後、セルは再び、これらのゲートをAlexaフロア4 88のエリアプロットに対して別々のAlexaフロア4 88の幅に表示します。

精子形成は、1から9、10から12のステップです。その後、精子細胞をゲートで分類して、ステップ13から14および15から16を収集できます。精子細胞は、最初のゲートから前方散乱領域への細胞をEXOR 4 88の面積プロットとゲートに対して表示します。

示されている細胞集団。次に、これらのゲートを個々のAlexaに表示します。フロア 4 88 幅、Alexa フロア 4 88 エリア プロットとゲート。

ステップ13〜14および15〜16の精子を選別します。最後に、精製された画分を100〜200マイクロリットルのFBSに集め、氷上に5ミリリットルの丸底チューブをコーティングした個々のFBSに入れます。これらの画像では、フローソーティングされたスミット集団の汚れた染色が示されています。

精子形成のステップ1から9の精子細胞は、通常、精子形成で楕円形に見える丸い形の核を示します。ステップ9の精子細胞は、ステップ10から12で細長いフックとして観察されます。精子細胞の精子形成ステップ13〜14および15〜16の精子細胞は、同様の形状の核を示しますが、DNA染色強度がわずかに異なるため、フローサイトメトリーによるソーティング中にこれらの異なる精子集団を同定できます。

実証されたプロトコルに従って、個々のS実験集団の純度は95〜100%であると期待できますこの技術は、6〜8時間で完了することができます。各ステップが適切に実行されている場合。これは、精子の異なる集団を得るためのこの手順に従うことにより、手順全体を通して常に細胞を氷上に保つことを覚えておくことであり、劇的なtingリモデリングプロセスを特徴付けるなどの分子分析のための十分な量の材料を提供し、またはこの移行の遺伝的影響を研究するために。