Name: 医工学のためのケラチンベースのナノファイバーの合成 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 43 s
Description: 学ぶ ケラチンベースのナノファイバー合成法。電気紡糸法でケラチン/PCLナノファイバーを作製し、組織工学や創傷治癒、薬物送達への応用可能性を評価する。細胞増殖を支持し、生体適合性に優れた材料開発に役立つ。

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著者は、サポートに資金を提供するための革新的メタリックバイオマテリアル工学研究センター（ERC-0812348）とナノテクノロジー学部教育（EEC 1242139）を通じて全米科学財団に感謝したいと思います。

すべてのプロトコルは、研究コンプライアンスと倫理のノースカロライナA＆T州立大学のOfficeのガイドラインに従います。 ケラチン抽出4 1.化学準備<ol><li> 2％重量/容量過酢酸溶液（PAS）の千ミリリットルを準備するには、ヒュームフードの下で脱イオン（DI）水980ミリリットルに過酢酸の20ミリリットルを追加します。 </li><li> 100mMトリス塩基溶液（TBS）1000mlのを準備するために、脱イオン水1000mlにトリス塩基12.2gのを追加し、完全に溶解するまで撹拌します。 </li><li> DI水の30ミリリットルに濃塩酸の4ミリリットルを注ぐことにより、ドラフト内で希塩酸溶液（DHAS）を準備します。 </li><li>化学的に処理されたか変更されていない人間の髪の毛の切り抜きの約20グラムを調達。髪の長さは任意です。 </li><li>暖かい水と石鹸で、手で、徹底的に髪を洗ってください。最終すすぎ脱イオン（DI）水を使用してください。 </li><li> 80ºCのOで2 600ミリリットルビーカー、所定の位置に髪を置きます1時間VEN。 </li><li>ビーカーの底から液体を排出し、髪が完全に乾燥するまでオーブンに戻って置きます。 </li><li>各ビーカーに毛の10グラムを配置し、600ミリリットルのビーカーの間で均等に乾燥した髪を分割します。以上の500ミリリットルを埋めるために髪を許可しないでください。 </li><li>髪のすべてをカバーすることを確認して、各ビーカーにPASの500ミリリットルを注ぎます。 12時間パラフィルムや店舗でビーカーをカバーしています。 </li></ol>ケラチン抽出液の調製<ol><li> 500ミクロンのふるいを使用して、PASから髪を区切ります。別の容器内の廃PASを収集します。残ったPASを除去するために、DI水で徹底的に髪をすすいでください。 </li><li> 500mlフラスコ中ですすぎ、髪を置きます。毛が覆われていることを確認して、フラスコ内にTBSの400ミリリットルを注ぎます。 38ºC、1時間65回転に設定した振盪浴中に置き、フラスコ。 </li><li> 1時間後、バスを振ってから削除して、液体を注ぐ、ケラチン抽出溶液（KES）の約400ミリリットル、私千ミリリットルのビーカーNtoを。 </li><li>髪をカバーし、1時間振とう浴中に戻って配置されることを保証する毛を含むフラスコに脱イオン水400mlを注ぎます。振とう浴からフラスコを外し、以前に収集KESと千ミリリットルビーカーにKESの残りの400ミリリットルを注ぎます。髪はもはや必要ありませんし、フラスコからダンプされ、最寄りのごみ容器に廃棄することができます。 </li></ol>ケラチン抽出液の3濃度<ol><li>蒸留水で一番上の行にrotodistiller風呂を記入し、90ºCに設定。 200回転まで回転数を設定します。クーラントチラーポンプの電源を入れ、-10ºCに設定。 </li><li> pH計を使用して、KESのpHを監視し、ゆっくりとpHが7.0に達するまでKESに1mMのDHASを追加するためにピペットを使用します。溶液が添加されるようにゆっくりとかき混ぜます。 </li><li>フル程度四半期までの丸底フラスコ500ml中に中和KESを注ぎます。メーカーのに従って蒸留器を実行します1.25時間のためのプロトコル。 <ol><li> KESのすべてが蒸留されるまで、ステップ3.3を繰り返します。フラスコがしっかりと接続されていることを確認してください。 </li></ol></li></ol> 4.透析ケラチンの抽出液<ol><li> 12独立した14ミリリットルコニカルチューブに均等にKES液を注ぎます。 10分間、1050×gでチューブを遠心。 </li><li>収集した破片から離れて注ぎ確認して、清浄なビーカーに遠心分離KESを注ぎます。 KESのすべてが遠心分離されるまで繰り返します。 </li><li> 2000ミリリットルのDI水でメスシリンダーを埋めます。 </li><li> 24インチに透析チューブセルロース膜を切断し、それをシャット保持するチューブの一端をクリップ。 </li><li>それはより柔軟で開きやすくするためのDI水シリンダー内にチューブの長さを浸し。 </li><li>透析チューブのセルロース膜の非クリップされた端を開き、ゆっくりとチューブに遠心分離KES液の60ミリリットルを注ぎます。チューブのこの端を閉鎖するために別のクリップを使用してください。 </li><li>ディを入れてDI水の2000ミリリットルシリンダ内alysisチューブ、24時間放置することができます。シリンダー内のすべての3〜4時間をDI水を変更します。 </li><li> 24時間の期間の後、24時間、-20℃の冷凍庫に上部の空間と場所を残すようにしてくださいされ、キャップされたジャーに透析KES液を空にします。 </li></ol> 5.凍結乾燥ケラチン抽出液の<ol><li> -86ºCに凍結乾燥機を設定します。 </li><li> 、冷凍庫から冷凍KESを含むjarファイルを削除ジャーのオフにキャップを取り、凍結乾燥機のアンプルに入れます。アンプルにシールを置き、0.133ミリバールの真空圧力を作成するために、ノブを回します。水分のすべてがなくなるまで、約48時間のサンプルを凍結乾燥。 </li></ol>エレクトロ・ソリューションズの6準備（10重量％ケラチンソリューション） <ol><li>凍結乾燥機からケラチンパウダーを取り出し、重量を量ります。 </li><li> 10％（重量/重量）を作成するためにケラチン粉末に脱イオン水を加えますケラチンソリューション。 </li></ol> PCLソリューション重量10％の7の準備<ol><li> 、およびトリフルオロエタノール（TFE） - PCL（90kDaのεカプロラクトンポリマー、Mnは70）を取得します。 O / Nを攪拌することによりTFEで重量PCLによって10％を準備し、均質な混合物を得ます。 </li></ol>ケラチン/ PCLソリューションの8.準備<ol><li> 10重量％のPCL溶液を先に調製し、10重量％ケラチン溶液を得ました。 90:10、80:20、70:30の10ミリリットルPCL /ケラチンソリューション、および60:40の比率を作成するために、賢明なPCL液滴にケラチンを追加します。 </li><li>エレクトロスピニング前に、PCL /ケラチン液の均一な混合物を得るために、ボルテクサーを使用します。 </li></ol> 9.エレクトロPCLの生産/ケラチン繊維<ol><li> 0.5mmの直径のプラスチック管を備えた10ミリリットル使い捨て注射器にPCL /ケラチン溶液約8ミリリットルを置きます。流量は2.5ミリリットル/時間に設定されているシリンジポンプにシリンジを配置します。 </li><li&gt;チューブ（ドラムを収集ファイバから〜23センチメートルに位置し、水平から約30度）に接続された針の先端に電圧を適用します。チューブに22 kVの電圧と約200 rpmでコレクタードラムを回転させる - 19を適用します。 <ol><li>サンプルを実行する前に、アルミホイルでコレクタードラムを包みます。アルミ箔は、どちらかの端にラベリングテープを適用することにより、安定していることを確認してください。 注：繊維は、アルミ箔上に形成する（ 図2を参照）、RTで繊維覆われた箔を格納します。 </li></ol></li></ol> PCL /ケラチンナノファイバーの10力学解析<ol><li> 8ミリメートルによって60ミリメートルに試料をカットします。デジタルマイクロメーターを使用して厚さを記録することを確認します。調製した各組成物について、5つのサンプルを使用します。 </li><li>引張試験機で60×8ミリメートルのサンプルを取り付けます。サンプルを添付するためにカスタム設計された試料ホルダを使用します。二重使用してインデックスカードから作られた試料ホルダーとの間にサンプルを挟みます両面テープ。 10mm /分の変位速度で、10Nのロードセルを適用します。 注意：試料ホルダーが38ミリメートル、50ミリメートル内側の窓と40ミリメートルによって62ミリメートルであるように設計されました。 </li><li>レコードの拡張とソフトウェアのプロトコルに従ってソフトウェアを介して負荷値。 </li><li>試験される試料の面積で力を割ることによってストレスを計算します。次に、初期長さによって長さの変化を分割することにより歪みを計算します。 </li><li> x軸の歪み値に対応するY軸の応力をプロットすることにより応力 - ひずみ曲線を生成します。 </li><li>傾きは弾性率に等しい線形領域からヤング率を計算します。株では0.2％オフセットを取り、線形領域の曲線に平行線を描画することにより、応力歪みプロットから引張強度を決定します。 </li><li>以前に解析ソフトウェア8を用いて一元配置分散分析を用いて三連で得られた機械的データの統計分析を行う。p値 &lt;0.05我々統計的に有意であると考え直します。 </li></ol> 11.表面形態と構造特性<ol><li>電界紡糸繊維の形態を観察するために15キロボルトの電圧及び5μAの電流を促進するパラメータを持つ走査型電子顕微鏡（SEM）を使用します。 <ol><li> SEMで撮影する前に、繊維の2 cm 2の部分をカットし、銅テープを使用して、SEMステージに取り付けます。約11 nmの厚さの金層を作成するために、1分30秒15ミリアンペアで金でスパッタコーター、コートの内側のステージを置きます。 SEMのチャンバ内にサンプルをロードします。繊維試料を観察します。 </li></ol></li><li> PCLとケラチンとの間に化学結合を特徴づけるために、赤外分光法（FTIR）をフーリエ変換を使用してください。磁気ホルダーにエレクトロナノファイバー膜の2 cm 2のセクションを配置し、試験前に乾燥空気を使用してシステムをパージします。 200スキャンのスペクトルを取得し、STAを使用してスペクトルを分析ソフトウェアプロトコルに従ってndardソフトウェア。 </li><li>標準的なソフトウェアを使用して、スペクトル分析を行い、製造業者のプロトコルに従ってナノファイバーの各比率の三連を使用します。 </li></ol>細胞 - 繊維相互作用の12研究<ol><li> 16ミリメートル2サンプルに繊維をカット。 12ミリメートル径のカバースリップに、各試料を固定するために、生体適合性、シリコーン系接着剤を使用してください。 </li><li> 、その後も同様にカバースリップの背面にサンプルの自由端を接着、カバーガラスの周りのサンプルを包むだけで覆われたスリップの上部を残してカバースリップの背面に繊維試料の一端を接着繊維試料。 </li><li> 24ウェルプレートで繊維試料を置きます。 1時間80％エタノールに浸漬してサンプルを滅菌します。 </li><li> DI水を使用して、サンプルからエタノールをすすぎます。次に、サンプルの上にピペット基礎培地の2ミリリットルを、サンプル全体をカバーすることを確認すること。 5分後に培地を除去します。 </li><li>使用線維芽細胞3T3細胞は、繊維試料をシードします。 DMEMを1ml当たり/ cm 2で約62,000細胞が存在するように、抗生物質および10％ウシ胎児血清（FBS）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）中で細胞を懸濁。 </li><li>各繊維サンプルは/ cm 2で約62,000細胞で覆われていることを保証する各ウェルプレートに3T3細胞を含むDMEM溶液1mlをドロップ。 37℃で24時間、5％CO 2のためにウェルプレートをインキュベート。注：使用し、5％CO 2をそのレベルは通常日間生理的範囲内の細胞培地のpHを維持することができるからです。 </li></ol>ナノファイバーマトリックスの13分解<ol><li>カットは、正方形の約30ミリメートル×30ミリメートルにPCL /ケラチンナノファイバー膜を乾燥させました。 </li><li> 10分間のインキュベーション時間を80％アルコール900 mm 2のサンプルを滅菌し、DI水で徹底的に洗浄します。 37ºCで、PBS、pHが7.5の15ミリリットルでサンプルをインキュベートします。 BUFを交換してください3日ごとにFER。 </li><li>指定された間隔、1週間および7週目に溶液から膜を取り、DI水ですすいでください。 </li><li>凍結乾燥機のアンプルに膜サンプルを置きます。アンプルにシールを置き、真空を作成するために、ノブを回します。完全に乾燥するまで、24時間凍結乾燥。 </li><li>銅テープを使用して、SEMステージに乾燥した試料を取り付けます。 1分30秒15ミリアンペアで、金でスパッタコーター、コートの内側にステージを配置します。 </li><li> SEMのチャンバ内にサンプルをロードします。 1.5 kVのと5μAの電流の加速電圧で繊維試料を観察します。 </li></ol>

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著者は、彼らが競合する金融利害関係を持たないことを宣言します。

人間の髪の毛からケラチンの抽出に成功を達成しました。過酢酸は、ケラチンは、トリス塩基により抽出することができるように、人間の毛髪に酸化剤として作用しました。ケラチン粉末の製造は、それが唯一の研究目的のために行われたという事実による小規模でした。この手順は、すでに大規模生産のために業界で確立されています。小規模ケラチンを抽出する目的は、汚染、バッチ変動、及び費用対効果を制御することでした。 ケラチンの抽出は、この手順の律速段階です。 2％ - ケラチン粉末の収量は、0.7非常に低いです。 0.4グラムのケラチン - 人間の髪の毛の20グラムは、0.14が得られました。電界紡糸繊維を製造する際のもう一つの重要なステップは、電界紡糸に適している解決策を策定されています。ケラチン容易DI水中に分散させたが、エレクトロスピニングの際に、ケラチン/水溶液は、繊維形成をもたらしませんでした。必要に応じてMを提供するためにナノファイバーを共重合体を作成するためのolecular相互作用を溶液に導入しました。 TFEに溶解したPCLは、水素結合を介してケラチンとより強く相互作用することができました。...

エレクトロスピニングは、ポリマーナノファイバーを達成する普及した方法として認識されています。繊維は、ナノスケールで製造することができ、繊維特性は、1カスタマイズ可能です。これらの開発および電気紡績ナノファイバーの特性は、特に組織工学で生物医学工学におけるその用途に特に興味深いされています。エレクトロスピニングされたナノファイバーは、細胞外マトリックスとの類似性を有し、したがって、細胞の接着、遊走および増殖2を促進します。細胞外マトリックス（ECM）へのこの類似性、静電繊維は、創傷包帯、薬物送達を補助するための材料として使用することができ、例えば、肝臓、骨、心臓、および筋肉3などのエンジニアリング組織について。 合成および天然起源の異なるポリマーの様々な異なる生物医学工学応用4静電繊維を作成するために使用されています。最近、そこに成長しています合成および天然ポリマー4をブレンドすることにより、複合ナノファイバーの開発にterest。これらの組成物において、最終製品は、典型的には、また、天然ポリマーからの生物学的手がかりとプロパティを採用しながら合成ポリマーに関連した機械的強度を継承します。 この実験では、PCLおよびケラチン複合ナノファイバーの合成に使用される合成および天然ポリマーとして提示されます。ケラチンは、毛髪、羊毛や爪で発見された天然高分子です。これは、多くのアミノ酸残基を含みます。注目すべき関心のシステイン4,5です。理想的には、天然に存在するポリマーは、生物学的再生可能、生体適合性および生分解性であろう。また、それが6に組み込まれている生体材料に細胞増殖および添付ファイルを向上させながら、ケラチンは、これらの特性のすべての3つを持っています。 ポリカプロラクトン（PCL）はで重要である再吸収性、合成ポリマーであります組織工学4。このポリマーは、以前にその構造および機械的安定性のために評価されている、しかし、それは、細胞親和性を欠いていると長い分解速度を示します。 PCLの疎水性の性質は、細胞親和性7の欠如のために可能性が高い責任があります。しかし、PCLは、他のポリマーとの混和性の高いであることによって、その限界を補います。 PCL /ケラチン複合体は、PCLの機械的特性を実証して様々な生物医学的用途のための理想的な選択肢となって、ケラチンの生物学的特性を組み込む必要があります。

<table><tbody><tr><td>人間の髪の毛&nbsp;</td><td></td><td></td><td>グリーンズボロの地元の理髪店から入手</td></tr><tr><td>過酢酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCL(e-カプロラクトンポリマー)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>502-44-3</td><td>Mn 70-90 kDa</td></tr><tr><td>トリフルオロエタノール(TFE)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>75-89-8</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base(TrizmaTMベースパウダー)</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>>99.9%結晶</td></tr><tr><td>塩酸フィ</td><td>ッシャーサイエンティフィック</td><td>A144C-212ロット093601</td>ウォル<td>サム、マサチューセッツ州</td></tr><tr><td>クウィックシル</td>ワールド<td>精密機器サラ</td><td></td><td>ソタ、FL</td></tr><tr><td>セルロース膜</td>シ<td>グマアルドリッチ</td><td></td><td>12-14kDa分子カットオフ</td></tr><tr><td>光学顕微鏡</td>オ<td>リンパスBX51M</td><td>BX51M</td><td>日本</td></tr><tr><td>走査型電子顕微鏡</td>日<td>立SU8000</td><td>SU8000</td><td>日本</td></tr><tr><td>卓上島津製作所</td><td>北米 分析・測定機器 AGS-Xシリーズ</td><td>AGS-Xシリーズ&nbsp;</td><td>メリーランド州コロンビア</td></tr><tr><td>フーリエ変換赤外分光</td>法 <td>Bruker Tensor 2 Instrument&nbsp;</td><td></td><td>マサチューセッツ州ビレリカ</td></tr><tr><td>Microcal Origin ソフトウェア</td><td></td><td></td><td>マサチューセッツ州ノーサンプトン</td></tr><tr><td>X線回折 (XRD)</td><td>Bruker AXS D8 Advance X線回折計</td><td></td><td>ウィスコンシン州マディソン</td></tr><tr><td>線維芽細胞 3T3&nbsp; 細胞</td><td>American Tissue Type Culture Collection</td><td></td><td>バージニア州</td></tr><tr><td>ダルベッコの改変イーグル培地 (DMEM</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>Grand Island,NY</td></tr><tr><td>Spectra max Gemini XPS マイクロプレートリーダー</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>カリフォルニア州サニーベール</td></tr><tr><td>学生 - Newman-Keuls ポストホックテスト</td><td>SigmaPlot 12 ソフトウェア</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

医工学のためのケラチンベースのナノファイバーの合成

Synthesis of Keratin-based Nanofiber for Biomedical Engineering

様々な分野における用途のための汎用性と電位による電気紡糸は、しばしばナノファイバーを製造するために使用されています。これらの多孔質ナノファイバーの製造は、その独特の物理化学的特性に非常に興味深いです。ここでは、ポリ（εカプロラクトン）（PCL）ナノファイバー（ すなわち 、PCL /ケラチン複合繊維）を含むケラチンの製造について詳しく説明。水溶性ケラチンは、まず人間の毛髪から抽出され、異なる比率でPCLと混合しました。 PCL /ケラチンのブレンドされた解決策は、設定ラボ設計エレクトロスピニングを使用してナノファイバー膜に転換しました。得られたナノファイバーの繊維の形態および機械的特性は、走査電子顕微鏡、引張試験機を用いて観察し、測定しました。また、ナノ繊維の分解および化学的特性は、FTIRによって調査しました。 SEM画像は、異なる組成のPCL /ケラチン繊維のための均一な表面形態を示しました。これらのPCL / keratinは繊維はまた、ヤング率及び障害点として優れた機械的性質を示しました。線維芽細胞が付着し、良好な細胞生存性を証明し、従って、増殖することができました。上述の特性に基づいて、我々は強く、天然および合成ポリマーのブレンドナノファイバーは異なる生物医学的用途に用いることができる複合材料の優れた発展を表すことができると主張することができます。

繊維形態 繊維のSEM画像は全て繊維組成物について得られました。 図 3を参照。ファイバイメージは繊維がランダムに配向していることを確認します。 機械的検査 機械的に強い繊維は一般に、種々の組織工学用途のために必要とされます。これらの繊維は一定のストレスや環境条件9の下で十分な強度と柔軟性を保持すべきです。一般に、足場は影響を遮蔽ストレスを回避し、 インビボおよび / ​​またはインビトロ細胞増殖10中に十分な強度を維持するために、標的組織に近い弾性率を有することが望まれています。引張試験機は、ヤング率と繊維の破断強度を測定しました。 00、90:10、80:20、70:30ワット：100の比でPCL /ケラチ...

電界紡糸ナノ繊維は、重量比は、優れた機械的完全性に大きな表面積を有し、細胞の成長と増殖を支えます。これらのナノファイバーは、生物医学的用途の広い範囲を持っています。ここでは、エレクトロスピニング法を用いて、ケラチン/ PCLナノ繊維を製造し、組織工学の可能な用途のために繊維を特徴付けます。

Electrospinning, due to its versatility and potential for applications in various fields, is being frequently used to fabricate nanofibers. Production of ...

この実験の全体的な目的は、生物医学的応用のためのケラチンベースのナノファイバーを合成し、その特性を評価することです。この手法は、創傷治癒、ドラッグデリバリー、および肝臓、骨、筋肉などの組織工学といった生物医学工学分野における重要な課題の解決に寄与します。この技術の主な利点は、低コストで効率的であり、大規模生産への拡張が可能であることです。この技術の意義は、創傷治療や組織再生のための薬剤送達にまで及びます。この手法は電界紡糸ナノファイバーを使用する利点についての知見を提供しますが、組織再生などの他のシステムにも適用可能です。一般的に、この手法に不慣れな人は、ナノファイバーを生成できるポリマー物質を作成することが困難であるため、苦労することになります。化学的処理や加工がされていないヒトの刈り取った髪を約20g用意します。髪の長さは任意です。ぬるま湯と石鹸を用いて、髪を手で十分に洗浄してください。最終すすぎには脱イオン水を使用します。髪を2つの600 mLビーカーに入れ、80 °Cのオーブンで1時間加熱します。乾燥後、乾燥した髪を600 mLビーカーに均等に分け、各ビーカーに10 gの髪を入れます。毛髪の量が500 mLを超えないようにしてください。次に、各ビーカーに500 mLの過酢酸溶液（PAS）を注ぎ、毛髪全体が浸かるようにします。ビーカーをParafilmで密閉し、12時間保存します。500 µmのシブ（ふるい）を用いて、PASから毛髪を分離し、不要なPASは別の容器に回収します。脱イオン水で毛髪を十分にすすぎ、残存しているPASを除去します。すすいだ毛髪を500 mLフラスコに入れ、毛髪が完全に浸かるように、100 mM Tris Base溶液（TBS）を400 mL注入します。次に、フラスコを38 °C、65 RPMに設定したシェーキングバスに1時間置きます。1時間後、シェーキングバスからフラスコを取り出します。約400 mLのケラチン抽出液（KES）を1000 mLビーカーに注ぎます。毛髪が入ったフラスコに脱イオン水400 millilitersを注ぎ、毛髪が完全に浸っていることを確認してから、フラスコを再び振盪浴に戻し1時間置きます。振盪浴からフラスコを取り出し、残りのKES 400 millilitersを、先に回収したKESが入っている1000 milliliterビーカーに注ぎます。毛髪はもう不要ですので、最寄りのゴミ箱に廃棄してください。テキストのプロトコルに従って回収したKESを中和した後、その溶液を500 milliliterの丸底フラスコに約4分の1まで満たします。フラスコがしっかりと接続されていることを確認し、製造元のプロトコルに従って蒸留器を1.25時間運転させます。すべてのKESが蒸留されるまで、この工程を繰り返します。蒸留したKES溶液を、12本の14 mLコニカルチューブに等量ずつ分注します。チューブを1,050 ×gで10分間遠心分離します。遠心分離後のKESを、回収されたデブリを巻き込まないように注意しながら、清潔なビーカーに注ぎます。すべてのKESの遠心分離が終わるまでこれを繰り返します。次に、透析チューブ用セルロース膜を24インチに切り、チューブの一端をクリップで留めて密閉します。透析チューブ用セルロース膜のクリップされていない側の端を開き、遠心分離したKES溶液60 millilitersをゆっくりとチューブの中に注ぎ入れます。別のクリップを使用して、チューブのこの端を閉じます。透析チューブを2,000 milliliterの脱イオン水が入ったシリンダーに入れ、24時間静置させます。その際、シリンダー内の脱イオン水を3〜4時間ごとに交換してください。その後、透析後のKES溶液をキャップ付きのジャーに移します。このとき、上部に十分な空きスペースを残すようにしてください。蓋をしたジャーを-20 °Cのフリーザーで24時間保存します。24時間の冷凍後、ジャーの蓋を取り外し、凍結乾燥用アンプルに移します。アンプルにシールを装着し、ノブを回して0.133 millibarの真空圧に設定します。水分が完全になくなるまで、サンプルを約48時間凍結乾燥させます。10重量%のケラチン溶液を10重量%のPCL溶液に滴下して、PCLとケラチンの比率が90:10、80:20、70:30、および60:40となる10 mLの溶液を調製します。ボルテックスで攪拌したPCL/ケラチン溶液を約8 mL、直径0.5 mmのプラスチックチューブを装着した10 mL使い捨てシリンジに注入します。シリンジポンプにシリンジをセットし、流量を 2.5 milliliters per hour に設定します。チューブに接続されたニードルの先端に電圧を印加します。チューブに 19 to 22 kilovolt の電圧をかけ、コレクタードラムを約 200 RPM で回転させます。繊維を16平方ミリメートルのサンプルに切り出します。生体適合性シリコン系接着剤を使用して、各サンプルを直径12ミリメートルのカバーガラスに固定します。繊維サンプルの端をカバーガラスの裏側に接着し、サンプルをカバーガラスに巻き付けます。次に、サンプルの自由端をカバーガラスの背面にも接着し、ガラスの上部には繊維サンプルのみが載っている状態にします。繊維サンプルを24ウェルプレートに入れます。サンプルを80% ethanolに1時間浸漬して滅菌します。脱イオン水を用いて、サンプルからエタノールを洗い流します。次に、基底培地を2 milliliters、サンプルにピペッティングし、5分間サンプル全体を覆うようにします。ファイバーサンプルへの播種には、fibroblast 3T3細胞を使用します。抗生物質と10%胎児ウシ血清を添加したDMEMに細胞を懸濁し、DMEM 1 mLあたり、1平方センチメートルにつき約62,000個の細胞となるように調整します。3T3細胞を含むDMEM溶液1 mLを各ウェルプレートに滴下し、各ファイバー試料が1平方センチメートルあたり約62,000個の細胞で覆われるようにします。ウェルプレートを37°C、5%二酸化炭素条件下で24時間インキュベートします。乾燥させたPCL/ケラチンナノファイバー膜を切断した後、900 mm²のサンプルを80%アルコールで10分間浸漬し、滅菌します。次に、膜を脱イオン水で十分に洗浄します。その後、サンプルを15 mLのPBS（pH 7.5）に入れ、37 °Cでインキュベートし、3日ごとにバッファーを交換します。1週間および7週間の指定の間隔で、溶液からメンブレンを取り出します。脱イオン水で洗浄します。メンブレンサンプルを凍結乾燥機用アンプルに入れます。アンプルにシールを付け、真空状態にして、試料が完全に乾燥するまで24時間凍結乾燥させます。次に、乾燥させた試料を銅テープを用いて走査電子顕微鏡（SEM）のステージに固定します。ステージをスパッタコーターに入れ、15 mAで1分30秒間、金コーティングを行います。サンプルをSEMのチャンバーにロードします。加速電圧1.5 kilovolts、電流5 microampsで繊維サンプルを観察します。PCL/keratin比が70:30、80:20、および90:10の溶液から正常に電界紡糸されたPCL/keratinベースのナノファイバーの代表的な画像がここに示されています。電界紡糸されたファイバーのヤング率は、天然組織に近い値であることが分かりました。ヤング率はケラチン比率の増加に伴い低下しました。図は、PCL/ケラチン比に対するヤング率の変化のグラフ傾向を示しています。ここに示したフーリエ変換赤外分光法（FT-IR）スペクトルは、PCLがケラチンに結合していることを裏付けています。1,722 cm⁻¹で測定された主要なピークは、PCL吸収帯の標準的な基本測定値と一致しており、すべてのスペクトルで確認できます。PCLケラチン繊維上での細胞接着および増殖は、この繊維に毒性がなく、細胞成長をサポートすることを裏付けています。ナノファイバーに沿った糸状仮足の成長は、線維芽細胞とPCL/ケラチンファイバーとの良好な相互作用を示しています。このナノファイバー合成技術を習得すれば、適切に行うことで24時間以内に完了させることが可能です。電界紡糸の手順を行う際は、ポリマー溶液の粘度、溶液の流速、印加電圧、回転ドラムの速度、および線維芽細胞の培養手順を留意することが重要です。このビデオを視聴することで、PCL/ケラチンベースのナノファイバーの合成方法と、それが生物医学工学分野においていかに重要であるかを十分に理解することができます。この手順に従い、細胞生存率やin vivo分解試験などの他の手法を実施することで、組織に対する毒性反応、組織の増殖、およびファイバーの分解に関するさらなる疑問を明らかにすることが可能です。この技術の開発により、再生工学分野の研究者が、皮膚再生、創傷治癒、薬物送達などの領域を探索する道が開かれました。TFEなどの有機溶媒や高電圧を取り扱うことは極めて危険であるため、本手順の実施中は、保護メガネ、白衣、手袋の着用、および溶媒の適切な廃棄などの予防措置を必ず講じてください。

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

特にタンパク質と相互作用することができる官能基が飾られたナノファイバーを製造するための効率的なアプローチを説明する。アプローチは、最初に適切な官能基で官能化ポリマーの調製を必要とします。官能性ポリマーは、エレクトロスピニング法によるナノファイバーに加工される。タンパク質とナノファイバーの結合の有効性は、共焦点顕微鏡によって研究されています。...

バイオ機能ナノファイバーを製造するための手順

エレクトロ足場は、組織工学アプリケーションのためのポストプロダクションを処理することができます。ここでは、複雑な足場を回転するためのメソッドを（連続した回転で）記述し、厚い足場（マルチレイヤーによる熱を使用するか、水蒸気アニール）を行うために、無菌性（無菌製造又は殺菌のポストプロダクション）を達成するために、適切な生体力学的特性を達成するために。...

組織工学のためのエレクトロ繊維のポスト処理

単一または複数の細胞外マトリックスタンパク質からナノファイバーおよび複合ナノ構造体を得るための方法が記載されている。この方法は、組織工学及びバイオテクノロジーの様々なアプリケーションで使用するために調整可能な組成物およびアーキテクチャに自立タンパク質ベースの材料を作成するために、タンパク質 - 表面相互作用を使用する。...

表面開始アセンブリの使用ECMタンパク質のナノファイバーおよびナノ構造エンジニア

ポリ（グリセロール - ドデカン）という小説の生分解性ポリマーから新たに設計されたコレクタを経由して、より大きな沈着領域にまたがるエレクトロ長繊維（PGD）の合成及び製造が報告された。繊維は、マウス多能性幹細胞に由来する細胞の増殖を支持することができた。...

マウス胚性幹細胞からの神経組織エンジニアリングのためのポリエレクトロ繊維状足場（グリセロール - ドデカン）

ここでは、繊維のグラデーション組織とのエレクトロスピンナノファイバー足場を作製し、細胞形態/方向を調節することでアプリケーションを探求するプロトコルを提示する。ナノファイバー足場の物理的および化学的性質に関して勾配が生物医学分野での幅広い用途を提供する。...

繊維組織における階調の電界紡糸ナノファイバー足場

二次元および三次元の超疎水性高分子材料は、生分解性ポリマーをエレクトロスピニングまたはエレクトロスプレーして調製し、類似の組成の低表面エネルギーポリマーと混合します。...

バイオメディカル応用のための超疎水性高分子材料を製造します

この原稿を作製し、ひと免疫不全ウイルス 1 型感染に対して強力な接着剤や抗ウイルス活性を示す Griffithsin 変更ポリ (乳酸グリコール酸) 電極として繊維を特徴付けるプロシージャを記述します。生体外で。合成に使用するメソッド表面変更、共役, 結果として得られる形態の特徴し、繊維の表面改質から Griffithsin...

作製と評価 Griffithsin 変更繊維足場の防止のため性的感染

このプロトコルの目的は、ヤヌスベースナノチューブ(JBNT)とフィブロネクチン(FN)を用いたバイオミメティックナノマトリックス(NM)の組み立てを示すものです。ヒト間葉系幹細胞(hMCs)と共培養すると、hMSCの接着を促す優れた生理活性を示します。...

ヤヌスベースナノチューブと幹細胞接着のためのフィブロネクチンによるバイオミメティックナノマトリックスの製造

プラスチックメンブレンを使用した組織培養インサートは、細胞層やバリア組織のモデルを確立するための透過性サポートとして、細胞培養ラボのゴールデンスタンダードです。ここでは、プラスチックメンブレンを、組換え官能基化されたクモの糸タンパク質から作られた、より生物学的に関連性のあるメンブレンに置き換える簡単な方法を紹介します。...

ナノフィブリル基底膜模倣品 カスタムメイドの組織培養インサートに組換え官能基性クモの糸で作られました

次のプロトコルは、ナノスケールのパターン化されたフィブリルを用いたコラーゲンハイドロゲルの製造のためのせん断ベースの押出法を示しており、これは幅広い組織工学アプリケーションに適用することができます。...

組織工学のためのナノフィブリルパターンコラーゲンの作製

学ぶ ケラチンベースのナノファイバー合成法。電気紡糸法でケラチン/PCLナノファイバーを作製し、組織工学や創傷治癒、薬物送達への応用可能性を評価する。細胞増殖を支持し、生体適合性に優れた材料開発に役立つ。

医工学のためのケラチンベースのナノファイバーの合成

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