Name: ヒト末梢血からの血液伸長内皮細胞の生成と文化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: 学ぶヒト末梢血から血液伸長内皮細胞（BOEC）を生成・培養する方法。密度勾配遠心とコラーゲンコーティングを用いて、少量の血液から安定した細胞集団を確立し、血管生物学研究や心血管疾患の病態解明に活用できます。

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この作業は、British Heart Foundation (BHF)、Dinosaur Trust、McAlpine Foundation、Fondation Leducq、Fight for Sight、Cambridge Biomedical Research Centre、National Institute of Health Research、(i) BHF Oxbridge Centre of Regenerative Medicine [RM/13/3/30159]、(ii) BHF Cambridge Centre of Research Excellence、(iii) Addenbrooke's Hospital、Cambridge University Hospitals NHS Foundation Trust、(iv) Papworth Hospitalsの助成金によって支援されました。NHS Foundation Trust、およびCambridge NIHR BRC Cell Phenotyping Hubを支援しました。MLOは、BHFインターミディエイトフェローシップによって資金提供されています。FNKは、BHF博士課程の学生制度によって資金提供されています。

BOEC生成プロトコルの概略図を図1に示されています。 1.採血や密度勾配遠心<ol><li>各ドナーのために、2つの50mlコニカル遠心管のそれぞれにクエン酸ナトリウムを3mlを加えます。静脈穿刺によって血液の60ミリリットルを収集し、各チューブに30ミリリットルを追加します。混合する優しく2〜3回反転します。それに応じて調整クエンボリュームで、プロトコルで血液のわずか40ミリリットルを使用してください。 注：血液サンプルを採取後2時間以内に処理されることが不可欠です。成長コロニー収率の著しい減少で血液結果の処理を遅延。 </li><li>まず混合するボトルを数回反転させて密度勾配遠心分離媒体を含む新しいコニカルチューブを準備します。無菌フードでは、50mlコニカルチューブ（血液のすべての10ミリリットルのための1チューブ、ドナーあたり6チューブ）あたりの密度勾配遠心分離培地の15ミリリットルを追加します。 </li><li>ダルベッコのリン酸を1：1に希釈血液-Buffered生理食塩水（DPBS）。作業面と20°の角度に密度勾配遠心分離媒体を含むチューブを傾け。ピペットエイドおよび25 mlの血清学的ピペットを使用して、ゆっくりと徐々に傾斜管の壁ダウン血液を添加することにより、媒体上に希釈された血液を21 mlのレイヤ。 注：これを行うと、密度勾配層と血液の混合を最小限に抑えることができますし、より厳しいバフィーコートだけでなく、強化された収量を生成します。 </li><li>アクセルとブレーキをオフにして室温で35分間、400×gで遠心分離し、サンプル。 </li><li> 2.4 - この遠心分離期間中、ステップ2.1で詳述コラーゲンコーティングを開始します。これらの手順は、3.1のステップに進む前に完了していることを確認します。 </li></ol> T-75フラスコおよび培養培地の調製の2コラーゲンコーティング注：細胞培養​​フードで次の手順を実行します。 <ol><li>在庫のTyを希釈して50μg/ mlのコラーゲン溶液を準備します私は0.02M酢酸10mlにコラーゲンPE 例：コラーゲン在庫について4.05 mg / mlの、0.02 M酢酸10 mlにコラーゲンの123.5μLを加えるの濃度で。滅菌フィルターコラーゲン懸濁液を使用前。 </li><li>血清学的ピペットを使用して、T 75、細胞培養フラスコへのコラーゲン溶液の7.5 mLを加え。このボリュームは、5μgのコラーゲン/ cm 2の（または375μgの/フラスコ）を与えます。 RTで1時間コートフラスコ。 </li><li>メーカーが提供する成長因子サプリメントと内皮基礎培地を補充することによってBOEC生成に使用される血管内皮増殖培地を準備します。すべてのサプリメントを追加するが、血清を追加しないでください。 BOEC生成培地15mlのを準備するために、成長因子サプリメントを含有する内皮増殖培地の12.5 mlに定義されたウシ胎児血清（FBS）を2.5mlを加えます。 </li><li> 、1時間のコーティング期間の後第3節で説明したステップに進んでコラーゲン溶液を吸引し、ピペッティングにより残留酢酸を洗い流します10ミリリットルのDPBSインチDPBSを吸引除去し、もう一度この洗浄ステップを繰り返します。ステップ3.3の間に得られた細胞懸濁液は、この時点でめっきする準備ができていない場合は、乾燥アウトからコラーゲンコーティングを維持するためにフラスコにBOEC世代媒体5mLのを追加します。 </li></ol> 3.収集とPBMNCsのめっき<ol><li>ステップ1.4において概説密度勾配遠心分離後、注意深く滅菌プラスチック製トランスファーピペットを用いて、軟膜層を収集します。軟膜の収集は、各チューブからの細胞懸濁液とプラズマの約20ミリリットルが得られるはずです。密度勾配媒体を移送避けます。 </li><li>単核細胞懸濁液1を希釈：DPBS中1と混合するために反転します。最大でブレーキとアクセルで300×gで20分間、室温で遠心分離します。 </li><li>遠心分離した後、ダウンを繰り返し、各ペレットにBOEC世代培地1mlを添加し、ピペッティングにより上清および再懸濁細胞を吸引します。プール細胞は、懸濁液残りの培地で10mlにDトップアップ総容量。 </li><li>総細胞数、細胞懸濁液のサンプルを10μlの推定を取得し、赤血球を溶解しますチュルク液490μLで50倍に希釈します。血球計数器を用いて希釈細胞懸濁液の10μlのサンプルをカウントします。 注：血液の60mLのがめっきに約100〜150×10 6の白血球細胞が得られるはずです。 </li><li>シングル、コラーゲンコートT-75フラスコにプレート全体の細胞懸濁液、5％CO 2を含む加湿雰囲気中で37℃で15mLの/フラスコと文化にトップアップ中量。この時点で播種した細胞は、継代0を表します。 注：これは、後で、またはBOECsを生成することができる別の研究所にPBMNCsを輸送するためにBOECsを導出するために前のBOEC分離に孤立PBMNCsを凍結することが可能です。しかし、凍結PBMNCsはBOEC分離の効率を低下させることができることに留意することが重要です。 S方法については、以下のEE部8。 </li></ol> 4.長期細胞培養<ol><li>新鮮BOEC生成培地15mlを加えることによって、培地を2日毎に変更（5：内皮細胞増殖培地の1：1混合物およびFBSを定義）。週末のために、培地の変更は、3日ごとに遅延させることができます。 注：伸長コロニーを培養7日および14日の間に表示されます。 </li><li>成長コロニーの出現のために日7月14日にBOEC培養フラスコを監視します。古典的な内皮石畳の形態を示す細胞の円形グループなどのコロニーを識別します。 </li><li>コロニーまたは複数のコロニーをフラスコ内で識別されると、メディアの変更を続行し、コロニーが継代前にコロニー当たり約1000〜2000個の細胞まで成長することができます。ラフ視覚推定を通じてコロニーあたりの細胞数を決定します。 注：ガイドとして、それは一週間最初の成長コロニーの同定後の経過初期の成長コロニーのが通例です。 </li> &lt;LI&gt; DPBS 10mlで二回フラスコをすすぐことによって継代細胞。 1Xトリプシン-EDTAの5 mlを加え、5分間37℃のインキュベーターでインキュベートします。 5分後、培地（FBSを含有する）を10 mlのトリプシンを中和し、ピペット操作を繰り返すと、懸濁液中に細胞をもたらします。 </li><li>遠心5分間300×gでサスペンション、新鮮BOEC世代培地15ml中に再懸濁し、（継代1、P1を表す）は、新しいT-75フラスコに、全細胞懸濁液をプレート。いいえコラーゲンコーティングは必要ありません。 </li><li>細胞がコンフルエント（フラスコ当たりおよそ3〜5×10 6個の細胞 ）になるまで上記のように培地交換を続けます。コンフルエント後、継代細胞、ステップ4.3に記載のように。 注：以降通路2から、細胞はもはやBOEC生成培地を必要とせず、内皮細胞増殖培地と10％の標準的な熱不活性化FBSで培養することができます。コラーゲンの存在がBOEC proliferを高めることができることを示唆する証拠があるので、コラーゲンコーティングは、今後の任意のステップとして使用することができエーション率。 </li><li>継続継代のために、などの低細胞密度がBOECsが増殖を停止させることができ、T-75フラスコあたり75万細胞よりも少ないプレートなし。 </li></ol> 5.凍結融解BOEC文化<ol><li> 5分間300×gで4.3節と遠心分離機で説明したように細胞をトリプシン処理。培地10mlに再懸濁上清を吸引除去します。これは、内皮細胞増殖培地を必要としません。 10％標準FBSを含むDMEMで十分です。血球計数器を使用して、手動細胞数を実行するように細胞懸濁液の10μlのサンプルを収集します。 </li><li>氷のように冷たい凍結保存培地（50％FBSおよび10％DMSOを40％のDMEM）で2×10 6細胞/ mlで再遠心し、再懸濁します。液体窒素に転送する前に少なくとも2時間、-80℃の冷凍庫で氷冷イソプロパノール凍結保存容器と場所に場所バイアルを、各バイアルに0.5ミリリットル（10 6細胞 ）を追加します。以上24時間-80℃で細胞に放置しないでください。 </lI&gt; <li>セルを解凍するには、15ミリリットルコニカル遠心チューブに予め温めた培地10mlを追加します。 注：継代1細胞を解凍する場合、解凍後の最初の2日間のFBSを定義して20％を補充した内皮細胞増殖培地中に解凍します。これは、今後、より安定した細胞の単離につながります。 </li><li>わずかな氷の結晶がバイアル内に残されるまで、穏やかに攪拌しながら37℃の水浴中で液体窒素と融解から細胞を取り出します。コニカル遠心チューブにバイアル滴下の内容を追加し、5分間300×gでスピンダウン。 </li><li> 10ミリリットルEGM-2MV + 10％FBS中で上清を吸引および再懸濁細胞ペレット。 T-75フラスコとトップまで15ミリリットルの培地に追加します。 </li></ol>フローサイトメトリーによるBOECsの6キャラクタリゼーション<ol><li>染色緩衝液1ml当たり10 6細胞の濃度でセクション4.4および再懸濁で説明したように第4節で説明BOECコロニーは、トリプシン処理細胞を拡大することが許可されたら（DPBSウィットH 2％FBSおよび2mM EDTA）。 </li><li> CD45、CD14、CD34、CD31（一時20希釈ですべてを使用）またはVEGFR2（1:10希釈）（詳細については表1を参照）に対する蛍光標識抗体を用いて10 5個の細胞を結合します。暗所で4℃で30分間インキュベートします。 </li><li> 5分間300×gで1ミリリットル染色緩衝液および遠心分離で細胞を洗浄します。上清を吸引し、分析のために400μlの染色緩衝液中に再懸濁します。 4℃で細胞を維持し、分析前に、光から保護。 </li><li>アッセイで使用する蛍光標識抗体を検出するために装備サイトメーター上のサイトメトリー分析を実行します。 </li><li>前方調整および側方散乱電圧だけでなく、FITCおよびAPCのチャネルの電圧によってサイトメーターで細胞集団を識別するために染色されていないBOECサンプルを使用してください。 </li><li>各蛍光色素のためのアイソタイプ染色された細胞を使用してしきい値をゲートするかを決定します。 presencに基づいて、各細胞表面マーカーの陽性を評価蛍光色素のためのアイソタイプコントロールに対する蛍光強度のピークシフトのeが分析されています。 </li></ol>免疫蛍光顕微鏡によるBOECsの7キャラクタリゼーション<ol><li>プレートBOECs内皮細胞増殖培地500μl中5×10 4個の細胞ウェル当たり+ 10％熱不活性化FBSの密度でカバースリップなしの24ウェル、平底組織培養プレート中で、37に付着して成長するままにC°、5％CO 2の細胞がウェル（光microsope下で目視検査によって推定コンフルエントに）それぞれの面積の少なくとも70〜80％をカバーするまで。 </li><li> DPBS 1mlで5分間、各ウェル中の細胞を洗浄します。 </li><li> DPBS中の4％パラホルムアルデヒド溶液500μlを用いて4℃で細胞O / Nを修正。 </li><li>ウェルあたりのDPBS 1mlで3×5分間、細胞を洗浄します。それぞれ、ピペットと吸引器を使用して、DPBSを追加し、削除します。 </li><li> DPBS中0.2％のポリソルベート20で3×10分間、細胞を透過性。 </li&gt; <li> DPBS中に10％FBSを含有するブロッキング緩衝液中で室温で1時間、細胞をインキュベートします。 </li><li>またはvWFを（1：250）：CD34（10 / mlの）、CD144（300 1）に対する一次抗体を含む抗体希釈緩衝液（DPBS中の0.1％ウシ血清アルブミン）300μlの中で4°CO / Nで染色細胞。詳細については表1 を参照してください。 </li><li> DPBSで5×10分間の未結合の一次抗体を洗い流します。 </li><li> （1：200ですべての） 表1に詳述するように、適切な蛍光標識二次抗体と室温で1時間、細胞をインキュベートします。 </li><li> DPBSで5×10分間、非結合二次抗体を洗い流します。 </li><li> RTで10分間、DPBS中1μg/ mlの4 &#39;、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）で細胞をインキュベートします。 </li><li>さらに3×5分間DPBSで細胞を洗浄。 </li><li>アタッチ用いた蛍光励起用の外部光源を備えた倒立顕微鏡を用いて100倍の倍率で画像セル、キャプチャ画像その後の分析をオフラインでのEDデジタルカメラ。 </li></ol> 8.凍結融解PBMNCs <ol><li>ステージ3.2の終了時に、遠心分離後、培地を吸引し、手動で繰り返しピペッティングを上にして、およびP1000のピペットチップを使用したダウン細胞ペレットを崩壊させます。細胞懸濁液を生成するために穏やかに混合することを確認し、凍結培地、90％血清、10％DMSO中の1ミリリットルを追加します。第5節で説明したようにクライオバイアルと凍結融解に細胞懸濁液を転送します。 </li></ol>

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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

我々は、成人末梢血単核球(PBMNC)からのBOECの堅牢かつ効率的な誘導を可能にする詳細なプロトコルを提示する。私たちのプロトコルには、BOEC分離の以前の方法の進歩を表す2つの重要な改良が含まれています。14-16 これらには、最初のPBMNC培地にヘパリンが含まれていないこと、および定義された胚性幹細胞認定血清の使用が含まれます。この後者の改良は特に重要です。胚性幹細胞 (ESC) 認定血清は、より一線性のあるグレードの血清であり、BOEC 単離に利益をもたらす血清中にどの成分が豊富に含まれているかはまだわかっていませんが、この定義された血清が BOEC 生成の効率に及ぼす影響は明らかです。また、ヒト血清を用いたBOECの単離にも成功しており、臨床翻訳用のBOECの生成も可能となっています。私たちの手にかかれば、この洗練されたプロトコルは、ドナーの90%以上から安定したBOEC培養物の単離に成功し、これまでに報告された最も信頼性の高いBOEC生成方法の1つとなっています。 特定の血清の使用は BOEC 生成にとって重要ですが、現在のプロトコルの主な制限でもあります。この技術の将来の改善には、無血清の定義された培養条件でのこれらの細胞の生成が含まれる可能性があります。
プロトコルの重要なステップには、収集後できるだけ早く血液サンプルを処理すること、密度勾配遠心分離後のバフィーコート細胞の完全な採取、およびP0からP1への初期コロニーのタイムリーな継代が含まれます。この継代ステップは、安定した分離を確立するために重要です。他の内皮細胞と同様に、BOECはプレーティング密度に非常に敏感であるようです。継代後のめっき密度が低すぎると、BOECは増殖しません。逆に、継代前にコロニーが過剰にコンフルエントになると、細胞も増殖を停止し、細長い間葉系細胞表現型に変換する傾向があります。7日目から14日目にコロニーがほとんど現れない場合、またはコロニーのサイズが小さい場合、トラブルシューティングには、P0コロニーをT-75ではなくT-25フラスコに継代することによる細胞密度の増加が含まれます。
この技術が習得されると、得られたBOECは、内皮細胞生物学の in vitro 研究、疾患モデリング、薬物スクリーニング、 in vivo 細胞移植療法など、いくつかのアプリケーションに使用できます。細胞治療プロセスの開発における重要な考慮事項は、病原性変異のない細胞を使用することです。私たちは以前に、私たちのプロトコルを使用して単離されたBOECは、コピー数の変異のないゲノムを有しており、したがって、それらが収集された個人を代表することを示しました。さらに、BOEC由来のiPS細胞株の大部分にはコピー数の変動がないことも実証しました。13 これは、線維芽細胞由来iPS細胞におけるコピー数変動に関する以前の報告とは対照的です。今日まで、これらの細胞は、この程度のゲノム忠実度が報告されている唯一のiPS細胞です。この特徴は、iPS細胞生物学の分野と、疾患モデリング、薬物スクリーニング、および将来の細胞移植療法におけるiPS細胞の使用にとって重要です。

最近までは、新しい血管の出生後の発生は、既存の血管の内皮細胞からの新しい血管の出芽のように定義される、血管新生と呼ばれるプロセスを介して排他的に起こると考えられていた。1このプロセスは、脈管形成の対比、または胚発生の間に排他的に起こると考えられていた血管内皮前駆細胞からの血管のデノボ形成2が、より最近の研究では、同定され、成人の末梢血中の内皮前駆細胞（EPC）を循環する単離しました。これらの細胞は、培養中で成熟内皮細胞に分化する能力を有し、出生後の血管に関与すると考えられている。3,4 これらのEPCの単離および拡張のためのプロトコールは、典型的にはvascul含む内皮増殖因子を含む培地で、末梢血単核細胞（PBMNCs）の培地を含みますAR内皮増殖因子（VEGF）および線維芽細胞増殖因子-2 5-8 EPC培養は劇的に異なる細胞型の多様性を生み出します。初期の文化（&lt;7日）は、「初期」のEPCとして文献で知られている単球細胞の種類によって支配されています。その名前にもかかわらず、これらの細胞は、単球マーカーCD14を発現し、前駆細胞マーカーCD34について陰性であると古典内皮マーカーCD31およびVEGF受容体2（VEGFR2）の最小限のレベルで発現する。5継続文化は、細胞の二次集団に生じます後半伸長のEPCまたは内皮様細胞のように控えめなコロニーを出現する血液伸長内皮細胞（BOECs）、として知られています。単球の早期のEPCとは異なり、また、内皮コロニー形成細胞（ECFCs）、伸長内皮細胞または後期成長内皮細胞と呼ばれているBOECsは、内皮細胞単層の典型的なものである敷石状の形態を示し、表面マーカーに非常に似ています5遺伝子発現9は、内皮細胞に成熟します。 末梢血からの内皮様細胞の生成は、特に、肺動脈性肺高血圧症（PAH）10またはフォンヴィレブランド病などの血管障害に関連した内皮細胞の機能不全の研究のために、いくつかの利点を提供しています。11前BOECsの可用性に、内皮細胞は死だけや臓器移植の際に外植臓器由来、または出生時の臍帯静脈から単離することができました。この減少可用性は、内皮、心臓血管疾患の患者由来の細胞、ならびに内皮細胞および血液細胞または壁細胞のいずれかの間の相互作用の生物学の理解に重大な制限を表します。また、これらのソースからの内皮細胞の純粋な集団を単離し、培養して技術的に困難であり、これらの方法によって誘導された細胞のみが限られを示しますD増殖能力。 BOECsは、したがって、患者由来の初代内皮細胞の単離および培養のための貴重な代理を提供しています。 それらのインビトロ用途に加えて、BOECsは、自家細胞移植療法においても有用である可能性があります。これらのアプリケーションは、内皮細胞の血管新生を促進するための移植（12およびその中の参考文献を参照のこと）、ならびに人工多能性幹細胞（iPS細胞）の発生の両方を含む。13 BOEC由来のiPS細胞は、疾患のモデリングのために使用され、出発物質として巨大な可能性を提供することができ自家細胞治療用材料。 BOECsは、より速く、皮膚線維芽細胞よりも高い効率で再プログラム。さらに、BOECsも翻訳アプリケーションに適して任意の技術の本質的な特徴である、核型異常のないiPS細胞の生成を可能にします。患者の血液サンプルAからiPS細胞を生成する能力LSOは、それによって創傷治癒障害を有する患者からの細胞の発生を促進する、皮膚生検および皮膚線維芽細胞の生成のための必要性を排除する、または非常に若いです。 以下に詳述するプロトコル、によって承認され、国家研究倫理サービス委員会（東イングランド）のガイドラインに沿って行われ、比較的小容量から90％以上の効率でBOECsの生成のための、シンプルで信頼性の高い方法を提供する（60 ml）の末梢血。これらの細胞は、高度に増殖性であり、単一の血液サンプルからの細胞の数百万の生成を可能にする、繰り返し継代することができます。

<table><tbody><tr><td>採血用</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>60mlシリンジ、ルアーロックチップ付き</td><td></td>BD <td>309653</td><td></td></tr><tr><td>19G Surflo Winged Infusion Set</td><td>Terumo</td><td>SV-19BL</td><td></td></tr><tr><td>50 mlコニカル遠心チューブ</td><td>StarLab</td><td>E1450</td><td>2 per donor</td></tr> ク<tr><td>エン酸ナトリウム</td><td>Martindale Pharmaceuticals</td><td>270541</td><td></td></tr><tr><td>名前</td><td>会社</td><td>カタログ番号<</td><td>strong>コメント</td></tr><tr><td>For buffy coat isolation</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque Plus</td><td>GE</td><td>Healthcare 17-1440-03</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's PBS(Ca2+およびMg2+)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr>滅菌<tr><td>包装プラスチック移送ピペットアップル</td><td>トンウッズ</td><td>KC231</td><td></td></tr><tr><td>トルコ's Solution</td><td>Millipore</td><td>1.093E+09</td><td></td></tr><tr><td>Name<</td><td>strong>企業名</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>細胞培養、継代および凍結細胞用</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Type 1コラーゲン(ラットテール由来)</td><td>BD Biosciences</td><td>35-4236</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコs PBS (Ca2+ および Mg2+)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>0.02M 酢酸&nbsp;</td><td>試薬グレードの水で調製</td>された<td>Sigma-Aldrich</td><td>A6283</td></tr><tr><td>内皮成長培地-2MV (Bullet Kitを含むが、血清を含まない)</td><td>Lonza</td><td>CC-3202</td><td>注: 培地にはヘパリンが含まれていないことが重要です。&nbsp;&nbsp; EGM-2は使用しないでください</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清(米国)、定義</td><td>ハイクロン</td><td>SH30070</td><td></td></tr><tr><td>10x トリプシン EDTA</td><td>Gibco</td><td>T4174</td><td>使用前にPBSで1倍に希釈</td></tr><tr><td>熱不活性化 FBS</td><td>Gibco</td><td>10500-064</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>41965-039</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>276855</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene Mr. Frosty 冷凍容器</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1562</td><td></td></tr><tr><td>名前</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>strongコメント</td></tr><tr><td>フローサイトメトリーキャラクタリゼーション</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FITC標識マウス抗ヒトCD14</td><td>BD Biosciences</td><td>555397</td><td>Mouse IgG1k, クローン: WM59 希釈: 1:20</td></tr><tr><td>FITC-conjugated mouse anti-human CD31</td><td>BD Biosciences 555445</td><td></td><td>Mouse IgG1k, Clone: WM59 Dilution: 1:20</td></tr><tr><td>APC-conjugated mouse anti-human CD34</td><td>BD Biosciences</td><td>555824</td><td>Mouse IgG1k, クローン:581/CD34 希釈率:1:20</td></tr><tr><td>FITC標識マウス抗ヒトCD45</td><td>BD Biosciences</td><td>560976</td><td>Mouse IgG1k, クローン:HI30 希釈率:1:20</td></tr><tr><td>&nbsp;APC標識マウス抗ヒトVEGFR2</td><td>R&D Systems</td><td>FAB357A</td><td>Mouse IgG1, クローン: 89106 希釈: 1:10</td></tr><tr><td>FITC 標識マウス IgG1k アイソタイプコントロール</td><td>BD Biosciences</td><td>555748</td><td>クローン: MOPC-21 希釈: 1:20</td></tr><tr><td>APC 標識マウス IgG1k アイソタイプコントロール</td><td>BD Biosciences</td><td>555751</td><td>クローン: MOPC-21 希釈率: 1:20</td></tr><tr><td>APC 標識マウス IgG1k アイソタイプコントロール</td><td>R&D Systems</td><td>IC002A 希釈率: 1:10</td><td>クローン: 11711</td></tr><tr><td>EDTA, 0.5M solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7889</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>カタログ番号</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>免疫蛍光顕微鏡用&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Corning Costar 24ウェル組織培養プレート</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3527</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>ポリソルベート 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2287</td><td></td></tr><tr><td>モノクローナルマウス抗ヒトCD34抗体</td><td>R&D Systems</td><td>MAB72271</td><td>Clone 756510、IgG1、10 &mu;g/ml</td></tr><tr><td>ポリクローナルヤギ抗ヒトVE-カドヘリン (CD144)</td><td>R&D Systems</td><td>AF938</td><td>抗原親和性精製 IgG、1:300</td></tr><tr><td>モノクローナルウサギ抗ヒト Von Willebrand Factor (vWF)</td><td>Abcam</td><td>ab154193</td><td>クローンEPSISR15、1:250</td></tr><tr><td>Donkey 抗マウス IgG (H+L) 二次抗体、Alexa Fluor 488 コンジュゲート</td><td>Life Technologies</td><td>A-21202</td><td>ポリクローナル、2 mg/ml、1:200 ドン</td></tr><tr><td>キー抗ヤギ IgG (H+L) 二次抗体、Alexa Fluor 488 コンジュゲート</td><td>で使用Life Technologies</td><td>A-11055</td><td>ポリクローナル、2 mg/ml、1:200</td></tr><tr><td>ロバ抗ウサギ IgG (H+L) 二次抗体、Alexa Fluor 568 コンジュゲート</td><td>Life Technologies</td><td>A-10042</td><td>ポリクローナル、&nbsp; 2 mg/ml、1:200</td></tr><tr><td>DAPI(4&prime;、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール二塩酸塩)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td>1 &mu;グラム/ミリリットル</td></tr></tbody></table>

ヒト末梢血からの血液伸長内皮細胞の生成と文化

Generation and Culture of Blood Outgrowth Endothelial Cells from Human Peripheral Blood

歴史的に、血管障害を持つ患者からの一次内皮細胞の利用可能性が限られていることが、これらの個人の内皮機能障害の根底にある分子メカニズムの研究を妨げてきました。しかし、最近、成体末梢血中の循環内皮前駆細胞から作製された血液伸長内皮細胞(BOEC)の同定により、患者由来の内皮細胞に内皮様の初代細胞代理を提供することにより、この制限を回避できる可能性があります。BOECは、内皮生物学と疾患モデリングの理解に価値があるだけでなく、内皮細胞移植治療にも使用できる可能性があります。また、核リプログラミングによる人工多能性幹細胞(iPSC)の作製に適した細胞基質であり、他の細胞タイプに比べて多くの利点があります。ここでは、これらのアプリケーションやその他のアプリケーションで使用するための、成人末梢血からのBOECの信頼性の高い生成、培養、および特性評価の方法について説明します。このアプローチにより、(i)比較的少量の成人末梢血から患者特異的な内皮細胞を作製でき、(ii)形態、細胞シグナル伝達、遺伝子発現において一次内皮細胞と非常に類似した細胞を作製できます。

血液を60mlのバフィーコート単核細胞の単離は、典型的には6 100-150x10総白血球をもたらします。単一のT-75フラスコにプレーティングしたとき、未溶解細胞懸濁液中の細胞の大多数は、それが困難な明視野顕微鏡を使用して、個々の接着細胞を解決することができます。繰り返し中の変更は、非接着細胞のクリアランスをもたらし、「初期」のEPC単球の接着性の人口の可視化を可能にします。 7日目に、T-75は、約7×10 6これらの細長い接着細胞のが含まれています。 7〜14日から、BOECsのコロニーをフラスコ（ 図2A）内に表示されます。コロニーは、最初の3〜5に隣接するセルとして表示されます。伸長コロニー数は、血液の60 mlのあたり1から10個のコロニーから変えることができます。一般的には、（ すなわち 、20〜25歳）の若いドナーはまた、以前の文化の中で表示される成長コロニー、より多くの数を生成する傾向があります。BOECsは、数百の細胞からなる円形のコロニーを形成する細胞のこの中央のグループから増殖します。これらのコロニー内の細胞は、古典的な内皮石畳の形態を示します。 彼らは植民地あたり約1000個の細胞が含まれている場合には、通路初期コロニーに好適です。伸長コロニーは、通常7日文化の中で彼らの元の外観の後にこのサイズに達します。元のコロニーを新たなT-75フラスコに継代されると、それらは（ 図2B）、5日以内にコンフルエントな単層（フラスコ当たり3-5x10 6細胞 ）を形成するように増殖しなければなりません。アイソレーションの小さな割合（&lt;10％）で、成長コロニーが表示されない、またはこの初期継代工程の後に、十分に増殖しません。彼らの最初の継代後の低増殖性を示すBOECsはほとんど安定BOECアイソレーションとなり、多くの場合、2〜3の通路内に増殖を停止するために行くん。単球のBOECの文化の中に含まれている初期のEPCは、非増殖性であり、典型的には1-2の通路内の培養液から消去されます。これらの初期の細胞のクリアランスは、継代を繰り返し継代と非増殖初期のEPCの希釈後に再付着する初期の細胞の故障細胞死に起因するものです。 継代1細胞を、培養中にさらに継代または後で使用するためにダウンして凍結することができます。安定した分離が生成されると、細胞が静止になる前に通路8または9までアップ3-5新しいT-75フラスコに1コンフルエントなフラスコの割合で継代することができます。ここでも、細胞密度は文化を通じて重要です。我々の経験では、ないより少ない75万よりも細胞は増殖停止を引き起こす可能性が低い細胞密度として、T-75フラスコ中に播種する必要があります。 BOECsの高い増殖能力にもかかわらず、細胞は、このような（フラスコ当たりすなわち 、&gt; 5×10 6細胞 ）overconfluentになることを許されるべきではないCONVERSを引き起こす可能性があります<html>非増殖性の表現型へのBOECsのイオン。 我々はBOECとして標識されている任意のセルは、内皮マーカーのための適切な細胞表面および細胞内染色を表示することを提案しています。 BOECsの特徴付けは、典型的な内皮細胞マーカーについて染色後、フローサイトメトリー（ 図3）または蛍光顕微鏡（ 図4）によって達成することができます。 BOECsは、内皮表面マーカーCD31とVEGFR2について陽性であると、単球マーカーCD14および汎白血球マーカーCD45について陰性です。 BOECsもヴァイベル - パラーデ体をposessため、ディスクリート、斑点状の細胞質染色としてフォンビルブランド因子（vWF）を発現します。例えば、肺動脈または大動脈内皮細胞などの他の成熟内皮細胞型とは異なり、BOECsは、それらの表面上に前駆細胞および活性化マーカーCD34を発現します。 ftp_upload / 53384 / 53384fig1.jpg &quot;/&gt; BOEC生成プロトコルの図1の概略図。末梢血単核細胞は、定義されたFBSを含む内皮細胞増殖培地中のコラーゲンコートしたプレート上での密度勾配遠心分離して培養することにより静脈血から単離されます。 BOECコロニーを培養の7〜14日以内に表示されます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53384/53384fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53384/53384fig2.jpg" /> 図代表BOEC文化の2明視野画像。（A）伸長コロニーは石畳の単分子層に配置され、中心点から放射状に増殖している内皮様細胞の集合体として存在日7と14のコロニーの間の文化に表示されます。周囲の成長コロニーは付着モノです初期の培養中の細胞の大部分を構成するcytic細胞。先に説明したように、これらの細胞は、「早期の」内皮前駆細胞は、紡錘状の形態を有しており、単球マーカーCD14を発現します。非増殖性単球細胞が死滅するか失敗のいずれかとして継代後（B）は、増殖性の高いBOECsは継代後に再接続するために、文化を引き継ぎます。スケールバー250μmの。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53384/53384fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/53384/53384fig3.jpg" /> 図フローサイトメトリーによるBOECsの3キャラ。BOECsをトリプシン処理し、特定の表面マーカー（赤線）に対する蛍光コンジュゲートアイソタイプコントロール抗体（満たされたピークを灰色）、または抗体で染色しました。サイトメトリー特性評価のための表面マーカー造血マーカーCD45およびCD14、内皮マーカーCD31とVEGFR2とprogentiorおよび内皮活性化マーカーCD34を含む<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53384/53384fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/53384/53384fig4.jpg" /> 内皮細胞マーカーにBOECsの図4.免疫蛍光染色。BOECsの代表的な免疫蛍光画像は、内皮細胞表面マーカーCD144（VEカドヘリン、右上のパネル）およびフォンヴィレブランド因子（vWF、右下のパネル）糖タンパク血に対する抗体で免疫染色。核DAPI染色を示す対応するパネルが左側に表示されます。スケールバーは50μm。 CD144のため。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53384/53384fig4large.jpg" target="_blank">拡大表示はこちらをクリックしてください</a>この図のバージョン。

このプロトコルは、少量の成体末梢血からの血液増殖内皮細胞(BOEC)の信頼性の高い生成と特性評価を可能にします。BOECは、血管障害患者の内皮細胞の代用として、また人工多能性幹細胞を作製するための基質として使用することができます。

Historically, the limited availability of primary endothelial cells from patients with vascular disorders has hindered the study of the molecular ...

このプロトコルの全体的な目的は、ヒト末梢血から血液アウトグロース内皮細胞（blood outgrowth endothelial cells）を安定的に生成することです。この手法は、肺動脈性高血圧症やフォン・ヴィレブランド病を含む心血管疾患に対して内皮細胞の機能不全がどのように寄与しているかなど、血管生物学分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。この技術の主な利点は、少量の成人末梢血から安定した血液アウトグロース内皮細胞集団を一貫して生成できることです。手順のデモンストレーションを行うのは、私の研究室の大学院生であるChristopher Wangと、研究室教授のNicholas Morrellです。この手順を開始します。ドナーごとに、2本の50 milliliterコニカル遠心チューブにそれぞれ3 millilitersのクエン酸ナトリウムを加えます。次に、採取した血液を各チューブに30 millilitersずつ加えます。チューブを2〜3回緩やかに転倒混和させます。次に、ピペットエイドと25 mLセロロジカルピペットを用い、密度勾配遠心分離用培地が入ったチューブをワークサーフェスに対して20度の角度に傾け、血液60 mLをDPBSで1:1の比率で希釈します。希釈した血液21 millilitersを、緩衝液の上にゆっくりと層状に加えます。その後、アクセラレーターとブレーキをオフにした状態で、室温にて400 times Gで35分間、サンプルを遠心分離します。遠心分離の間に、ストックのType one collagenを滅菌済みの0.02 molar 酢酸10 millilitersで希釈し、50 micrograms per milliliterのコラーゲン溶液を調製します。コラーゲン懸濁液を使用前にろ過します。次に、T 75細胞培養フラスコに7.5 millilitersのコラーゲン溶液を加えます。室温で1時間置いて、フラスコをコーティングさせます。1時間のコーティング後、コラーゲン溶液を吸引し、DPBS 10 millilitersをフラスコに分注して残留した酢酸を洗い流します。DPBSを吸引し、洗浄をもう一度繰り返します。その後、細胞懸濁液の播種準備が整うまでコラーゲンコーティングが乾燥するのを防ぐため、BOEC生成培地 5 millilitersをフラスコに加えます。密度勾配遠心分離の後、滅菌プラスチック転送ピペットを用いて、密度勾配媒体が混入しないように注意しながらバフィーコート層を慎重に回収します。各チューブから、細胞懸濁液と血漿を合わせて約20 millilitersのバフィーコートを回収してください。その後、単核細胞懸濁液をDPBSで1対1の比率で希釈し、転倒混和させた後、室温で300 times G、20分間、ブレーキと加速を最大に設定して遠心分離します。遠心分離後、上清を吸引除去し、各ペレットにBOEC generation mediumを1 milliliter加えて、ピペッティングを繰り返して細胞を再懸濁させます。すべての細胞懸濁液を一つにまとめ、残りの培地を用いて全量を10 millilitersまで調整します。総細胞数を推定するため、細胞懸濁液 10 µL を 490 µL の Turk 液で希釈し、赤血球を溶血させます。次に、希釈した細胞懸濁液の 10 µL サンプルを血球計数器を用いてカウントします。その後、細胞懸濁液をコラーゲンコート済みの T 75 フラスコ 1 本に播種します。培地量を1フラスコあたり15 millilitersまで補充し、培養します。細胞は5%CO2を含む加湿雰囲気下、37 degrees Celsiusで培養してください。その後、15 millilitersの新鮮なBOEC generation mediumを培養液に添加することで、2日ごとに培地を交換します。週末については、培地交換を3日ごとに遅らせることができます。7日目から14日目にかけてBOEC培養フラスコを観察し、アウトグロースコロニーの出現を確認します。典型的な内皮細胞のコブルストーン形態を示す円形の細胞集団をコロニーとして同定します。フラスコ内で1つまたは複数のコロニーが確認されたら、培地交換を継続し、各コロニーが約1000から2000細胞になるまで成長させます。パッケージングの前に、目視による概算でコロニーあたりの細胞数を決定します。次に、フラスコを10 millilitersのDPBSで2回洗浄して細胞を継代します。1 x tripsin EDTAを5 milliliters加え、37 degrees Celsiusのインキュベーターで5分間インキュベートします。5分後、FBSを含む培地10 millilitersを加えてトリプシンを中和し、ピペッティングを繰り返して細胞を懸濁させます。次に、懸濁液を300 times Gで5分間遠心分離します。細胞を15 millilitersの新鮮なBOEC分化培地に再懸濁し、細胞懸濁液全体をコラーゲンコーティングされていない新しいT 75フラスコに播種します。続けます。細胞がコンフルエントになるまで培地交換を行い、継代します。前述の方法に従って細胞をパッケージングプレートに播種します。低細胞密度ではBO eecsの増殖が停止する場合があるため、T 75フラスコあたり750,000個以上の細胞を使用してください。本手順では、トリプシンで細胞を剥離し、300 ×gで5分間遠心分離します。その後、上清を吸引し、細胞を10 mLの培地で再懸濁します。細胞懸濁液を10 µL分取し、手動で細胞数をカウントします。次に、サンプルを再度遠心分離し、氷冷した凍結保存液を用いて 2 × 10⁶ cells/mL の濃度で再懸濁します。各バイアルに細胞懸濁液を 0.5 mL ずつ加え、バイアルを氷冷したイソプロパノール凍結保存容器に入れます。その後、容器を -80 °C のフリーザーに少なくとも 2 時間保管し、液体窒素へ移送します。細胞を融解させるには、15 mLのコニカル遠心チューブに、あらかじめ温めておいた培地を10 mL加えます。液体窒素から細胞を取り出し、バイアル内に小さな氷晶だけが残るまで、37 °Cのウォーターバスで緩やかに撹拌しながら融解させます。その後、バイアルの内容物をコニカル遠心チューブに滴下し、300 ×gで5分間遠心分離します。続いて、上清を吸引し、細胞ペレットを再懸濁します。細胞懸濁液をT 75フラスコに加え、培地を15 millilitersまで補充します。この画像において、血管内皮様細胞の集団として現れるアウトグロース・コロニーは、石畳状の単層を形成し、中心点から放射状に増殖しています。アウトグロース・コロニーの周囲にあるのは、初期培養における細胞の大部分を占める接着性単球細胞です。パッキング後、非増殖性の単球細胞が死滅するか再付着できなくなるため、高い増殖能を持つbo Oecsが培養を支配します。こちらは、血管内皮細胞表面マーカーであるCD 1 44に対する抗体で免疫染色したBo Oecsの代表的な免疫蛍光画像です。また、こちらの画像では、血液糖タンパク質であるvon Willebrand factorに対する抗体でBo Oecsを免疫染色しています。この手法に習熟すれば、適切に実施することで2時間以内に完了させることが可能です。この手順を行う際は、採取後できるだけ早く、好ましくは2時間以内に血液サンプルを処理することが重要です。この手順に従うことで、細胞を健康状態や疾患状態における血管内皮細胞機能の研究に使用したり、分化研究、疾患モデリング、または開発後の細胞治療に使用するために、人工多能性幹細胞（iPSC）へと再プログラムしたりすることが可能です。この手法の開発により、患者の血液由来血管内皮細胞およびiPSC由来平滑筋細胞の両方において、骨形態形成タンパク質受容体タイプ2の変異が肺動脈性高血圧症の病態に及ぼす影響を研究することが可能となりました。このビデオを視聴することで、少量の末梢血から安定した血液外向性内皮細胞（blood outgrowth endothelial cells）を生成し、その特性を評価する方法について十分に理解できるはずです。未検査の人血を扱うことは極めて危険であるため、この操作を行う際は、手袋や白衣を含む個人用保護具を必ず着用してください。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

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ここで、フィーダーおよびキセノフリー状態でヒト多能性幹細胞から血原性内皮を正確に形成するプロトコルを提示する。この方法は、疾患のモデリングと治療化合物のスクリーニングに幅広い応用を持つことになります。...

フィーダーとゼノフリーの定義条件におけるヒト多能性幹細胞からの血原性内皮分化

三次元共培養スフェロイド血管新生アッセイシステムは、生理学的血管新生を模倣するように設計されている。共培養スフェロイドは、2つのヒト血管細胞前駆体、CFFCおよびMSCによって形成され、コラーゲンゲルに埋め込まれる。新しいシステムは血管新生調節器の評価に有効であり、生体内研究により関連性の高い情報を提供する。...

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ヒト多能性幹細胞からの血原性内皮細胞の指向性分化

The endothelium is a dynamic integrated structure that plays an important role in many physiological functions such as angiogenesis, hemostasis, ...

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学ぶヒト末梢血から血液伸長内皮細胞（BOEC）を生成・培養する方法。密度勾配遠心とコラーゲンコーティングを用いて、少量の血液から安定した細胞集団を確立し、血管生物学研究や心血管疾患の病態解明に活用できます。

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