ヒト末梢血からの血液伸長内皮細胞の生成と文化

このプロトコルの全体的な目標は、ヒト末梢血から血液伸長内皮細胞を確実に生成することです。この方法は、内皮細胞の機能障害が肺動脈性肺高血圧症やフォン・ヴィレブランド病などの心血管疾患にどのように寄与するかなど、血管生物学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、少量の成人末梢血から血液増殖内皮細胞の安定した集団を一貫して生成することです 手順を実証するのは、私の研究室の大学院生であるクリストファー・ワンと研究室のニコラス・モレル教授です。

この手順を開始します。ドナーごとに、2本の50ミリリットルの円錐形遠心分離管のそれぞれに3ミリリットルのクエン酸ナトリウムを追加します。次に、収集した血液を30ミリリットルずつ各チューブに加えます。

チューブを2〜3回静かに反転させて混合します。次に、60ミリリットルの血液をDPBSで希釈し、密度勾配を含むチューブを1対1の傾けます。ピペットエイドと25ミリリットルの血清ピペットを使用して、作業面に対して20度の角度で培地を遠心

培地の上に21ミリリットルの希釈した血液をゆっくりと重ねます。その後、加速器を使用して室温で35分間、Gの400倍でサンプルを遠心分離し、遠心分離中にストックを希釈することにより50マイクログラム/ミリリットルでコラーゲン溶液を修復します。0.02モル酢酸滅菌の10ミリリットル中の1つのコラーゲン。

使用前にコラーゲン懸濁液をろ過してください。次に、7.5ミリリットルのコラーゲン溶液をT 75細胞培養フラスコに加えます。フラスコを室温で1時間コーティングします。

コーティング後1時間後、コラーゲン溶液を吸引し、フラスコに10ミリリットルのDPBSをピペットで入れて、残留酢酸を洗い流します。DPBSを吸引し、もう一度洗浄を繰り返します。次に、5ミリリットルのBOEC生成培地をフラスコに加え、細胞懸濁液がめっきの準備が整うまでコラーゲンコーティングが乾燥

密度勾配遠心分離に続いて、滅菌プラスチック移送ピペットを使用してバフィーコート層を慎重に収集し、密度勾配培地の移送を避けます。バフィーコートのコレクションは、各チューブから約20ミリリットルのセル懸濁液と血漿を生成する必要があります。その後、DPBSの単核細胞懸濁液を1対1の比率で希釈し、反転して混合し、遠心分離後、ブレーキとアクセルを最大に設定して室温で300倍Gの室温で20分間遠心分離し、上清を吸引し、各ペレットに1ミリリットルのBOEC生成培地を追加し、ピペッティングを繰り返して細胞を再懸濁し、すべての細胞懸濁液を一緒に引っ張って補充します。残りの媒体で10ミリリットルまでの総容量。

総細胞数の推定値を取得するには、10マイクロリットルの細胞懸濁液を490マイクロリットルのトルコ溶液で希釈して、赤血球を溶解します。次に、ヘモサイトメーターを使用して、希釈した細胞懸濁液の10マイクロリットルのサンプルをカウントします。続いて、細胞懸濁液を単一のコラーゲン被覆T75フラスコにプレートします。

フラスコと培養物あたり最大15ミリリットルの中容量をトップにします。セルは摂氏37度で、5%CO2を含む加湿雰囲気で。今、新鮮なBOEC世代の15ミリリットルを追加することで、2日ごとに媒体を交換し、週末の文化に媒体、媒体の変更は3日ごとに遅れることができます。

7日目から14日目にBOEC培養フラスコを監視して、成長コロニーの出現を確認します。コロニーを、古典的な内皮の丸石の形態を示す細胞の円形グループとして特定します。フラスコ内でコロニーまたは複数のコロニーが同定されたら、培地の変更を続け、コロニーがコロニーあたり約1000〜2000細胞に増殖するのを待ちます。

パッケージングする前に、大まかな視覚的推定値により、コロニーあたりの細胞数を決定します。次に、フラスコを10ミリリットルのDPBSで2回すすいで細胞を継代します。5ミリリットルの1×トリップシンEDTAを加え、摂氏37度のインキュベーターで5分間インキュベートします。

5分後、FBSを含む10ミリリットルの培地でトリプシンを中和し、ピペッティングを繰り返して細胞を懸濁液にします。次に、懸濁液をGの300倍で5分間遠心分離します。細胞を15ミリリットルの新鮮なBOEC生成培地に再懸濁し、細胞懸濁液全体をコラーゲンコーティングなしの新しいT 75フラスコにプレートします。続ける。

細胞がコンフルエントになり継代するまで培地が変化します。前記セルは、前記連続包装プレートについて前述したとおりである。T 75フラスコあたり750,000個以上の細胞は、細胞密度が低いとBO eecsの増殖が停止する可能性があります。

この手順では、トリプシンが細胞を観察し、Gの300倍で5分間遠心分離します。その後、スナットを吸引し、細胞を10ミリリットルの培地に再懸濁します。細胞懸濁液の10マイクロリットルのサンプルを採取し、手動で細胞カウントを行います。

次に、サンプルを再度遠心分離し、氷冷凍結保存培地に10〜6細胞/mLの2倍で再懸濁します。各バイアルに0.5ミリリットルの細胞懸濁液を加え、氷冷したイソプロパノール凍結保存容器にバイアルを入れます。次に、容器をマイナス80°Cの冷凍庫に少なくとも2時間置いてから、液体窒素に移します。

細胞を解凍するには、15ミリリットルの円錐形遠心分離チューブに10ミリリットルの予熱培地を追加します。液体窒素から細胞を取り出し、バイアルに小さな氷の結晶だけが残るまで、摂氏37度の水浴で穏やかに攪拌しながら解凍します。次に、バイアルの内容物を円錐形の遠心分離チューブに滴下し、Gの300倍で5分間スピンダウンします。

続いて、上清を吸引し、細胞ペレットを懸濁します。細胞懸濁液をT 75フラスコに加え、培地を15ミリリットルまで補充します。この画像では、内皮様細胞の集合体として現れる成長コロニーは、丸石の単層に配置され、成長コロニーを囲む中心点から放射状に増殖します。これは、初期の培養における細胞の大部分を構成する付着性単球細胞です。

これは、内皮細胞表面マーカーCD1 44に対する抗体で染色されたBo Oecs免疫の代表的な免疫蛍光画像です。そして、この画像では、B oecsは、血中糖タンパク質von Willebrand因子に対する抗体で免疫染色されました。一度マスターすると、このテクニックは適切に実行すれば2時間未満で完了できます。

この手順を試みるときは、できるだけ早く、できれば収集から2時間以内に血液サンプルを処理することを覚えておくことが重要です。この手順に続いて、細胞は、健康および疾患における内皮細胞機能を研究するために使用され得るか、または分化研究、疾患モデリング、または細胞療法において使用するために誘導されたフルーリー強力な幹細胞に再プログラムされ得るその開発後。この技術は、患者の血液増殖内皮細胞とIPSCが気分筋細胞を誘導する両方の肺動脈性高血圧症の病因に対する2型骨形態形成タンパク質受容体の突然変異の影響を研究する道を開きました。

このビデオを見れば、少量の末梢血から安定した血液成長内皮細胞を生成し、特性評価する方法を十分に理解できるはずです。スクリーニングされていない人間の血液を扱う作業は非常に危険であり、この手順を実行するときは、手袋や白衣などの個人用保護具を常に着用する必要があることを忘れないでください。