Name: ラット精巣からのセルトリ細胞と尿細管周囲細胞の単離 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 11 s
Description: 学ぶラット精巣からセルトリ細胞と尿細管周囲細胞を単離する酵素処理法。男性生殖免疫学の研究や精子形成細胞の発達メカニズム解明に有用な実験手法です。

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著者らは、ギーセンMeinhardtラボでの一次セルトリ細胞の単離を確立する上で非常に有用だったグイド・バーホーベンとルードDeboel、ルーヴェンを、感謝したいと思います。モニカFijak、ギーセンは、図1Aとアドバイスで彼女の助けのために認められています。研究は、国際研究大学院大学JLUギーセン（ドイツ）/モナッシュ大学（メルボルン、オーストラリア）GRK 1871（SB）の助成金BH 93 / 1-1（SB）および資金調達を通じてドイツ学術協会によってサポートされていました。サポートはまた、「MännlicheInfertilitätバイInfektion＆Entzündung」（MIBIE）と呼ばれるプログラム「ランデス-攻勢ツアEn​​twicklung Wissenschaftlich-ökonomischerExzellenz」（LOEWE）内ヘッセン州の助成金から入手しました。

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著者らは、開示することは何もありません。

精細管は、尿細管周囲細胞の円形層と管腔側の基底層によって囲まれています。セルトリ細胞は基底層に停泊しており、隣接する細胞間の閉塞接合部の形成を通じて血液精巣バリアを確立し、精細上皮の組織化のための構造的枠組みを提供します。セルトリ細胞と隣接する精子形成細胞は、生殖細胞の発生を通じて親密な接触を維持し、物理的な接触とコミュニケーションを同様に提供します。したがって、セルトリ細胞がここで説明されている手順を使用して単離されると、隣接するPTCおよび精子形成細胞との親密な接触が奪われます。それにもかかわらず、それらは、時間依存的な方法であり、より低いレベルではありますが、ホルモン応答性やマーカー遺伝子の発現など、 in vivoで それらに特徴的な多くの特性を保持しているようです。 
初代セルトリ細胞は、培養6日後に大きな中性脂質液滴を発生させます。セルトリ細胞の重要な機能の1つは、変性およびアポトーシス生殖細胞、およびいわゆる残存体のような生殖細胞物質の食作用です29。細長い精子細胞からの残存体と細胞質体が単離されたセルトリ細胞に付着し、食作用を...

精巣は、すなわち 、アンドロゲンを男性の配偶子と性ホルモンを産生します。臓器は、二つの区画で構成されています。総精巣容積1の約10〜12％に相当する間質コンパートメントでは、ステロイドはライディッヒ細胞内で起こります。筒状の区画は、精巣容積1の60〜80％に相当し、生殖細胞と体細胞の2種類含まれています-細管周囲細胞とセルトリ細胞を。精巣は、それぞれ1-3高い複雑な精細管を含む、250-300小葉に結合組織隔壁によって分割されます。これらの細管は、基底膜、コラーゲンのシート、及び管周囲細胞（ 図1A）の周層によって囲まれています。 胚上皮は、基底膜の腔側に位置しています。セルトリ細胞は、内腔への基底膜からの全胚上皮にまたがる大規模な細長い細胞です。彼らは強くあるのatt基底膜に痛んだし、間質から胚上皮を吸蔵および血液精巣関門を表す基底外側組織し、タイトジャンクショ​​ンを介して連続セルラーシートを形成。セルトリ細胞は、顕著な細胞質突起及び生殖細胞の種特異的であるが、一定数との緊密な形態学的および機能的な接触に入るためにそれらを有効に波及効果を持っています。二倍体胚性幹細胞は増殖し、精原細胞に分化します。 減数分裂の間に私短命の四倍体精母細胞が減数分裂IIの間に4半数体精子細胞へのさらなる発展が生成されます。それらは細胞のネットを形成するように、すべての生殖細胞質ブリッジによって相互接続されています。精子細胞の成熟の間の主なイベントは、精子と呼ばれるプロセスにおいて、残留体を形成し、細胞質の大部分の押出成形です。残留体はセルトリ細胞によって貪食されます。後期精子細胞は、その後に放出されます管状の内腔とさらに成熟のために精巣上体へ輸送。セルトリ細胞と生殖細胞が相互に地形的および機能的に精子形成を調整するように見えます。 小さ ​​な精巣片を培養し、細胞型顕微鏡2により同定したとき、個々の精巣の細胞型の調製は、ほぼ一世紀前に始まりました。先の細いピンセットを用いて白膜を開いた後の尿細管を注意深く解剖することにより、筒状の間質コンパートメント3を分離するために、後に可能でした。 1975年にウェールズとウィーブは、間質組織と外管周囲細胞層4を除去するためのパンクレアチン処理を付着するの細管を解放するためにコラゲナーゼ処理を導入しました。早期から（古い20日前後）若い未熟ラットの精子形成がまだ始まっていないので、セルトリ細胞は、管状細胞集団の大部分を含んでいる使用されていました。この年齢ラットセルトでOLIの細胞は分裂をやめ、および隣接セル間のタイトジャンクション血液精巣関門が5確立されるように形成します。 ウェールズとウィーブDorringtonのらの独立は、トリプシンの組み合わせを導入し、同年6に出版されたsoybeenトリプシン阻害剤及びコラゲナーゼ処理が続くデオキシ。両グループは、また、約70％のセルトリ細胞を含むめっき均一な細胞懸濁液を生成するために、（それぞれ、シリンジ針またはパスツールピペットを介して繰り返し消化管状フラグメントを描く）機械的な力を用います。培養3日後に、血清を含まない培地を使用して、セルトリ細胞の割合は約90％に増加します。これは主に、生殖細胞を汚染の死に起因する可能性があります。残留管周囲細胞（のPTC）が、しかし、しっかりとそれらの細胞外マトリックスを介して結合したまま。 PTCではなく、セルトリ細胞を産生することが知られていますPTCを用いて汚染を推定するためのマーカータンパク質として働くことができるフィブロネクチン。従って、タンら。追加のヒアルロニダーゼ処理は、セルトリ細胞画分7の純度を向上させるかもしれないと推論しました。実際、それらは、さらなる処置を比較して、血清含有培地を精製したセルトリ細胞を培養するために使用される場合に特に明白となる、約20倍のPTCによる汚染を減少させることができたことを示す可能性があります。その後から桐らの改良された手順に。支配的なプロトコルとなり、広範囲のフィールド8（ 図1B）内の他の主要なグループで使用されていました。 コラゲナーゼ処理中のPTCの大部分が放出され、セルトリ細胞と平行に単離することができます。 PTCを激しく増殖し、卵胞刺激ホルモン（FSH）に応答しないのに対し、セルトリ細胞は、もはや有糸分裂を受け、特徴的な形態学的変化によってFSHに反応しませんおよびサイクリックアデノシン一リン酸（cAMP）濃度9の増加。非常に類似した酵素消化プロトコルは人10、マウス11、12、シベリアンハムスター13またはヤク14のような他の動物からの一次セルトリ細胞の単離のために使用することができます。生殖細胞を低張性ショックを汚染大量の除去のための単離手順15の端部に用いることができます。成体ラットは、16精巣からこれはまた、セルトリ細胞の効率的な単離を可能にします。濃縮されたセルトリ細胞懸濁液は、 チョウセンアサガオ朝鮮朝顔アグルチニン17で被覆されたレクチン皿上懸濁液をプレーティングすることにより生殖細胞から分離することができます。唯一のセルトリ細胞といくつかの残留のPTCは、レクチンプレートに付着します。 主にラットからの一次セ​​ルトリ細胞培養物は、ホルモンに対する応答性を調査またはマウスのセルトリ細胞リチウムのような細胞株を確立するために最初に使用されていますTM4 18ね。この細胞株は、今日まで、百以上の研究で検討されています。翻訳アプローチではセルトリ細胞は、全身性の免疫抑制19せずに長期移植片生存のための異種のまたは同種異系膵島の同時移植のように共培養細胞や組織の免疫保護のために利用されてきました。体細胞、生殖細胞（セルトリ細胞-生殖細胞）20と相互作用21 -単離されたセルトリ細胞は、上皮間葉（PTCCセルトリ細胞）を研究するため、共培養実験に使用されてきました。最近、一次セルトリ細胞は、Toll様受容体の発現と炎症性サイトカインの分泌、ならびに非病原性および尿路病原性大腸菌による感染後のサイトカインの発現をもたらすシグナル伝達カスケードを調査するために使用されています大腸菌 22。他の最近の研究は、精巣の免疫Pを研究するためのセルトリ細胞を使用していましたrivilege 23およびテストステロン前処理は、LPS誘導性の炎症応答24を抑制することを実証しました。

<table><tbody><tr><td>アクチン(平滑筋)抗体クローン1A4</td><td>Dako</td><td>M0851</td><td>モノクローナルマウス抗ヒト抗体. 免疫蛍光には1:100希釈を使用してください。</td></tr><tr><td>アルブミンウシ画分V 標準グレード、凍結乾燥</td><td>Serva</td><td>11930.04</td><td>フィルター(0.45 & micro;m)免疫蛍光法に使用されるBSA溶液。</td></tr><tr><td>コーニングセルストレーナー70&nbsp;&マイクロ;m</td><td>Corning</td><td>431751</td><td>白色</td></tr><tr><td>コラゲナーゼ A from Clostridium histolyticum</td><td>Roche</td><td>10103586001</td><td></td></tr><tr><td>DAPI mountant ProLong Gold Antifade</td><td>Life technologies</td><td>P-36931</td><td></td></tr><tr><td>D-glucose</td><td>Sigma</td><td>G8644</td><td>100 g/L</td></tr><tr><td>Dulbecco&acute;Ca2+/Mg2+</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Roche</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>電子顕微鏡</td><td>Zeiss</td><td>EM 109S</td><td></td></tr><tr><td>蛍光顕微鏡</td><td>Zeiss</td><td>Axioplan 2</td><td></td></tr><tr><td>ウシ精巣からのヒアルロニダーゼ</td><td>Sigma</td><td>H3506</td><td></td></tr><tr><td>反転光顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td>CKX41</td><td>ルーチン細胞培養顕微鏡</td></tr><tr><td>マウスIgG / IgM (H+L) polyclonal secondary 抗体&nbsp;</td><td>ライフ</td><td>テクノロジーA-10684</td>ア<td>レクサフロー488コンジュゲート</td></tr><tr><td>オイルレッドO</td><td>シグマ</td><td>O0625</td><td>は、より明るい色のためにスーダンIIIとスーダンIVに取って代わりました。</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>Σ</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン (5,000&nbsp;U/ml)/ ストレプトマイシン (5,000 &micro;g/ml)</td> <td>Gibco</td><td>15070-063</td><td>100x solution</td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Gibco</td><td>21875-034</td> ブタ膵臓由来 <td>300 mg/L L-グルタミン</td></tr><tr><td>トリプシン</td><td>Sigma</td><td>T5266</td><td></td></tr><tr><td>トリパン ブルーステイン (0.4%)</td> <td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>大豆由来トリプシン阻害剤</td><td>Sigma</td><td>T6522</td><td>シグマ製品は、以前に使用されていたロシュの BPTI(アプロチニン)よりもかなり安価です。</td></tr><tr><td>ビメンチン抗体 (V9)</td><td>Sigma</td><td>V6630</td><td>モノクローナルマウス抗ブタビメンチン抗体.&nbsp;免疫蛍光には1:100希釈を使用してください。</td></tr><tr><td>Wistar WUラットチャー</td><td>ルズリバー</td><td></td>実験<td>の日に19日齢である必要があります。</td></tr></tbody></table>

ラット精巣からのセルトリ細胞と尿細管周囲細胞の単離

Isolation of Sertoli Cells and Peritubular Cells from Rat Testes

分化した精子が最初思春期の時に表示されるので、精巣は、特に雄性配偶子に、独自の方法で免疫系に挑戦 - 十年以上全身性免疫寛容の確立後。精子形成細胞は、免疫系によって非自己として見ることができるタンパク質の数を表します。精巣は、その後、一方ではこれらのネオ抗原に対する寛容を確立することができるが、それでも一方、感染症や腫瘍の発生から自身を守ることができなければなりません。したがって、精巣は、有害な炎症性免疫応答を惹起することなく、外来抗原を容認し、体内のいくつかの免疫特権サイトの一つです。セルトリ細胞は精巣のこの免疫特権環境の維持のために重要な役割を果たし、また、外国の環境でcotransplanted細胞の生存を延長します。したがって、一次セルトリ細胞は、電子することはできません精巣の免疫特権を研究するための重要なツールですasily確立された細胞株または他の細胞モデルに置き換えられました。必要に応じて管周囲の細胞 - - ラットの精巣から一日以内にここでは、セルトリ細胞の単離のために詳細かつ包括的なプロトコルを提示します。

説明する手順では、10ラットの精巣から約12×10 7セルトリ細胞の単離を可能にします。 6〜7 6ウェルプレートは、7日目の実験のために利用可能であることをトリプシンDNアーゼI消化がセルトリ細胞の単離中に最も重要なステップになるように3×10 6細胞を6ウェルプレートにウェル当たり播種します。この時点での消化が遠く前進された場合に、生殖細胞の割合/セルトリ細胞は不均衡最後まで増加します。文化の日3-6中には、慎重にできるだけ離れ限り多くの緩く非接着または付着した生殖細胞を洗浄することが重要です。 4日間の広範囲の洗浄の代わりとして、生殖細胞は、3日目27に低張処理により除去することができる。この方法の利点は、セルトリ細胞特異的機能は、潜在的に優れているように、セルトリ細胞培養の時間は最小限に維持されることです文化の持続期間後よりも保持していました。 <p clお尻= &quot;jove_content&quot; FO：キープtogether.withinページ= &quot;1&quot;&...

一次セルトリ細胞は精巣免疫特権、炎症または感染の間シグナル伝達、およびそれらの免疫防御特性の利用を研究するために必要とされます。ここでは、高度に精製された一次セルトリ細胞およびラットの精巣から管周囲の細胞を単離するための酵素ベースのプロトコルを記述します。

The testis, and in particular the male gamete, challenges the immune system in a unique way because differentiated sperm first appear at the time of ...

この手順の全体的な目的は、ラット精巣から高度に精製された初代セルトリ細胞および管周囲細胞（PTC）を単離することです。この手法は、セルトリ細胞が精巣マクロファージにどのように影響を与えるか、あるいはセルトリ細胞においてオートファジーがどのように制御されているかなど、男性生殖免疫学分野における重要な疑問の解明に役立ちます。セルトリ細胞および管周囲細胞の回収は煩雑であり、高価な試薬を必要とします。単離した初代細胞は、細胞株と比較して、細胞培養中においても生体内の定性的な特性を大幅に保持しています。この手法の意義は男性不妊症の診断にまで及びます。なぜなら、セルトリ細胞は精子形成細胞の発達において極めて重要な役割を果たすからです。一般的に、この方法に不慣れな人は、精細管が適切に消化されたかどうかを判断することが困難であるため、苦労することがあります。本手法の視覚的なデモンストレーションは極めて重要です。なぜなら、全手順において正確な遂行を要する多くの工程が含まれているためです。小さなミスが積み重なり、失敗につながる可能性があります。まず、失血させたWistar系雄ラット10匹の腹部を70% ethanolで消毒することから始めてください。次に、動物1匹ごとに、ピンセットを用いて腹筋から皮膚を剥離し、恥骨結合から胸骨まで延びる楕円形の皮膚弁を切り出します。皮膚を胸側へ持ち上げます。その後、腹筋を把握し、恥骨結合から胸骨に向かって正中切開を行います。次に、骨盤から上方向に向かって親指で腹部を圧迫し、精巣を骨盤下部から押し出します。ピンセットを用いて精巣上体脂肪パッドを牽引し、精巣をさらに伸展させます。その後、白膜を傷つけないように注意しながら精索を切断します。精巣を50 mLコニカルチューブに入れた20 mLのPBSで回収します。すべての精巣を回収した後、同量の1%ヨウ素エタノール溶液で器官を消毒します。その後、上清を直ちにデカンテーションして除きます。精巣を25 mLのPBSで2回素早く洗浄し、その後、15 mLの新鮮なPBSが入ったペトリ皿に臓器を移します。次に、各精巣の一端をピンセットでしっかりと固定し、反対側の白膜に小さな切開を加えます。閉じたハサミの刃をスクレイピングツールとして使用し、精細管を押し出します。尿細管は依然として凝縮した精巣状の束を形成している必要があり、食塩水溶液に伸び出している尿細管はわずかであるべきです。すべての精巣の被膜を除去した後、被膜を除去した器官を 10 mL の trypsin-DNase 1 溶液を含む 100 mL のスクリューキャップボトルに移し、32 °C の振盪水槽で被膜除去後の精巣を消化させます。4 分後、尿細管の分散状態を目視で評価します。管状構造が溶液中に分散し始めたらすぐに、5 mLのTrypsin Inhibi

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

このビデオは、精巣の構成要素であるマウス精細管からのセルトリ細胞の分離手順を示しています。酵素による消化と洗浄の繰り返しにより、セルトリ細胞の溶液中への放出が促進され、セルトリ細胞をさらに培養して増殖と増殖させることができます。...

マウス精細管からの免疫制御セルトリ細胞の単離

派生して、成体マウスの精子幹細胞や前駆細胞株を維持するために簡単な方法は、ここに提示されます。この方法は、成体マウスの精巣の体細胞コンパートメント由来するフィーダー細胞を利用しています。この技術は、トランスジェニック、ノックアウトを含む一般的なマウス系統に適用可能であり、ノックインマウス。...

長期成体マウスのSSCラインの導出のために文化の精原幹細胞や前駆細胞の濃縮シリアル（SSCS）

酵素および洗剤を回避するげっ歯類の材料から精巣細胞懸濁液を機械的に調製するための新規なプロトコルは、記載されている。この方法は非常に簡単、迅速、再現性があり、フローソーティングおよびRNA抽出のために適している良質の細胞懸濁液を、レンダリングする。...

精巣細胞懸濁液の調製のためのシンプルで効率的な手法

STA-PUTメソッドは、大きさや密度に基づいて精子形成細胞の異なる集団の分離を可能にする。...

STA-PUTの速度沈降を使用して造精細胞型の分離

本発明者らは、ラット尾部精巣上体からの一次解離上皮細胞の電気的特性を測定するために、細胞分離および全細胞パッチクランプ記録を組み合わせたプロトコルを提示する。このプロトコルは、副睾丸の生理的役割をさらに解明するために、初代副睾丸上皮細胞の機能的特性の調査を可能にする。...

精巣上体から分離した一次上皮細胞の全細胞パッチクランプ記録

この尿細管スカッシュ手法の目的は、急速に細胞の完全性を維持しながらマウス精母細胞の開発の細胞機能を評価するためです。このメソッドにより、精子形成のすべての段階の調査のため、マウスの減数分裂の研究のため他の生化学的な分子の生物学的アプローチと一緒に簡単に実装することができます。...

精細管スカッシュ マウス モデルを用いた精子の細胞学的解析法

ここでは、精巣にイヌリン FITC...

マウス血液精巣関門の整合性を研究するIn Vivo法

ここでは、標準的な実験装置を用いて不連続な牛血清アルブミン密度勾配を用いて、成人マウス精巣からパチテン精子細胞、円形精子細胞、および細長い精子を濃縮するためのプロトコルを提示する。...

標準的な実験装置を用いてマウス精巣からパチテン精子細胞と精子を濃縮

ここでは、原発性新生児マウス精巣細胞から精巣オルガノイドを生成する4つの方法、すなわち、細胞外マトリックス(ECM)およびECMフリーの2Dおよび3D培養環境について説明する。これらの技術は、複数の研究アプリケーションを持っており、体外で精巣の発達と生理学を研究するために特に有用である。...

細胞外マトリックスベースおよび細胞外マトリックスフリーのマウス精巣オルガノイドの生成

ここでは、成人マウス精巣から生の大腸および後の大動脈芽細胞を分離する簡単で効率的な方法を提示する。低細胞毒性、バイオレット励起DNA結合色素および蛍光活性化細胞選別を使用して、多くの下流用途に対して非常に富んだ精子細胞集団を単離することができる。...

バイオレット励起細胞透過性DNA結合色素を用いたマウス精子細胞の分離

この記事では、精巣の虚血再灌流損傷の病理学的メカニズムの研究において、精巣捻転の再現可能なモデルを作成するための精巣虚血/再灌流のモデルを作成するための段階的な手順について説明します。...

ねじれた精巣の固定:精巣の虚血再灌流障害のラットモデル

学ぶラット精巣からセルトリ細胞と尿細管周囲細胞を単離する酵素処理法。男性生殖免疫学の研究や精子形成細胞の発達メカニズム解明に有用な実験手法です。

ラット精巣からのセルトリ細胞と尿細管周囲細胞の単離

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