の生理反応を測定しますショウジョウバエライブカルシウムイメージングを使用して脂質フェロモンの感覚ニューロン
2016年4月29日
ショウジョウバエの前脚と吻には、味覚感覚ニューロンの豊富なレパートリーが含まれています。ここでは、カルシウムイメージングを使用して、味覚フェロモンの外因性の適用による生きたハエの前脚と吻の感覚ニューロンからの生理学的応答を測定する方法を紹介します。
この手順の全体的な目標は、脂質フェロモンに対するショウジョウバエの味覚ニューロンの生理学的反応を測定することです。この手法は、オーファン味覚受容体のリガンドの同定など、感覚神経生物学における重要な質問に答えるために使用できます。この手法の主な利点は、個々の味覚ニューロンの応答を無傷の生きた動物で研究できることです。
フライに麻酔をかけた後、透明なマニキュアをごく少量垂らして0.17ミリメートルのカバースリップに取り付けます。ドロップ全体を使用して、フライの側面をスライドに取り付けます。次に、解剖顕微鏡の下で、濡れた絵筆を使用してハエの前足を伸ばします。
次に、非常に薄いテープを2枚使用して、1番目と5番目の足根骨セグメントをカバースリップに固定します。吻上のニューロンを画像化する場合は、吻の吻の上に別の薄いテープストリップを配置して、ラベルを露出させます。次に、PAPペンを使用してフライの周りに短い壁を作ります。
測定を行う前に、麻酔が30分切れるのを待ちます。このプロトコルでは、PBSTを使用して、1ミリグラム/ミリグラムのストックリガンド溶液の必要な希釈液を調製します。手順を開始するには、10マイクロリットルのPBSTを固定され露出した足根骨セグメントに重ねます。
これにより脚が湿り、ピントが合わなくなるのを防ぎます。次に、sCMOSカメラを搭載したスピニングディスク共焦点顕微鏡など、高速な時間分解能で良好な蛍光シグナルを達成できる光学系を使用してセグメントに焦点を合わせます。足根骨セグメントに関心のあるニューロンの3つの事前刺激Zスタックを収集します。
この例では、画像は 200 ミリ秒の露出と、2 秒ごとに 6 ミクロン x 半ミクロンのセクションを 2 x 2 でビニングしてキャプチャされます。レーザーの出力を最適化して、光の漂白を最小限に抑えながら、高い信号対雑音比を確保してください。ここでは、491ナノメートルの100ミリワットレーザーが30%の透過率で動作します。
シグナルは刺激前に検出可能である必要がありますが、飽和に近づくことはできません。次に、10マイクロリットルの刺激溶液を目的の足根骨セグメントにピペットで移します。ピペッティング中は、脚やフライの体に触れないように十分注意してください。
次に、最初の刺激後画像をすぐに取得し、蛍光の最大変化を記録するのに十分な画像を収集し続けます。解析には、FijiまたはImageJの画像解析および処理ソフトウェアを使用して、一連の共焦点Zスタックを開きます。各時点のすべての Z スライスの合計強度投影を行います。
ここには、6つのスライスと120のタイムポイントがあります。まず、画像の下のスタックオプションを選択し、次にZ投影オプションを選択します。開始スライスに 1 つ、ストップ スライスに 4 つ入力します。
投影タイプには、合計スライスを入力し、すべての時間枠を選択します。次に、関心領域、つまり細胞体やニューロンの投影などのROIを定義します。フリーハンド選択ツールを使用して、構造物の境界の周囲に描画します。
次に、分析ラベルをクリックし、[ツール] で [ROI マネージャー] オプションを選択します。ROIの蛍光を定量化するには、まず解析メニューで測定値の設定オプションを選択します。[統合密度]、[面積]、[平均および最大グレー値]、および [ラベル] のチェックボックスをオンにします。
次に、ROIマネージャーメニューの下にあるその他のオプションを選択し、マルチメジャーオプションを選択します。次に、時点tの蛍光の最大変化を計算します。刺激後の蛍光を定量化するには、ROIの積分密度を測定します。
t が 0 に等しい場合は、ROI の刺激前画像から刺激前蛍光を同じ方法で測定します。この t の 3 つの画像の値を平均すると、0 の値に等しくなります。バックグラウンド蛍光を定量化するには、ROIと同じサイズと形状を持つ検出可能なニューロンがない組織領域からの積分密度を測定します。
各時点に固有の背景値を収集します。GCamPカルシウムインジケーターは、2つの異なるGal4発現パターンを用いて発現しました。各パターンは、前脚ニューロンと非ニューロン支持細胞の異なる集団をラベル付けします。
どちらの発現パターンでも、親油性フェロモンCH503に対するリガンド特異的な応答が観察されました。GCamPシグナルの蛍光強度の相対的な変化は、CH503の濃度が高くなると増加しました。興味深いことに、5ナノグラムのCH503を投与すると、ニューロンの反応が抑制される可能性があります。
Gr68aニューロンとppk23ニューロンの測定された応答は異なっていました。Gr68a Gal4ドライバーで標識されたニューロンのニューロン応答は強直パターンを示したのに対し、ppk23ニューロンは脚で位相的な振動応答を示しました。吻では、ppk23ニューロンは、細胞体からの遅発性強直応答と軸索突起からの振動応答を示しました。
このビデオを見れば、脂質フェロモンやその他の疎水性リガンドに対する個々の味覚ニューロンの生理学的反応を測定する方法についてよく理解できるはずです。この技術は、化学感覚生物学の分野の研究者が、Drosophila melanogasterの個々の味覚ニューロンの応答を測定するための道を開きます。この技術を使用すると、スピニングディスク顕微鏡を温度制御されたステージ上のインキュベーターに結合することにより、温度制御されたシビレまたはTRiP a-one導入遺伝子を使用してニューロンの活動をサイレンシングまたは活性化できます。
一度習得すると、この技術は、ハエが麻酔から回復するのにかかる時間を除いて、5分で完了することができます。この方法を実行するときは、フライを前足を傷つけずにカバースリップにしっかりと固定することが重要です。イメージング中は、フェロモン溶液で前脚を刺激したらすぐに画像を取得することが重要です。
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概要
本研究では、カルシウムイメージングを用いてショウジョウバエの前脚および口器における味覚感覚ニューロンの生理学的反応を測定する方法を提示します。この手法により、生きたハエにおける味覚フェロモンに対する個々のニューロンの反応を調べることが可能になります。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 行動生物学
- 感覚神経生物学
背景
- ショウジョウバエは、多様な味覚感覚ニューロンを有しています。
- これらのニューロンを理解することは、感覚処理の研究において極めて重要です。
- カルシウムイメージングにより、ニューロン活性に関する知見を得ることができます。
- オーファン味覚受容体のリガンドを特定することが、主要な研究目標となります。
研究の目的
- 脂質フェロモンに対する味覚ニューロンの生理的反応を測定すること。
- 生体動物における味覚受容体の機能を探索すること。
- 感覚神経生物学における知見を深めること。
使用した手法
- 生きたショウジョウバエに適用されるカルシウムイメージング技術。
- イメージング中の安定化のためのハエの麻酔。
- 観察のためにハエをカバーガラスに固定する方法。
- 解剖顕微鏡を用いてハエの前脚を操作する方法。
主な結果
- フェロモンに対する味覚ニューロン応答の測定に成功した。
- 個々のニューロンの活動を、個体内でモニタリングすることが可能となった。
- 味覚受容体の機能に関する知見が得られた。
- 今後の感覚神経生物学研究に向けた手法の妥当性が検証された。
結論
- この手法により、味覚ニューロンの機能への理解が深まります。
- 受容体とリガンドの相互作用を特定するための枠組みが提供されます。
- 今後の研究において、より深い知見を得るためにこの手法を応用することが可能です。
よくある質問
産業界における重要性
生きたDrosophilaの個々の味覚ニューロン応答を測定することで、化学感覚受容体のターゲット検証が可能となり、初期創薬におけるメカニズムのリスク低減を支援します。このアプローチは、脂質フェロモンリガンドの同定に対する予測的な信頼性を提供し、オーファン受容体の解析や経路の解明に寄与します。また、疾患に関連するシステムにおいてニューロン活動と行動出力を結びつけることで、トランスレーショナルな連続性を向上させます。
バイオ医薬品研究開発における戦略的活用
初期段階の発見およびターゲット検証
- 科学的価値：リガンドへの曝露と生体内のニューロン活動を関連付けることにより、味覚受容体の機能解析を可能にする。
- 運用の価値：無傷の組織において単一ニューロンレベルの解像度を提供し、感覚経路のマッピングにおける曖昧さを低減する。
- 予測的価値：CH503などの脂質フェロモンに対する用量依存的反応を定量化することで、リード化合物の同定を支援する。
スクリーニングおよびアッセイの開発
- アッセイの準備状態： 定量的な蛍光読み取り値を生成し、リガンド濃度間での神経細胞応答の標準化された比較を可能にします。
- 再現性： 標準化された刺激およびイメージングプロトコルを使用し、定義された神経細胞集団における一貫した信号検出を保証します。
- 拡張性： 高解像度共焦点システムおよびROIベースの解析と互換性があり、多条件スクリーニングが可能です。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 疾患関連システム： 保存された感覚メカニズムの研究において検証済みのシステムであるショウジョウバエにおける化学感覚処理をモデル化しています。
- メカニズムによるリスク軽減： ニューロンの応答パターン（持続的応答 vs. 一過性応答）を明らかにすることで、標的となる行動およびリガンド特異性の判断に役立てます。
- トランスレーショナル・バイオマーカーの整合： GCaMPの蛍光変化をニューロンの活性化に関連付けることで、スクリーニングキャンペーンのためのバイオマーカー的な読み出しをサポートします。
パイプラインおよびワークフローの統合
この手法は、リード最適化の前に味覚受容体の機能的検証を提供することで、初期の創薬ワークフローに組み込まれ、仮説検証および生物学的なリスク低減を支援します。
- 探索生物学：無傷の感覚ニューロンにおける脂質フェロモンに対するリアルタイムのニューロン応答を測定することにより、仮説検証をサポートします。
- スクリーニング：標準化されたリガンド投与と、定義されたROIにおける定量的蛍光測定により、アッセイの準備を可能にします。
- 分析：統合密度測定を通じて用量反応データを生成し、刺激条件の比較を可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ：細胞種特異的な発現パターン（Gr68a, ppk23）を通じて、ニューロン活性と行動的な関連性を結びつけます。
- エンタープライズ再利用：複数の化学感覚ニューロン集団にわたる多様なリガンドをスクリーニングするための、再利用可能なプラットフォームを確立します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：個々の味覚ニューロンにおけるリガンドへの曝露とカルシウムダイナミクスの関連付けることで、メカニズム的な曖昧さを軽減します。
- 運用上の価値：標準化されたショウジョウバエの調製、刺激、およびイメージングプロトコルにより、再現性を確保します。
- 戦略的価値：探索の初期段階で受容体とリガンドの相互作用を機能的に検証することにより、go/no-go判断を改善します。
- ポートフォリオへの影響：脂質フェロモンに対するニューロンの応答性が確認されたターゲットに基づき、リスク調整後の優先順位付けを支援します。
実施上の検討事項
- Drosophilaの取り扱い、共焦点顕微鏡法、およびカルシウムイメージング解析の専門知識が必要です。
- 高速タイムラプスZスタック撮影が可能な蛍光顕微鏡インフラストラクチャに依存します。
- 刺激中の位置的なアーティファクトを避けるため、リガンドの調製および投与の標準化が必要です。
- 発現パターンによって異なるニューロン形態に合わせて、ROI選択を適応させる必要があります。
- 光退色リスクによる制限があるため、時間の経過とともに信号の完全性を維持するためのレーザー出力の最適化が必要です。
