臭気誘導挙動の高分解能定量キイロショウジョウバエ使用 Flywalkパラダイム

この行動バイオアッセイの全体的な目標は、ビネガーフライの匂い誘導行動を調査することです。Fly Walkは、嗅覚刺激に対する複数のハエの行動反応を自動的に追跡・分析するハイスループットシステムです。この新しい技術は、昆虫の嗅覚の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。

例えば、匂いの快楽的なバランスはどうなっているのか、それともこのバランスに追加の匂い物質を追加するとはどういう意味を持つのでしょうか?この実験の主な利点は、高い一時分解能で匂い誘導行動を実行できることと、昆虫が自然界で経験するものや電気生理学的記録で使用するものと同様の匂い刺激を使用することです。一般的に、この方法を使用しようとする個人は、実際には、気密システムが必要なので、空気が通過している場所を知る必要があり、空気がシステムを離れることができる場所にはまったく漏れがないことを確認する必要がありますこれらの実験では、ハエを12〜12の明るい暗いサイクルの下で飼育することが重要です。通常の食品媒体。

室温は摂氏23度から25度に保ち、相対湿度は約70%にする必要があります。大きな培養バイアルを使用して、20〜30人の成虫を1週間作成し、30〜40人の混合性の子孫のグループを収集して実験コホートを作成しました。コホートが生後2〜4日になったら、湿ったフォームプラグまたは湿ったティッシュペーパーが入った新しいバイアルに移します。

ハエをこのバイアルで24時間飢えさせます。この転送中にハエに麻酔をかけないことが重要です。このセットアップでは、250ミリリットルのボトルが多くの加湿器として機能します。

各ボトルに100ミリリットルの蒸留水を入れます。次に、各臭気物質の半ミリリットルの作業用ストックを、純粋な臭気と鉱物油の1000希釈液として調製します。同様に、ネガティブコントロールとして機能する鉱物油のみのPCRチューブを1本調製します。

次に、各臭気物質の臭気送達システムを準備します。実験で。2つのボールチェックバルブを各臭気バイアルに接続します。

臭気バイアルを正しい流れ方向に接続してください。接続を誤ると、計画された実験が損なわれるだけでなく、送達システムが汚染される可能性があります。次に、システムに漏れがないか確認します。

まず、ミキシングチャンバーの出口を密閉します。次に、刺激装置がゼロに下がる前に、すべての空気の流れを確認します。システムに漏れがある場合は、それを聞いてください。

これらは通常、重要な接続部でゴム製ガスケットを交換するか、テフロンチューブを交換することで解決できます。この手順の最初のステップでは、ガラスを割ることが懸念されるため、保護具を着用してください。15個の個々のテストフライを個々のガラス管に慎重に移します 吸引器を使用して、対応するアダプターを使用して両側のガラス管を閉じます。

次に、ロードしたガラス管をフライウォークのセットアップに接続します。すべてのチューブを取り付けたら、実験を開始する前に、ハエを少なくとも15分間新しい環境に慣れさせます。次に、光源のスイッチを入れます。

ガラス管内の温度を上昇させることなく、効率的に追跡するために十分な光を提供するようにしてください。この時点で、臭気バイアルをすべて接続して、クローズドシステムを作成する必要があります。慣れ期間は、漏れのないクローズドシステムに依存しているため、チューブを通る空気の流れはテスト期間中と同じ速度です。

コンピューターの空気の流れを確認し、デジタル流量計に接続します。システムから出るエアフローの合計は、システムに入るエアフローと等しくなければなりません。そうでない場合は、リークが存在します。

漏れはすべてのチューブの空気の流れに影響を与えますが、問題のあるチューブは通常、空気の流れの最大の減少を示すチューブです。新しい漏れが特定された場合、通常はアダプター内部でガラス管が壊れたことが原因であるか、以前の実験でアダプター内のガラスの破片が原因です。このプロセスでは、ハエがチューブに順応した後、実験を実行することができます。

原則として、これまでの任意の一連の臭気を提示することができます。最良の結果は、刺激をランダム化し、それらを少なくとも90秒離すことで得ることができます。全部で。

各臭気を500ミリ秒のパルスで40回提示します。次に、監視対象の領域を横切ってフレームをドラッグして、関心領域を設定します。15本のガラス管すべてをフレームに含めますが、チューブの端の外側の5ミリメートルは除外します。

次のステップは、追跡ソフトウェアをオフにして、スクリプトに変更を加えることです。これにより、個々のチューブを分離する14本の平行線のY軸位置が変更されます。追跡ソフトウェアが再びオンになったとき、任意の2つのラインの間には1つのフライのみが存在する必要があります。

次に、ハエがガラス管全体で確実に追跡されるように、カメラパラメータが設定されていることを確認します。ハエが関心領域の端で失われる場合は、追跡ソフトウェアの明るさまたはゲインを上げます。システムの準備が整ったので、刺激プロトコルを開始します。

ハエの位置を毎秒 20 フレームの速度で記録し、これらの座標位置を臭気バルブの状態と組み合わせてテキスト ファイルに記録します。この実験は臭いに非常に敏感であるため、ガラス管を洗浄し、洗剤に浸してから、流蒸留水で洗い流すには、定期的な洗浄が必要です。すすぎ後、チューブを加圧空気で乾燥させ、200°Cに8時間加熱します。

最初に臭気供給システムを洗浄するには、中央の混合チャンバーからすべての臭気バイアルとチューブを取り外します。次に、チューブアダプターをミキシングチャンバーから取り外します。空になったミキシングチャンバーをチューブのようなフードの下の溶剤ですすいで清掃します。

ミキシングチャンバーを加圧空気で乾燥させ、200°Cで8時間加熱します。臭気バイアルとバルブを清掃するには、スチールプラグを取り外し、ゴム製ガスケットを廃棄し、チェックバルブ、石鹸チェックバルブ、エタノール、およびエタノールとアセトンの両方の他の成分を取り外します。次に、浸した成分を最大設定で30分間超音波処理し、蒸留水で洗い流します。

以前と同様に、加圧空気を使用して乾燥させ、コンポーネントを摂氏200度に8時間加熱します。エタノールで洗い流す アセトンが気流の方向に流れたら、アセトンがゴム部品を攻撃するため、すぐに各洗浄逆止弁を加圧空気で乾燥させて、洗浄された逆止弁からすべての残留臭気を取り除きます。それらを通して数日間空気をパルスし、摂氏60度のインキュベーターに設置し、気流が1秒間隔で脈動します。

飢餓状態の15匹の雌のハエが酪酸エチルに曝露されました。黄色のバーは臭気パルスを表しています。青い四角は、100ミリ秒の時間枠内での風上の動きを示しています。

これに対応して、赤い四角は風下の動きを表しています。同じハエは、isop pentyl acetate、ethyl acetateまたは2つの3ブタンdによる刺激に応答して風上への動きも示しました。酢酸エチルに対するハエの反応は、急激に発症し、振幅が大きく、持続時間が短かった。

対照的に、2つの3ブタンディオンに対する応答は、平均発症が遅く、振幅が小さく、持続時間が長かった。最終的に、各臭気物質からのデータをこの方法で分解し、さらに分析して、4つの臭気すべてが溶媒よりも4秒以内に高い風上変位を誘発したことを示しました。さらに、臭気剤バイアルを開封することにより、ハエを同期してすべての可能な混合物に曝露した。

4つの個別の匂いでハエを刺激した後、4つの匂いをブレンドした刺激はすべて、少なくともブレンドの中で最も魅力的な単一の化合物と同じくらい魅力的でした。マスターすると、この実験を1時間以内に実行でき、その後8時間実行し、すでに30分後には最初の結果を視覚化できます。したがって、この方法では、多くのハエから短時間でデータを高い一時分解能で取得できます。

ただし、注意してください。この実験では、実験の合間に広範な清掃が必要です。もしあなたのシステムがまだ前回の実験のアリで汚染されているなら、フライウォークの結果を忘れてしまうかもしれません。

もちろん、遺伝子組み換えハエをテストすることもできます。これにより、個々の神経回路または工場の神経回路がOD誘導行動に与える影響を調査できます。この新しい技術の開発後、昆虫の脳内のこれらの匂いのコードを理解するために、昆虫の派閥という分野で研究を行う道が開かれました。そして重要なことは、フライウォークでの行動と生理学的実験に同じ種類の刺激を使用することで、これら2つの異なる実験パラダイムを実際に比較できるということです。

このビデオを見た後、フライウォークを確立する方法について良いアイデアを持っているはずであり、この実験を自分の膝で確立し、昆虫の愛情に関する独自のハイスループット実験をすぐに開始できるはずです。ただし、ガラス製品や化学薬品の取り扱いは非常に危険であるため、常に白衣を着用することを忘れないでください。ゴーグルと手袋を使用してください。